专利名称：茶饮料的制造方法以及茶饮料的制作方法 绿茶、乌龙茶等茶叶原料中含有各种香气成分，制造过程中这些香气成分被提取出来，根据茶叶原料和加工处理方法，可获得具有特殊风味的茶饮料。已知茶的香气成分中， 牛儿醇、芳樟醇等主要为醇系的香气成分以母体二糖苷的形式存在于茶叶中(应用糖质科学(J.Appl.Glycosci，)第45卷第2号123-129页(1998))。另一方面，已经证实茶叶中存在作用于这些二糖苷，使香气成分游离出来的酶-β-樱草苷酶，并推断在茶的制造工序中已创造出这些酶发生作用的环境，这对于茶特有风味的形成有重要的作用。对于来源于茶叶的β-樱草苷酶的提取、纯化方法以及理化性质已有报道(日本特开平8-1460675)。
正如现今潮流所见，消费者对茶饮料的需求高，特别是希望提供香气丰富、高品质的茶饮料。因此，在茶饮料的制造过程中，可以尝试通过另行添加来源于上述茶叶的β-樱草苷酶，来使香气成份从存在于茶叶中的香气成分母体中游离出来，以改善茶饮料的风味。但是，来源于茶叶的β-樱草苷酶可作用的底物的范围狭窄，即使另行添加该酶，也只能作用于一部分香气成分母体，无法有效或高效地改善香气。另外，在茶饮料的制造过程中，原本存在于茶叶原料中的β-樱草苷酶发生作用，即使再添加来源于茶叶的β-樱草苷酶，并使其发生作用，也无法期望高效地带出香气成分。例如，在红茶的制造中，并不经过可使该酶失活的热处理工序，而进行萎凋、揉捻、发酵、干燥这样一系列的工序。因此，由于在制造过程中存在该酶可充分发挥作用的环境，即使再添加来源于茶叶的同类酶，也几乎无法期待使风味得到改善。另一方面，为了制备来源于茶叶的β-樱草苷酶，需要以生茶叶为起始原料，进行粉碎步骤、各种提取步骤、纯化步骤等，因此，由于制备步骤繁杂，自然难以大量制备。另外由于起始原料生茶叶的种类不同，所含酶量、酶活性等也不同，因此难以稳定提供品质均一的酶。本发明鉴于上述问题而产生，其目的在于提供风味得到进一步改善的茶饮料的制造方法。特别是提供可带出来源于茶叶的β-樱草苷酶所不能带出的香气成分，从而制造具有优良风味的茶饮料的方法。其目的还在于提供生产性良好、且以稳定的品质制造风味得到改善的茶饮料的方法。进一步提供可应用于上述茶饮料制造的茶饮料用茶叶。在上述目的下，本发明人进行了深入的研究。结果得知在茶饮料的制造工序中，通过添加来源于微生物的二糖苷酶(ジグリコシダ一ゼ)并使其作用，可以高效地带出茶的香气成分，制造风味极佳的茶饮料。本发明基于上述认识而成，其内容如下。
茶饮料的制造方法，该方法包括使来源于微生物的二糖苷酶发生作用的酶处理步骤。
[1]的制造方法，其中上述酶处理步骤包括将来源于微生物的二糖苷酶添加到茶饮料用茶叶的部分制造工序中。
[2]的制造方法，其中上述部分制造工序为选自粗揉工序、揉捻工序、中揉工序和精揉工序中的一个或多个工序。
[1]的制造方法，其中上述酶处理步骤包括在由茶饮料用茶叶提取茶时、或向提取的茶中，添加来源于微生物的二糖苷酶，进行酶促反应。
茶饮料的制造方法，其特征在于在揉捻工序中添加来源于微生物的二糖苷酶。
[1]-[5]中任一项的制造方法，其中上述二糖苷酶来源于多色青霉(Penicillium multicolor)。
[1]-[5]中任一项的制造方法，其中上述二糖苷酶来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。
[1]-[7]中任一项的茶饮料的制造方法，其中上述茶饮料为不发酵茶、半发酵茶、全发酵茶、后发酵茶或上述二种或两种以上的混合茶。
由[1]-[8]中任一项的制造方法所制造的茶饮料。
茶饮料，该茶饮料因来源于微生物的二糖苷酶的作用而使风味得到改善。
茶饮料用茶叶的制造方法，该方法包括使来源于微生物的二糖苷酶作用于茶叶的酶处理步骤。
[11]的制造方法，其中上述酶处理步骤包括向茶饮料用茶叶的部分制造工序中添加来源于微生物的二糖苷酶。
[12]的制造方法，其中上述部分制造工序为选自粗揉工序、揉捻工序、中揉工序和精揉工序中的一个或多个工序。
茶饮料用茶叶的制造方法，其特征在于在揉捻工序中添加来源于微生物的二糖苷酶。
[11]-[14]中任一项的制造方法，其中上述二糖苷酶来源于多色青霉。
