专利名称:一种新的多肽——精氨酸酶12和编码这种多肽的多核苷酸的制作方法图1是本发明精氨酸酶12在67-113共47个氨基酸和结构域精氨酸酶的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是精氨酸酶12,下方序列是结构域精氨酸酶。相同氨基酸在两个序列间用单字符氨基酸表示,相似氨基酸用“+”表示。图2为分离的精氨酸酶12的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。12kDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1精氨酸酶12的克隆用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上,转化DH5α,细菌形成cDNA文库。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer公司)测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(Genebank)进行比较,结果发现其中一个克隆2052h04的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明,2052h04克隆所含的全长cDNA为840bp(如Seq ID NO:1所示),从第44bp至385bp有一个264bp的开放阅读框架(ORF),编码一个新的蛋白质(如Seq IDNO:2所示)。我们将此克隆命名为pBS-2052h04,编码的蛋白质命名为精氨酸酶12。实施例2cDNA克隆的结构域分析将本发明的精氨酸酶12的序列及其编码的蛋白序列,用GCG中的profile scan程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul,SF et al.J.Mol.Biol.1990;215:403-10],在prosite等数据库进行结构域分析。本发明的精氨酸酶12在67-113与结构域精氨酸酶有同源,同源结果示于图1,同源率为0.21,得分为9.77;阈值为9.67。实施例3用RT-PCR方法克隆编码精氨酸酶12的基因用胎脑细胞总RNA为模板,以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA,用Qiagene的试剂盒纯化后,用下列引物进行PCR扩增Primer1: 5’-CATCCTGAGAACTGAAATTGATCGC-3’ (SEQ ID NO:3)Primer2: 5’-ATAAAATTTTTGAATTTATGTTCAA-3’ (SEQ ID NO:4)Primer1为位于SEQ ID NO:1的5’端的第1bp开始的正向序列;Primer2为SEQ ID NO:1的中的3’端反向序列。扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl,10mmol/LTris-Cl,(pH8.5),1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,10pmol引物,1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期94℃ 30sec;55℃ 30sec;72℃ 2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化,用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO:1所示的1-840bp完全相同。实施例4Northern印迹法分析精氨酸酶12基因的表达用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987,162,156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠,0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆,加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1),混合后离心。吸出水相层,加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70%乙醇洗涤,干燥并溶于水中。用20μg RNA,在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为图1所示的PCR扩增的精氨酸酶12编码区序列(44bp至385bp)。将32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜,该溶液包含50%甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后,将滤膜在1×SSC-0.1%SDS中于55℃洗30min。然后,用Phosphor Imager进行分析和定量。实施例5重组精氨酸酶12的体外表达、分离和纯化根据SEQ ID NO:1和图1所示的编码区序列,设计出一对特异性扩增引物,序列如下Primer3: 5’-CCCCATATGATGCTCTGTCACCTTCAAAGGATGG-3’ (Seq ID No:5)Primer4: 5’-CCCAAGCTTCTTCAACATGCCGCTTCTGTTCTTC-3’ (Seq ID No:6)此两段引物的5’端分别含有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点,其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列,NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点相应于表达载体质粒pET 28b(+)(Novagen公司产品,Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-2052h04质粒为模板,进行PCR反应。