水包油型复方两性霉素b纳米乳的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种水包油型纳米乳一以香薷提取物和两性霉素B为核心成分的复方抗菌乳。[0002]两性霉素B是从链霉菌(Streptomycesnodosus)的培养液中分离得到的一类多烯类抗真菌药，其形状如下:黄色或橙黄色粉末；无臭或几乎无臭，无味；有引湿性，在日光下易被破坏失效。两性霉素B在二甲亚砜中溶解，在二甲基甲酰胺中微溶，在甲醇中极微溶解，在水、无水乙醇、氯仿或乙醚中不溶。在中性或酸性介质中可形成盐，其水溶性增高但抗菌活性会下降。[0003]两性霉素B的结构中有一羧基和氨基，故兼有酸碱两性。两性霉素B为多烯类抗真菌抗生素，通过影响细胞膜通透性发挥抑制真菌生长的作用。临床上用于治疗严重的深部真菌引起的内脏或全身感染。多烯类抗生素主要用于深部真菌感染，此类抗生素与真菌细胞上的留醇结合，损伤膜的通透性，导致真菌内钾离子、核苷酸、氨基酸等外漏，破坏正常代谢而其抗菌作用。除支原菌外，细胞缺少甾醇的细菌不能被多烯类抗生素所作用。游离甾醇和细胞膜上的留醇竞争多烯类抗生素，而使多烯类抗生素作用减少。[0004]药效学:该品可与敏感真菌细胞膜上的留醇结合，损伤膜的通透性，导致细胞内重要物质如钾离子、核苷酸和药物最终由肾脏代谢氨基酸等外漏，从而破坏了细胞的正常代谢而抑制其生长。通常临床治疗所达到的药物浓度对真菌为抑菌作用，如药物浓度达到人体可耐受:范围的闻限时 则对真菌起杀菌作用。[0005]药动学:口服该品后自胃肠道吸收少而不稳定。成人每日口服1.6~5g，连续2天后血药浓度也仅有微量，约为0.04~0.5 μ g/ml，脑脊液中不能测到。分布容积为4L/kg。在体液(除血液外)中浓度甚低。腹水、胸水和滑膜液中药物浓度通常低于同期血药浓度的一半，支气管分泌物中药物浓度亦低。氚标记该品应用于灵长类动物试验结果显示药物组织浓度最高者为肾，其余依次递减为肝、脾、肾上腺、肺、甲状腺、心、骨骼肌、胰腺、脑和骨，脑脊液中浓度约为血药浓度的2~4%。蛋白结合率为91~95%。开始每日静脉滴注I~5mg,以后逐渐增至每日0.65mg/kg时的血药峰浓度约为2~4μ g/ml。T1/2约为24小时。在体内经肾缓慢排出，每日约有给药量的2~5%以药物的活性形式排出，7日内自尿中约排出给药量的40%，停药后药物自尿中排泄至少持续7周。在碱性尿中药物排泄增多。该品不易为透析所清除。[0006]该品适用于下列真菌感染的治疗:隐球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病，由毛霉菌、酒曲菌属、犁头霉菌属、内胞霉属和蛙粪霉属等所致的毛霉菌病，由申克孢子丝菌引起的孢子丝菌病，由烟曲菌所致的曲菌病等。由于两性霉素B的明显毒性，故该品主要用于诊断已确立的深部真菌感染(如获培养或组织学检查阳性则更佳)，且病情危重呈进行性发展者。对临床真菌感染征象不明显，仅皮肤或血清试验阳性的患者不宜选用。[0007]外用于着色真菌病，灼烧后皮肤真菌感染，呼吸道念珠菌、曲菌或隐球菌感染，真菌性角膜溃疡。[0008]香薷，唇形科、香薷属植物，能发汗解表、化湿和中、利水消肿，主治:夏月感寒饮冷，头痛发热，恶寒无汗，胸痞腹痛，呕吐腹泻，水肿，脚气。现代中草药研究表明，香薷具有如下药理作用:
(I)具有广谱抗菌和杀菌作用，并有直接抑制流感病毒的作用。
[0009](2)抗病毒作用:海州香薷水煎剂1:20浓度时对病毒ECHOll株有抑制作用。
[0010](3)抗病原微生物作用:对病原微生物有较强的抑杀作用。实验表明:香薷挥发油对流感病毒有一定的灭活能力，灭活浓度1:1000~1:2 000 ;对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、伤寒杆菌、弗氏痢疾杆菌、白喉杆菌、脑膜炎双球菌、卡他球菌，均有较强的抗菌作用，浓度1:4000~1:25600。1:2000香薷油同75%酒精在处理污水杂菌时有相近似的灭菌能力，6分钟灭菌率分别为99.2%, 99.36% ;香薷油的抑菌强度(金黄色葡萄球菌、卡他球菌、弗氏痢疾杆菌)高于碘液，但比呋喃西林及新洁尔灭为弱。香薷煎剂(1:20)在体外对亚洲甲型流感病毒、京科68-1病毒株和孤儿病毒(ECHOll)也有显著抑制作用。