[11]-[14]中任一项的制造方法，其中二糖苷酶来源于烟曲霉。
[11]-[16]中任一项的制造方法，其中上述茶饮料用茶叶为不发酵茶、半发酵茶、全发酵茶、后发酵茶或上述二种或二种以上的混合茶。
由[11]-[17]中任一项的制造方法所制造的茶饮料用茶叶。
茶饮料用茶叶，该茶饮料用茶叶因来源于微生物的二糖苷酶的作用而使风味得到改善。
茶饮料用茶叶，该茶饮料用茶叶添加了来源于微生物的二糖苷酶。
速溶茶(インスタント茶)，该速溶茶含有经浓缩茶饮料而成的液状或粉末状组合物、以及来源于微生物的二糖苷酶。
上述制造方法中，在制造过程中，通过来源于微生物的二糖苷酶作用于茶叶中所含的香气成分母体(二糖苷)，香气成分被带出，风味得到改善。换言之，可获得风味丰富的茶饮料或可应用于其制造的茶饮料用茶叶。本发明中所用的来源于微生物的二糖苷酶与茶叶中所含的同类酶(β-樱草苷酶)相比，可作用的底物的范围广，即，即使对于所述酶(β-樱草苷酶)不能作用的底物-香气成分母体(二糖苷)也可以作用。因此，可以从这样的香气成分的母体中带出香气成分，从而进行有效且高效的风味改善。
另外，通过采用来源于微生物的酶，可以大量制备品质均一的酶，因此可以再现性良好地进行酶促反应。因而可以防止因制造批次的不同而产生的风味偏差，可以制造品质更稳定的茶饮料。
并且，来源于微生物的二糖苷酶热稳定性优异，因此可作用的温度范围宽，有利于制造。
本说明书中，“风味改善”的用语包含风味增强的意思，是指存在于茶饮料中的香气成分的量增加，风味丰富。例如包括鲜香和甜香得到增强的状态。另外，本说明书中的“风味改善”中，也包括通过使某种特定的香气成分的量增强而间接地使得对其他香气成分的感受发生改变，从而使所感受的整体的香气印象改变。
另一方面，在本说明书中，提到“通常的制造工序”，则是指不含本发明的酶处理步骤的制造工序。因此，不只限于通常进行的茶饮料用茶叶或茶饮料的制造工序，用于制造特定的茶饮料用茶叶或茶饮料(例如添加了风味的茶饮料等)而进行的制造工序也包含在通常的制造工序的概念中。同样，本说明书中，提到“通常的制造方法”不只限于通常进行的茶饮料用茶叶或茶饮料的制造方法，也包括用于制造特定的茶饮料用茶叶或茶饮料的制造方法。本说明书中，将可用水或热水的提取来提供茶饮料的茶叶称为茶饮料用茶叶，以此与只采摘而未加工的茶叶、加工中的茶叶等进行区别。
本说明书中，简单写作二糖苷酶时，表示来源于微生物的二糖苷酶。本说明书中如无特别说明，百分比(％)比表示(W/V)％。
实施发明的最佳方式本发明内容之一涉及茶饮料的制造方法，其特征在于包括使来源于微生物的二糖苷酶作用的酶处理步骤(以下也简称为“酶处理步骤”)。
本发明所适用的茶饮料的种类并没有特别限定，本发明的茶饮料包括煎茶、玉露、抹茶、番茶、焙茶和玄米茶等不发酵茶(绿茶)；乌龙茶和包种茶等半发酵茶；红茶等全发酵茶；以及阿波番茶、团茶、黑茶、GOISHI茶和普洱茶等后发酵茶。另外，将从它们之中任意选择的两种或两种以上的茶混合而得到的混合茶(即混合茶叶原料和/或制造工序不同的茶饮料而得到的茶)也包括在本发明的茶饮料中。并不限于混合最终产品(茶饮料)而得到的茶，通过混合茶叶原料，或者通过混合制造过程中的中间品而得到的茶也包括在这里所述的混合茶中。并且，另行添加了香料、果汁、乳制品等的风味茶、果茶等也包括在本发明的茶饮料中。
本发明中，二糖苷酶是被分类为糖链水解酶的酶，可以以苷作为底物，其中所述苷是糖以外的构成苷的化合物(以下称为“苷元”)和由单一或多种糖类构成的直链和支链糖链经由糖链的羟基结合而成，该酶以二糖单元识别底物并切断，生成苷元。
本发明中可使用的来源于微生物的二糖苷酶例如有其二糖苷酶活性已得到证实的曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、根毛霉属(Rhizomucor)、踝节菌属(Talaromyces)、被孢霉属(Mortierella)、隐球酵母属(Cryptococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、游动放线菌属(Actinoplanes)等各种微生物所生产的二糖苷酶。