PCR反应条件为总体积50μl中含pBS-2052h04质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数94℃ 20s,60℃ 30s,68℃ 2min,共25个循环。用NdeⅠ和BamHⅠ分别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切,分别回收大片段,并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α,在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后,用菌落PCR方法筛选阳性克隆,并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-2052h04)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中,宿主菌BL21(pET-2052h04)在37℃培养至对数生长期,加入IPTG至终浓度1mmol/L,继续培养5小时。离心收集菌体,经超声波破菌,离心收集上清,用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析,得到了纯化的目的蛋白精氨酸酶12。经SDS-PAGE电泳,在12kDa处得到一单一的条带(图2)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析,结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO:2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。实施例6抗精氨酸酶12抗体的产生用多肽合成仪(PE公司产品)合成下述精氨酸酶12特异性的多肽NH2-Met-Leu-Cys-His-Leu-Gln-Arg-Met-Val-Ser-Glu-Gln-Cys-His-Leu-COOH(SEQ ID NO:7)。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合,方法参见Avrameas,et al.Immunochemistry,1969;6:43。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔,15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上,用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与精氨酸酶12结合。实施例7本发明的多核苷酸片段用作杂交探针的应用从本发明的多核苷酸中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针有多方面的用途,如用该探针可与不同来源的正常组织或病理组织的基因组或cDNA文库杂交以鉴定其是否含有本发明的多核苷酸序列和检出同源的多核苷酸序列,进一步还可用该探针检测本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常组织或病理组织细胞中的表达是否异常。
本实施例的目的是从本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针,并用滤膜杂交方法鉴定一些组织中是否含有本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。滤膜杂交方法包括斑点印迹法、Southern印迹法、Northern印迹法和复印方法等,它们都是将待测的多核苷酸样品固定在滤膜上后使用基本相同的步骤杂交。这些相同的步骤是固定了样品的滤膜首先用不合探针的杂交缓冲液进行预杂交,以使滤膜上样品的非特异性的结合部位被载体和合成的多聚物所饱和。然后预杂交液被含有标记探针的杂交缓冲液替换,并保温使探针与靶核酸杂交。杂交步骤之后,未杂交上的探针被一系列洗膜步骤除掉。本实施例利用较高强度的洗膜条件(如较低盐浓度和较高的温度),以使杂交背景降低且只保留特异性强的信号。本实施例选用的探针包括两类第一类探针是完全与本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互补的寡核苷酸片段;第二类探针是部分与本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互补的寡核苷酸片段。本实施例选用斑点印迹法将样品固定在滤膜上,在较高强度的的洗膜条件下,第一类探针与样品的杂交特异性最强而得以保留。一、探针的选用从本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1中选择寡核苷酸片段用作杂交探针,应遵循以下原则和需要考虑的几个方面1,探针大小优选范围为18-50个核苷酸;2, GC含量为30%-70%,超过则非特异性杂交增加;3,探针内部应无互补区域;4,符合以上条件的可作为初选探针,然后进一步作计算机序列分析,包括将该初选探针分别与其来源序列区域(即SEQ ID NO:1)和其它已知的基因组序列及其互补区进行同源性比较,若与非靶分子区域的同源性大于85%或者有超过15个连续碱基完全相同,则该初选探针一般就不应该使用;5,初选探针是否最终选定为有实际应用价值的探针还应进一步由实验确定。完成以上各方面的分析后挑选并合成以下二个探针探针1(probe1),属于第一类探针,与SEQ ID NO:1的基因片段完全同源或互补(41Nt)5’-TGGTCCCGGCTGCCGGTCGACGACCGCCCCGCGTCATGCGG-3’(SEQ ID NO:8)探针2(probe2),属于第二类探针,相当于SEQ ID NO:1的基因片段或其互补片段的替换突变序列(41Nt)5’-TGGTCCCGGCTGCCGGTCGACGACCGCCCCGCGTCATGCGG-3’(SEQ ID NO:9)与以下具体实验步骤有关的其它未列出的常用试剂及其配制方法请参考文献DNA PROBES G.H.Keller;M.M.Manak;Stockton Press,1989(USA)以及更常用的分子克隆实验手册书籍如《分子克隆实验指南》(1998年第二版)[美]萨姆布鲁克等著,科学出版社。