[0011](4)其他作用:石香薷对机体非特异性和特异性免疫功能均有显著增强作用；对小鼠、大鼠、豚鼠和兔的离体回肠自发性收缩均有显著抑制作用，对蛋清所致豚鼠回肠过敏性收缩和氯化钡所致豚鼠回肠痉挛性收缩亦有显著抑制作用；此外，尚有利尿、镇咳和祛痰作用。海州香薷提取物在体外对血管紧张素受体和β_羟基-β_甲基戊二酸辅酶A有显著抑制作用。
[0012]香薷提取物口服后虽然能够通过胃肠道吸收，但吸收不完全，加上药物的溶出速率慢、生物利用度差，因此往往也很难起到理想的效果。


[0013]本发明的目的是为了提供一种水包油型复方两性霉素B纳米乳。
[0014]基于上述目的，本发明采取了如下技术方案:水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 1%~25%、香薷提取物1%~18%、表面活性剂15%~40%、助表面活性剂O~25%、油1%~20%、蒸馏水20%~80%。
[0015]所述纳米乳的重量百分比组成为:两性霉素B 5%~15%、香薷提取物1%~10%、表面活性剂20%~35%、助表面活性剂1%~10%、油1%~15%、蒸馏水25%~65%。
[0016]所述纳米乳的重量百分比组成为:两性霉素B 8.2%、香薷提取物6.1%、表面活性剂28%、助表面活性剂4%、油11%。
[0017]所述表面活性剂为聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH-40)、蓖麻油聚氧乙烯(40)醚(EL-40)、吐温80或泊洛沙姆188中的任意一种或与span80的混合物。这些表面活性剂对人体低毒、无刺激，安全性高。
[0018]所述助表面活性剂选自乙醇、1，2-丙二醇、聚乙二醇400和丙三醇。除了助溶作用外，助表面活性剂主要是为了调整表面活性剂的亲水亲油平衡值(HLB)使得油水界面张力进一步降低，增大界膜的油水性和刚性。助表面活性剂掺入到界面膜中，能够促进曲率半径很小的膜形成，扩大纳米乳的乳区面积。[0019]所述油选自大豆油、肉桂醛、甲酸乙酯、油酸乙酯、脂肪酸甘油脂、蓖麻油、菜籽油、亚油酸、丁酸乙酯、肉豆蘧酸异丙酯、乙酸乙酯和油酸。
[0020]所述油为大豆油。
[0021]纳米乳(nanoemuls1n)又称微乳(microemuls1n),是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等自发形成的透明或半透明的均相分散体系。一般来说，纳米乳分为三种类型，即水包油型纳米乳(0/W)、油包水型纳米乳(W/0)以及双连续型纳米乳(B.C)。纳米乳具有许多其它制剂无可比拟的优点:①为各向同性的透明液体，属热力学稳定系统，经热压灭菌或离心也不能使之分层；②工艺简单，制备过程不需特殊设备，可自发形成，纳米乳粒径一般为I~10nm 黏度低，可减少注射时的疼痛具有缓释和靶向作用；⑤提高药物的溶解度，减少药物在体内的酶解，可形成对药物的保护作用并提高胃肠道对药物的吸收，提高药物的生物利用度。 [0022]本发明的纳米乳可通过以下步骤制备:取两性霉素B、表面活性剂和助表面活性剂搅拌均匀，然后滴入香薷提取物的水溶液；初期滴加水相溶液时体系会变粘稠，随着水相溶液的逐渐增加，体系黏稠度增大；当水相溶液的量增大到一定程度后，体系由油包水变为水包油型，其黏度会突然转稀，即得到无色透明的水包油型复方两性霉素B纳米乳。本发明制得的纳米乳可制成口服液直接口服，也可进一步包封在胶囊中或制成冻干粉。
[0023]本发明所用香薷提取物为由中药香薷经煎煮、渗漉、回流、蒸馏、沉淀、静置、过滤、浓缩、干燥等步骤提取而成。香薷提取物与两性霉素B复合，两者的抗菌能力能够得到相互促进和提升，制成纳米乳使得药物的生物利用度得到改善。具体而言，本发明的技术方案具有如下优势:
(I)获得的制剂可通过口服给药:两性霉素B在水中不溶，人体对该药物的转运和吸收极其困难。将其制成纳米乳制剂，极大地提高了两性霉素B的溶解度和渗透性，口服时可经淋巴吸收，克服了首过效应和分子通过胃肠道时的屏障。
[0024](2)将两性霉素B与香薷提取物有机结合，改善了药物的抗菌效果，提高了药物的治疗能力，制剂整体的抗菌效果更稳定，效果更直接。
[0025](3)起效迅速:给药后迅速被网状内皮细胞吞噬使药物迅速起效，并维持恒定的血药浓度及药理效应，提高药物的生物利用度，药效得到增强，药物的用量和使用次数减少。
[0026](4)制得的纳米乳粒径分布较窄，体系透明、稳定性好，有较低的表面张力，具有良好的流动性，服用方便。



[0027]图1是实施例1中水包油型复方两性霉素B纳米乳的透射电镜照片；
图2是实施例1中水包油型复方两性霉素B纳米乳的粒径分布图。

[0028]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0029]实施例1
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 8.2%、香薷提取物
6.1%、表面活性剂(EL-40) 28%、助表面活性剂(乙醇)4%、油(大豆油)11%、蒸馏水42.7%。
[0030]其制备方法如下:称取6.1g香薷提取物溶解于42.7g蒸馏水中；称取8.2g两性霉素B、28g EL-40,4g乙醇在室温(25°C)条件下搅拌均匀，然后缓慢滴入溶解有香薷提取物的蒸馏水。随着蒸馏水量的增加，体系黏度增大；当加入蒸馏水的量使体系由油包水变为水包油油型纳米乳时，体系粘稠度从最粘稠的状态变稀，此时产生的即是无色透明的水包油型复方两性霉素B纳米乳。
[0031]实施例2
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 7.5%、香薷提取物6%、表面活性剂(EL-40) 26%、助表面活性剂(1，2-丙二醇)12%、油(丁酸乙酯)12%、蒸馏水36.5%ο
[0032]制备方法参照实施例1。
[0033]实施例3
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 9.5%、香薷提取物
3.5%、表面活性剂(RH-40) 25%、助表面活性剂(丙三醇)13%、油(肉桂醛)9%、蒸馏水40%。
[0034]制备方法参照实施例1。
[0035]实施例4
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 10.2%、香薷提取物4.4%、表面活性剂(RH- 40) 30%、助表面活性剂(乙醇)5%、油(脂肪酸甘油脂)10%、蒸馏水40.4%。
[0036]制备方法参照实施例1。
[0037]实施例5
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 8.7%、香薷提取物
5.8%、表面活性剂(吐温80) 20%、助表面活性剂(丙三醇)15%、油(肉豆蘧酸异丙酯)14%、蒸馏水36.5%ο
[0038]制备方法参照实施例1。
[0039]实施例6
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 9.1%、香薷提取物5.4%、表面活性剂(吐温80) 30%、助表面活性剂(PEG400) 6%、油(丁酸乙酯)15%、蒸馏水34.5%ο
[0040]制备方法参照实施例1。
[0041]实施例7
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 1%、香薷提取物18%、表面活性剂(EL-40) 15%、油(菜籽油)1%、蒸馏水65%。
[0042]制备方法参照实施例1。
[0043]实施例8
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 25%、香薷提取物1%、表面活性剂26% (span80 16%、泊洛沙姆188 10%)、助表面活性剂(丙三醇)1%、油(蓖麻油)15%、蒸馏水32%。
[0044]制备方法参照实施例1。
