专利名称：一种种子液的制备方法和乙醇的制备方法在酒精发酵生产行业中，在酵母的培养过程中，杂菌的控制尤为重要。目前，主要的控制措施是在培养过程中定期加入抑菌剂(即，在将培养基与酵母菌混合后，每隔2个小时向混合得到的混合物中加一次杀菌剂)，以控制杂菌的繁殖，但是控制效果不甚理想。原因在于，从长期生产运行来说，即使在初始培养阶段抑菌剂的加入能够在一定程度上抑制杂菌的生长，但是，培养后期杂菌的耐药性会逐渐提高，因而需要进一步提高抑菌剂的用量，这不但会造出生产成本的增加，而且抑菌效果仍然不够理想。发明内容本发明的目的是提供一种能够有效抑制杂菌生长繁殖从而能够达到优化发酵效果的种子液的制备方法以及一种乙醇的制备方法。为了实现上述目的，本发明提供了一种种子液的制备方法，该方法包括将酵母菌进行扩大培养，其中，所述将酵母菌进行扩大培养的方法包括:将培养基以连续流加的方式与酵母菌在种子罐中混合、培养，并将扩大培养后得到的种子液从所述种子罐中连续引出；在扩大培养过程中加入杀菌剂，所述杀菌剂的加入方式和加入量使整个扩大培养过程中的杂菌数量在1000倍的显微镜下观察不大于2个/视野。本发明还提供了一种乙醇的制备方法，该方法包括将淀粉质原料粉碎，并将粉碎产物与酶混合、酶解，得到酶解产物，将种子液接种到所述酶解产物中，发酵得到的酶解产物，其中，采用本发明所述的方法制备种子液。本发明的方 法能够全程控制种子液制备过程中的杂菌数量，使整个扩大培养过程中，所述杀菌剂的加入方式和加入量使整个扩大培养过程中的杂菌数量在1000倍的光学显微镜下观察不大于2个/视野。按照本发明的一种优选的实施方式，相邻两次种子液的制备过程中所使用的杀菌剂不同，如，第一次种子液的制备过程中将酵母菌进行扩大培养时加入的杀菌剂均采用青霉素，待酵母菌的活力下降或者衰亡后，再次在种子罐中重新进行种子液的制备时，杀菌剂均采用安菌泰，这样交替使用杀菌剂能够进一步防止种子液的制备过程中的杂菌产生抗药性，从而有效防止后续的乙醇发酵生产系统中杂菌的感染。本发明的方法能够保证制得的种子液的挥发酸控制在0.05以内，从而优化了种子液的质量，因此，能够使乙醇发酵制备过程的升酸差降低，从而提高乙醇产率。本发明的其他特征和优点将在随后的部分予以详细说明。
以下对本发明的
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
按照本发明，所述种子液的制备方法包括将酵母菌进行扩大培养，其中，所述将酵母菌进行扩大培养的方法包括:将培养基以连续流加的方式与酵母菌在种子罐中混合、培养，并将扩大培养后得到的种子液从所述种子罐中连续引出；在扩大培养过程中加入杀菌齐U，所述杀菌剂的加入方式和加入量使整个扩大培养过程中的杂菌数量在1000倍的显微镜下观察不大于2个/视野。
按照本发明，所述显微镜可以为本领域常规使用的各种显微镜，如光学显微镜。所述计数方法可以为本领域常规的计数方法，如利用血球计数板计数。
按照本发明，优选情况下，在扩大培养过程中加入杀菌剂在pH值为3.6-3.8的条件下进行，能够更加有 益于杂菌数量的控制。其中，所述调节PH值的方法可以采用本领域技术人员公知的方法进行。
按照本发明，所述杀菌剂的加入方式和加入量只要满足使整个扩大培养过程中的杂菌数量在1000倍的光学显微镜下观察不大于2个/视野即可。因此，对于杀菌剂的加入方式和加入量可以进行适当的调节和控制。例如，所述杀菌剂可以分批加入的方式加入，也可以连续的方式加入。
按照本发明的一种优选的实施方式，所述杀菌剂以分批加入的方式加入，在开始向种子罐中流加培养基时，即在开始扩大培养的启动阶段，向种子罐中加入第一批杀菌剂；流加的培养基的量达到种子罐体积的40-60%时，向种子罐中加入第二批杀菌剂；流加的培养基的量达到种子罐的出料的液位时，向种子罐中加入第三批杀菌剂；待在开始将扩大培养后得到的种子液连续稳定引出后，即达到稳定的连续引入、连续引出的状态之后，继续向种子罐中分批加入第四批杀菌剂。