样品制备1,从新鲜或冰冻组织中提取DNA步骤1)将新鲜或新鲜解冻的正常肝组织放入浸在冰上并盛有磷酸盐缓冲液(PBS)的平皿中。用剪刀或手术刀将组织切成小块。操作中应保持组织湿润。2)以1000g离心切碎组织10分钟。3)用冷匀浆缓冲液(0.25mol/L蔗糖;25mmol/LTris-HCl,pH7.5;25mmol/LnaCl;25mmol/L MgCl2)悬浮沉淀(大约10ml/g)。4)在4℃用电动匀浆器以全速匀浆组织悬液,直至组织被完全破碎。5)1000g离心10分钟。6)用重悬细胞沉淀(每0.1g最初组织样品加1-5ml),再以1000g离心10分钟。7)用裂解缓冲液重悬沉淀(每0.1g最初组织样品加lml),然后接以下的苯酚抽提法。2,DNA的苯酚抽提法步骤1)用1-10ml冷PBS洗细胞,1000g离心10分钟。2)用冷细胞裂解液重悬浮沉淀的细胞(1×108细胞/ml)最少应用100ul裂解缓冲液。3)加SDS至终浓度为1%,如果在重悬细胞之前将SDS直接加入到细胞沉淀中,细胞可能会形成大的团块而难以破碎,并降低的总产率。这一点在抽提>107细胞时特别严重。4)加蛋白酶K至终浓度200ug/ml。5)50℃保温反应1小时或在37℃轻轻振摇过夜。6)用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提,在小离心机管中离心10分钟。两相应清楚分离,否则重新进行离心。7)将水相转移至新管。8)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提,离心10分钟。9)将含DNA的水相转移至新管。然后进行DNA的纯化和乙醇沉淀。3,DNA的纯化和乙醇沉淀步骤1)将1/10体积2mol/L醋酸钠和2倍体积冷100%乙醇加到DNA溶液中,混匀。在-20℃放置1小时或至过夜。2)离心10分钟。3)小心吸出或倒出乙醇。4)用70%冷乙醇500ul洗涤沉淀,离心5分钟。5)小心吸出或倒出乙醇。用500ul冷乙醇洗涤沉淀,离心5分钟。6)小心吸出或倒出乙醇,然后在吸水纸上倒置使残余乙醇流尽。空气干燥10-15分钟,以使表面乙醇挥发。注意不要使沉淀完全干燥,否则较难重新溶解。7)以小体积TE或水重悬DNA沉淀。低速涡旋振荡或用滴管吹吸,同时逐渐增加TE,混合至DNA充分溶解,每1-5×106细胞所提取的大约加1ul。
以下第8-13步骤仅用于必须除去污染时,否则可直接进行第14步骤。8)将RNA酶A加到DNA溶液中,终浓度为100ug/ml,37℃保温30分钟。9)加入SDS和蛋白酶K,终浓度分别为0.5%和100ug/ml。37℃保温30分钟。10)用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提反应液,离心10分钟。11)小心移出水相,用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)重新抽提,离心10分钟。12)小心移出水相,加1/10体积2mol/L醋酸钠和2.5体积冷乙醇,混匀置-20℃ 1小时。13)用70%乙醇及100%乙醇洗涤沉淀,空气干燥,重悬核酸,过程同第3-6步骤。14)测定A260和A280以检测DNA的纯度及产率。15)分装后存放于-20℃。样膜的制备1)取4×2张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜),用铅笔在其上轻轻标出点样位置及样号,每一探针需两张NC膜,以便在后面的实验步骤中分别用高强度条件和强度条件洗膜。
2)吸取及对照各15微升,点于样膜上,在室温中晾干。
3)置于浸润有0.1mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次),晾干置于浸润有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0),3mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次),晾干。
4)夹于干净滤纸中,以铝箔包好,60-80℃真空干燥2小时。
探针的标记1)3μlProbe(0.1OD/10μl),加入2μlKinase缓冲液,8-10uCiγ-32P-dATP+2UKinase,以补加至终体积20μl。
2)37℃保温2小时。
3)加1/5体积的溴酚蓝指示剂(BPB)。
4)过Sephadex G-50柱。
5)至有32P-Probe洗出前开始收集第一峰(可用Monitor监测)。
6)5滴/管,收集10-15管。
7)用液体闪烁仪监测同位素量8)合并第一峰的收集液后即为所需制备的32P-Probe(第二峰为游离γ-32P-dATP)。
预杂交将样膜置于塑料袋中,加入3-10mg预杂交液(10×Denhardt,s;6×SSC,0.1mg/mlCT DNA(小牛胸腺DNA)。),封好袋口后,68℃水浴摇2小时。
杂交将塑料袋剪去一角,加入制备好的探针,封好袋口后,42℃水浴摇过夜。
洗膜高强度洗膜1)取出已杂交好的样膜。
2)2×SSC,0.1%SDS中,40℃洗15分钟(2次)。
3)0.1×SSC,0.1%SDS中,40℃洗15分钟(2次)。
4)0.1×SSC,0.1%SDS中,55℃洗30分钟(2次),室温晾干。低强度洗膜1)取出已杂交好的样膜。
2)2×SSC,0.1%SDS中,37℃洗15分钟(2次)。
3)0.1×SSC,0.1%SDS中,37℃洗15分钟(2次)。
4)0.1×SSC,0.1%SDS中,40℃洗15分钟(2次),室温晾干。
X-光自显影-70℃,X-光自显影(压片时间根据杂交斑放射性强弱而定)。
实验结果采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验,以上两个探针杂交斑放射性强弱没有明显区别;而采用高强度洗膜条件所进行的杂交实验,探针1的杂交斑放射性强度明显强于另一个探针杂交斑的放射性强度。因而可用探针1定性和定量地分析本发明的多核苷酸在不同组织中的存在和差异表达。