[0045]实施例9水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 5%、香薷提取物1%、表面活性剂(RH-40) 40%、助表面活性剂(乙醇)22%、油(乙酸乙酯)7%、蒸馏水25%。
[0046]制备方法参照实施例1。
[0047]实施例10
水包油型复方两性霉素B纳米乳，其重量百分比组成为:两性霉素B 15%、香薷提取物4%、表面活性剂(EL-40) 20%、助表面活性剂(I, 2-丙二醇)5%、油(油酸)20%、蒸馏水36%。
[0048]制备方法参照实施例1。
[0049]实施例11:试验 (一)粒径分析
在透射电子显微镜下对实施例1-10的纳米乳产品进行观察，发现液滴呈类球形，分散性好，无粘连。图1是实施例1水包油型复方两性霉素B纳米乳的透射电镜照片。对实施例I的纳米乳利用马尔文粒度分析仪进行检测，检测结果如图2所示，从图中可以看出，乳液粒径分布在67.3~101.9nm之间，平均粒径为79.3nm。
[0050](二)稳定性分析
取实施例1-10的纳米乳产品分别进行高速离心试验、光稳定性试验、温度稳定性试验等，观察本发明的复方两性霉素B纳米乳的稳定性，确认是否有分层、浑浊或晶体析出等不稳定现象出现。
[0051](三)高速离心试验
取样品装入离心管中，以15000 r/min的转速离心10 min。离心后对样品进行观察,发现各实施例样品在离心后依然能够保持离心前的澄清透明状态，未出现分层、浑浊或晶体析出等现象。
[0052](四)光稳定性试验
取各实施例样品装入无色透明的小玻璃瓶中，密封，放置于正常光照条件下10d，分别于ld、2d、4d、6d、8d、10d取样观察。结果表明，在1d观察期内，各实施例样品均保持澄清透明状态，未见分层、浑浊或晶体析出等不稳定现象。
[0053](五)温度稳定性试验
取各实施例样品，每各实施例分三份，装入无色透明的玻璃瓶中，密封。将各分样品分别放置于4°C、室温(25°C)和40°C环境中留样考察30d，每隔5d取样观察。结果表明，在30d观察期内，实施例1-10的复方两性霉素B纳米乳在三种温度条件下均保持澄清透明，未见分层、浑浊或晶体析出等不稳定现象。
[0054](六)长期稳定性试验
将3批纳米乳密封于棕色玻璃瓶内，置于(25±2)°C、相对湿度(60±5)%条件下12个月，分别于0、3、6、9和12个月时取样，考察纳米乳的性状及含量变化，并参考文献统计分析方法，计算复方两性霉素B纳米乳抑菌药物的有效期。试验结果表明在长期试验条件下，复方两性霉素B纳米乳抑菌药物的外观一直保持澄明、均一，未见分层、色变、絮凝和破乳等现象；体系中的两性霉素B和大黄提取物含量随时间延长而逐渐降低，其含量一时间变化曲线提供的线性回归方程，计算出复方两性霉素B纳米乳抑菌药物的有效期为33.35个月(以时间短者为标准)。
[0055](七)毒性试验以市售香薷提取物片剂为对比药剂，按照新药非临床安全性评价方法进行急性毒性试验:重复给药毒性试验、遗传毒性试验(包括Ames试验、小鼠骨髓微核试验、体外培养哺乳动物细胞染色体突变试验)、生殖毒性试验(一般生殖毒性试验、致畸敏感期毒性试验、围产期毒性试验)、致癌试验、免疫毒性试验和局部刺激性试验，试验结果如下:
本品对小鼠急性毒性实验结论:与市售香薷提取物片剂对比，复方两性霉素B纳米乳未出现计量内不良反应及死亡。
[0056]本发明产品的Ames试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验等遗传毒性试验的结果均为阴性。
[0057]大鼠30d喂养本发明产品的结果表明:与市售香薷提取物片剂对比，在试验期内，复方两性霉素B纳米乳计量内各实验组动物生长发育良好，体重、摄食量、血常规、血生化、脏器系数等指标均在正常范围内，病理组织学检查亦未见异常。
[0058]本品长期毒性实验 结论:与市售香薷提取物片剂对比，在试验期内，复方两性霉素B纳米乳计量内，本药品在连续灌胃给药三个月未见大鼠不良反应，各项检查指标均在正常范围内，病理检查其主要脏器及靶器官均未见该药引起的中毒性病理改变。