其中，第一批杀菌剂的加入量、第二批杀菌剂的加入量以及第三批杀菌剂的加入量可以在向种子罐中流加培养基至种子罐液位过程中进行适当控制，因此，第一批杀菌剂的加入量、第二批杀菌剂的加入量以及第三批杀菌剂的加入量的可选择范围较宽，优选情况下，本发明的发明人发现，第一批杀菌剂的加入量为前三批杀菌剂加入量的总量的10-30重量％，第二批杀菌剂的加入量为前三批杀菌剂加入量的总量的40-60重量％，第三批杀菌剂的加入量为前三批杀菌剂加入量的总量的20-40重量％，可以更利于杂菌数量的稳定控制，从而保证扩大培养后得到的酵母菌的质量。其中，所述每批杀菌剂的加入量使得种子罐中杀菌剂的浓度优选为3-6克/立方米种子液。
按照本发明，在开始将扩大培养后得到的种子液连续引出后，即达到稳定的连续引入、连续引出的状态之后，向种子罐中分批加入第四批杀菌剂是为了能够更好地控制种子罐中的扩大培养后的种子液的杂菌数量。即，只要满足种子液中的杂菌数量在1000倍的显微镜下观察不大于2个/视野。通常情况下，在分批加入第四批杀菌剂时，在加入每批杀菌剂之间还包括时间间隔。所述时间间隔可以根据所述第四批杀菌剂的半衰期来确定，例如，所述杀菌剂的半裳期为3小时，则可以每间隔3小时左右加入一次杀菌剂(可以在杀菌剂的半衰期的时间为基准，上下浮动10%的时间范围内作为间隔时间)。在分批加入所述第四批杀菌剂时，每批杀菌剂的加入量和分批的次数没有特别限定，可以根据种子液中的杂菌数量以及杀菌剂的半衰期进行适当选择。其中，所述杀菌剂的半衰期是指杀菌剂的杀菌效果减少至原来的一半所需用的时间。同样，达到稳定的连续引入、连续引出的状态之后，每批杀菌剂的加入量使得种子罐中杀菌剂的浓度优选为3-6克/立方米种子液。
按照本发明的另一种优选的实施方式，在将培养得到的种子液连续引出之前和/或之后，例如，在将培养得到的种子液连续引出之前，所述杀菌剂以连续加入的方式加入，所述杀菌剂的加入量只要保证整个扩大培养过程中的杂菌数量在1000倍的光学显微镜下观察不大于2个/视野即可，优选，所述杀菌剂的加入量使得种子罐中杀菌剂的浓度为3-6克/立方米种子液。因此，对于杀菌剂的加入量可以进行适当的调节和控制。在将培养得到的种子液连续引出之后，同样可以按照如上所述的方式向种子罐中分批加入杀菌剂，在加入每批杀菌剂之间的时间间隔可以根据所述杀菌剂的半衰期来确定；也可以继续连续加入的方式加入杀菌剂；并优选，所述杀菌剂的加入量使得种子罐中杀菌剂的浓度为3-6克/立方米种子液。
按照本发明，所述杀菌剂可以为本领域技术人员所公知的用于酵母菌的扩大培养过程中常规使用的杀菌剂，例如，可以为青霉素和/或安菌泰。且优选情况下，以分批方式加入的每批杀菌剂的种类相同。
按照本发明，为了能够进一步防止杂菌产生抗药性，从而有效防止后续的乙醇发酵生产系统中杂菌的感染，相邻两次种子液的制备过程中所使用的杀菌剂不同。
如上所述，本发明的改进在于:在种子液的制备过程中通过加入杀菌剂而使整个扩大培养过程中的杂菌数量在1000倍的光学显微镜下观察不大于2个/视野。因此，对于所述培养基的组成、培养基的加入量、培养条件以及酵母菌的种类、酵母菌的加入量均没有特别限定。
按照本发明，所述培养基的流加量以及酵母菌的加入量优选使得到的扩大培养后的种子液中酵母菌的数量为3-4亿个/毫升种子液；所述培养的条件通常包括培养温度、培养时间和通气量，所述培养温度通常为25-35°C，所述通气量通常为0.3-0.6立方米空气:立方米种子液.分钟，术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养基(种子液)的空气体积比来表示(ν/ν.π η)，例如通气比为1: 0.1-1，简称通气量为0.01-1体积:体积.分钟。所述培养时间可以根据种子罐的大小以及培养基的流加量确定，只有优选满足使得到的扩大培养后的种子液中酵母菌的数量为3-4亿个/毫升种子液即可(所述培养时间指从开始流加培养基至将扩大培养后的种子液开始引出时所需用的时间，通常，按照本发明，所述培养时间为10-15小时)。