序列表(1)一般信息(ⅱ)发明名称精氨酸酶12及其编码序列(ⅲ)序列数目9(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度840bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:1 ACGACTCGCGTAGCCGTGCGCCGATTGCCTCTCGGCCTGGGCAATGGTCCCGGCTGCCGG61 TCGACGACCGCCCCGCGTCATGCGGCTCCTCGGCTGGTGGCAAGTATTGCTGTGGGTGCT121 GGGACTTCCCGTCCGCGGCGTGGAGGTTGCAGAGGAAAGTGGTCGCTTATGGTCAGAGGA181 GCAGCCTGCTCACCCTCTCCAGGTGGGGGCTGTGTACCTGGGTGAGGAGGAGCTCCTGCA241 TGACCCGATGGGCCAGGACAGGGCAGCAGAAGAGGCCAATGCGGTGCTGGGGCTGGACAC301 CCAAGGCGATCACATGGTGATGCTGTCTGTGATTCCTGGGGAAGCTGAGGACAAAGTGAG361 TTCAGAGCCACTGCGCCTGGCCTAAACAAACTTTTTGAAAAGCTGTTTCTAAAAGATTCC421 TTAAATTCAGATATGACAGCTAATTACCTCATCATAAATTACTTTTATACTAATTGTTTC481 CAGGGTTTTAGAGTAGTTGAATGTTTATTTCACAAGGCACCCTAAATTCTATAGAAATAA541 AACCTCAGATGAGTCTCCTTCTTAGAGTGTTACAATGAATGGGAGTTTACAACTTTTATG601 TGTCATGTTTCCAACAGCTGTGTTTGGGGTGGTCACTGGCAGGAGGGGACCGTATCTCAG661 AATGGCACATTATTTCTATTTTACACATGAGCAAATTGAGGCATAGAGCGTTAGATAACT721 TGCCCAGGTTACACAGATTGTAAGTTGATGAAGCTGGGATTTGAATCTTCACATGTGTGT781 ACTTATAAATACAAATGTAAGGCAAAAAAAAAAAAAACATGTCGGCCGCCTCGGCCTATG(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
1 Met Val Pro Ala Ala Gly Arg Arg Pro Pro Arg Val Met ArgLeu16 Leu Gly Trp Trp Gln Val Leu Leu Trp Val Leu Gly Leu Pro Val31 Arg Gly Val Glu Val Ala Glu Glu Ser Gly Arg Leu Trp Ser Glu46 Glu Gln Pro Ala His Pro Leu Gln Val Gly Ala Val Tyr Leu Gly61 Glu Glu Glu Leu Leu His Asp Pro Met Gly Gln Asp Arg Ala Ala76 Glu Glu Ala Asn Ala Val Leu Gly Leu Asp Thr Gln Gly Asp His91 Met Val Met Leu Ser Val Ile Pro Gly Glu Ala Glu Asp Lys Val106 Ser Ser Glu Pro Leu Arg Leu Ala(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ACGACTCGCGTAGCCGTGCGCCGA24(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CATAGGCCGAGGCGGCCGACATGT 24(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CCCCATATGATGGTCCCGGCTGCCGGTCGACGA33(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CATGGATCCTTAGGCCAGGCGCAGTGGCTCTGA33(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met-Val-Pro-Ala-Ala-Gly-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Val-Met-Arg-Leu15(9)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度41碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TGGTCCCGGCTGCCGGTCGACGACCGCCCCGCGTCATGCGG 41(10)SEQ ID NO9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度41碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:TGGTCCCGGCTGCCGGTCGACGACCGCCCCGCGTCATGCGG 4
本发明公开了一种新的多肽——精氨酸酶12,编码此多肽的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法,如精氨酸血症、精氨酸代谢缺陷病、尿素循环的代谢缺陷病、炎症、某些肿瘤、发育紊乱症、免疫性疾病等。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这种新的精氨酸酶12的多核苷酸的用途。
2001年12月5日 申请日期2000年5月19日 优先权日2000年5月19日
一种新的多肽——精氨酸酶12和编码这种多肽的多核苷酸制作方法
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