按照本发明，所述培养基可以为淀粉质原料的酶解产物，所述淀粉质原料的酶解产物可以按照本领域技术人 员公知的方法制备得到，优选情况下，所述培养基的流加速度为45-60立方米/小时。
本发明的方法适合用于各种利用酵母菌进行的扩大培养，因此，按照本发明，所述酵母菌可以为各种酵母菌，例如，在发酵制备酒精中，所述酵母菌通常为酒精酵母，所述发酵用酵母菌可以商购得到。
按照本发明，为了使酵母菌，特别是干酵母菌恢复活性，该方法还包括:在向种子罐中连续流加培养基与酵母菌混合、培养之前，将酵母菌进行活化。其中，所述将酵母菌的活化方法可以采用本领域技术人员公知的各种活化方法，例如，在30-38°C下，将酵母菌与培养基或水混合。
本发明提供的乙醇的制备方法中，除了种子液的制备为采用本发明提供的方法制备得到的之外，对所述制备乙醇的方法中，将淀粉质原料粉碎、酶解，并发酵酶解产物得到乙醇的步骤中的条件和方法均可以采用本领域技术人员公知的方法进行，例如，所述淀粉质原料可以为玉米、薯类原料等，其中，所述薯类原料可以为各种薯类原料，如红薯、马铃薯、木薯等。将薯类原料进行粉碎后得到的粉碎产物中，薯类原料的平均颗粒直径可以为I毫米至小于2.5毫米。所述酶解使用的酶通常为淀粉酶，所述淀粉酶为^-淀粉酶、0-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶中的一种或几种。以每克粉碎产物的干重计，所述淀粉酶的用量为4-50酶活力单位；所述酶解的温度可以为50-90°C，所述酶解的时间可以为20-240分钟，所述酶解的PH值可以为5-7 ;所述酶的酶活力单位的定义为:在pH值为6.0、温度为70°C的条件下，I分钟将I毫克淀粉转化为葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。以每克酶解产物计，所述发酵所使用的酵母菌的接种量优选为1-2亿个菌，所述发酵的温度可以为30-36°C，发酵的时间可以为50-75小时。所述菌的个数的定义为将稀释后的一定量的发酵液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在培养基平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。即每毫升发酵液中含有的单细胞的数目。可以用血球计数板计数活菌的数目。
以上细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上 述
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，培养基的制备方法为:使用SFSP系列锤片式粉碎机将木薯片(含水量为14重量％ )进行粉碎，得到100千克粉碎产物(该粉碎产物中木薯原料的平均颗粒直径为I毫米)。将所述粉碎产物与170千克水混合，调节pH值至5.2，加热至70°C后，以每克粉碎产物的干重计，加入20酶活力单位的α -淀粉酶(诺维信公司购得)，先在60°C下加入α-淀粉酶总量的1/3的酶保温酶解20分钟，再在85°C下加入α _淀粉酶总量的2/3的酶保温酶解40分钟后得到酶解产物。
以下实施例和对比例中，所述种子液制备所用的酵母为酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)。所述活性干酵母的活化方法为:在35°C下，将100千克所述干酵母与10立方米水混合，得到酵母活化液(所述酵母活化液中活菌数目为80%以上)。所述酵母计数方法可以采用本领域技术人员公知的方法，例如:将I克干酵母粉溶于10毫升无菌水中，或将I毫升菌种活化液用无菌水稀释至10毫升，加入0.5毫升0.1重量％亚甲基蓝，在35°C下保温30分钟。在10倍光学显微镜下，用血球计数板计数保温后的溶液中活菌的数目(死菌染色，活菌不染色)，可得I克干酵母或I毫升菌种活化液中活菌的数目。
以下实施例和对比例中，杂菌数量的检测方法:在培养过程中随即取样，并先将取样的种子液过滤，除去杂质，然后利用光学显微镜，在放大1000培的条件下观察并计数种子液中的杂菌数量。所述挥发酸的测定方法为本领域技术人员所公知，例如:采用氢氧化钠水溶液(0.lmol/L)滴定法，并记录氢氧化钠水溶液的用量。采用美国PPS公司的AccuSizer TM 780光学粒径检测仪测定粉碎产物的颗粒直径。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的种子液的制备方法。
将培养基以45立方米/小时的流加速度连续流加到种子罐中与所述酵母活化液混合(相对于每千克酵母活化液，培养基的加入量为3立方米)，并在25°C、通气量为0.5立方米空气:立方米种子液.分钟下进行培养，并将扩大培养后得到的混合物从所述种子罐中连续引出；在开始向种子罐中流加培养基时，在pH值为3.6的条件下，向种子罐中加入第一批青霉素杀菌剂；流加的培养基的量达到种子罐体积的40%时，向种子罐中加入第二批青霉素杀菌剂；流加的培养基的量达到种子罐的出料的液位时，向种子罐中加入第三批青霉素杀菌剂(第一批杀菌剂为前三批杀菌剂总重量的20重量％，第二批杀菌剂为前三批杀菌剂总重量的50重量％，第三批杀菌剂为前三批杀菌剂总重量的30重量％，前三批杀菌剂的用量使得种子罐中杀菌剂的浓度为3-6克/立方米种子液)；在开始将扩大培养后的混合物连续引出后，即达到稳定的连续引入和连续引出状态后，向种子罐中分批加入第四批青霉素杀菌剂(每间隔3小时加入一次，每批杀菌剂的用量使得种子罐中杀菌剂的浓度维持在6克/立方米种子液)；所述杀菌剂的加入量使得整个培养过程中种子罐中的杂菌数量为I个/视野。培养10小时后，由种子罐引出的培养后得到的种子液中酵母菌的数量为3.3亿个/毫升种子液。测定得到，所述种子液的挥发酸为0.04 (氢氧化钠水溶液的用量为0.04晕升)。
对比例I
本对比例用于说明 现有技术的种子液的制备方法。
将与实施例1相同量的培养基与相同量的酵母活化液混合，并每间隔2小时向所述混合液中加入一次青霉素杀菌剂，在25°C、通气量为0.5立方米空气:立方米种子液 分钟下进行培养10小时，得到扩大培养后的种子液，种子液中酵母菌的数量为3.1亿个/毫升种子液。整个培养过程中种子罐中的杂菌数量为6个/视野左右。测定得到，所述种子液的挥发酸为0.06 (氢氧化钠水溶液的用量为0.06毫升)。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的种子液的制备方法。
将培养基以60立方米/小时的流加速度连续流加到种子罐中与所述酵母活化液混合(相对于每千克酵母活化液，培养基的加入量为3立方米)，并在25°C、通气量为0.6立方米空气:立方米种子液.分钟下进行培养，并将扩大培养后得到的混合物从所述种子罐中连续引出；在开始向种子罐中流加培养基时，在pH值为3.8的条件下，向种子罐中加入第一批青霉素杀菌剂；流加的培养基的量达到种子罐体积的40%时，向种子罐中加入第二批青霉素杀菌剂；流加的培养基的量达到种子罐的出料的液位时，向种子罐中加入第三批青霉素杀菌剂(第一批杀菌剂为前三批杀菌剂总重量的15重量％，第二批杀菌剂为前三批杀菌剂总重量的60重量％，第三批杀菌剂为前三批杀菌剂总重量的25重量％，前三批杀菌剂的用量使得种子罐中杀菌剂的浓度为3-5克/立方米种子液)；在开始将扩大培养后的混合物连续引出后，即达到稳定的连续引入和连续引出状态后，向种子罐中分批加入第四批青霉素杀菌剂(每间隔3小时加入一次，每批杀菌剂的用量使得种子罐中杀菌剂的浓度维持在4克/立方米种子液)；所述杀菌剂的加入量使得整个培养过程中种子罐中的杂菌数量为1-2个/视野。培养10小时后，由种子罐引出的培养后得到的种子液中酵母菌的数量为3.25亿个/毫升种子液。测定得到，所述种子液的挥发酸为0.05 (氢氧化钠水溶液的用量为0.05晕升)。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的种子液的制备方法。
将培养基以60立方米/小时的流加速度连续流加到种子罐中与所述酵母活化液混合(相对于每千克酵母活化液，培养基的加入量为3立方米)，并在28°C、通气量为0.4立方米空气:立方米种子液.分钟下进行培养，并将扩大培养后得到的混合物从所述种子iil中连续引出；在开始向种子中流加培养基时，在pH值为3.7的条件下，向种子iiS中连续加入安菌泰杀菌剂(购自东海紫英生物科技有限公司)(所述杀菌剂的加入量使得杀菌剂的浓度为5克/立方米种子液)；在开始将扩大培养后的混合物连续引出后，即达到稳定的连续引入和连续引出状态后，继续向种子罐中连续加入安菌泰杀菌剂(所述杀菌剂的加入量使得杀菌剂的浓度维持在5克/立方米种子液)；所述杀菌剂的加入量使得整个培养过程中种子罐中的杂菌数量为1-2个/视野。培养10小时后，由种子罐引出的培养后得到的种子液中酵母菌的数量为3.25亿个/毫升种子液。测定得到，所述种子液的挥发酸为0.05 (氢氧化钠水溶液的用量为0.05毫升)。
应用例I
本应用例用于说明乙醇的制备。
(I)木薯原料的粉碎
使用SFSP系列锤片式粉碎机将木薯片(含水量为14重量％ )进行粉碎，得到100千克粉碎产物(该粉碎产物中木薯原料的平均颗粒直径为I毫米)。
(2)酶解
将步骤(I)的粉碎产物与170千克水混合，调节pH值至5.2，加热至70°C后，以每克粉碎产物的干重计，加入20酶活力单位的α -淀粉酶(诺维信公司购得)，先在60°C下加入α -淀粉酶总量的1/3的酶保温酶解20分钟，再在85°C下加入α -淀粉酶总量的2/3的酶保温酶解40分钟后得到酶解产物。`
(3)发酵
使酶解产物的温度降至33°C，接种实施例1得到的种子液，接种量为步骤(2)所得酶解产物和待接种种子液的总重量的30重量％ (以每克酶解产物计，接种量约1.3亿个菌的酒精酵母)，所得混合物在33°C下于发酵罐中搅拌培养72小时，在100°C蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3°C下二次蒸馏可得乙醇35.55千克。
对比应用例I
本对比应用例用于说明乙醇的制备方法。
按照应用例I的方法制备乙醇，不同的是，接种的种子液为由对比例I的方法制备得到，得到乙醇34.25千克。
由上述结果可以看出，采用本发明的方法使制备种子液的整个过程中能够有效控制种子液中杂菌数量不大于2个/视野，因而，得到的种子液的挥发酸在0.05以内，所述挥发酸是体现种子液中杂菌控制的指标，挥发酸越低说明杂菌的控制效果越理想。而采用现有技术的方法制备得到的种子液中的杂菌数量较多，为6个/视野，因此，得到的种子液的挥发酸浓度较高 (挥发酸大于0.05)。由此说明，采用本发明的方法能够制得质量更好的种子液，且将本发明制得的种子液用于后续的乙醇生产体系中后，体系升酸差明显降低，因此，乙醇产率明显提高。


本发明提供了一种种子液的制备方法以及一种乙醇的制备方法，该方法包括将酵母菌进行扩大培养，其中，所述将酵母菌进行扩大培养的方法包括将培养基以连续流加的方式与酵母菌在种子罐中混合、培养，并将扩大培养后得到的种子液从所述种子罐中连续引出；在扩大培养过程中加入杀菌剂，所述杀菌剂的加入方式和加入量使整个扩大培养过程中的杂菌数量在1000倍的显微镜下观察不大于2个/视野。本发明的方法能够保证制得的种子液的挥发酸控制在0.05以内，从而优化了种子液的质量，因此，能够在后续的乙醇发酵制备过程中降低升酸差，从而提高乙醇产率。