更优选的来源于微生物的二糖苷酶有其二糖苷酶生产能力已得到证实的黑曲霉(Aspergillus niger)IFO 4407(购自财团法人发酵研究所大阪市淀川区十三本町2-17-85)、黑曲霉IAM 2020、烟曲霉IAM2046、多色青霉IAM 7153(购自东京大学分子细胞生物学研究所东京都文京区弥生1-1-1)所生产的二糖苷酶。
特别优选的来源于微生物的二糖苷酶有多色青霉IAM 7153菌株所生产的二糖苷酶。来源于多色青霉的β-半乳糖苷酶是登录于食品添加剂清单、安全性已得到证实的酶，由此可推断由上述安全性高的菌所生产的二糖苷酶也具有高的安全性。
为了使用上述各种微生物等制造二糖苷酶，可以适当设定适合该微生物培养的方法、条件。例如，可以采用液体培养法、固体培养法的任一种作为上述各种菌株的培养方法，优选液体培养法。液体培养例如可以如下进行。
培养基只要是能培养出生产二糖苷酶的微生物的培养基即可，可以是任何一种。例如可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源；还有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦麸、肉膏等氮源；以及钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐。
为了生产并蓄积二糖苷酶，还可向培养基中添加各种诱导物。诱导物例如可以使用糖类，可优选使用龙胆糖(gentose)(例如龙胆糖#80、日本食品化工株式会社)、龙胆二糖、龙胆低聚糖(例如龙胆低聚糖、和光纯药工业株式会社)、半乳甘露聚糖等。这些诱导物的添加量并没有特别限定，只要是可增大目标二糖苷酶的生产能力的量即可，优选添加0.01-10％。
培养基的pH例如调节为约3-8，优选约5-6；培养温度通常为约10-50℃，优选约25-30℃；在好气条件下培养1-15天、优选约4-7天。培养方法例如可利用振荡培养法、通过小型发酵罐的好气深层培养法。不过，上述的各种培养条件等可根据要培养的对象微生物或细胞来适当改变，只要是可生产本发明的二糖苷酶的条件既可，对其条件等并不限定。
由所得培养液分离纯化二糖苷酶时，以二糖苷酶活性为指标，将离心、UF浓缩、盐析、离子交换树脂等各种层析组合，按照常规方法进行处理，可获得纯化的二糖苷酶(参考文献蛋白质·酵素的基础实验法 堀尾 武一著、南江堂)。本发明中，也可以原样利用培养了生产上述二糖苷酶的微生物的培养液作为来源于微生物的二糖苷酶。当然，该培养液可以根据本发明的使用目的，来适当改变其纯化程度，例如作为与纯化二糖苷酶同等效力的酶，也可以将后述实施例1中的粗制二糖苷酶用于本发明。
由以上的方法得到的来源于微生物的二糖苷酶可以将香气成分从来源于茶叶的β-樱草苷酶所不能作用的二糖苷中带出，可产生优异的风味改善效果。
优选将本发明的酶处理步骤与通常的茶饮料的部分制造工序同时进行。这样无需另设酶处理步骤，可以提高制造效率。例如绿茶饮料的一般的制造工序包括采摘、蒸青、粗揉、揉捻、中揉、精揉、干燥(以上是茶饮料用茶叶的制造工序)和提取等各工序，可以将其中任意一个或多个工序以添加了二糖苷酶的状态进行。乌龙茶等半发酵茶的一般的制造工序包括采摘、日晒萎凋、室内萎凋·搅拌、炒叶、揉捻、玉解、干燥(以上是茶饮料用茶叶的制造工序)和提取等各工序，可以将其中任意一个或多个工序以添加了二糖苷酶的状态进行。同样，红茶等全发酵茶的一般的制造工序包括采摘、萎凋、揉捻、发酵、干燥(以上是茶饮料用茶叶的制造工序)和提取等各工序，可以将其中任意一个或多个工序以添加了二糖苷酶的状态进行。
如上所述，通过将部分茶饮料制造工序以添加了二糖苷酶的状态进行，可以在该工序中使原本的加工处理与由二糖苷酶进行的酶处理同时进行。
这里，关于进行酶处理的工序，当制造绿茶时，优选粗揉、揉捻、中揉和粗揉的任意一步(或多步)。其中从部分茶叶组织破碎，形成酶容易作用的状态；加工温度适合酶处理；以及工序中总是为搅拌的状态，二糖苷酶容易均匀分散等理由考虑，优选在揉捻工序和/或中揉工序中添加二糖苷酶进行酶处理。特别优选在揉捻工序中添加二糖苷酶进行酶处理。同样的理由，当制造乌龙茶等半发酵茶时，优选将日晒萎凋、室内萎凋·搅拌、揉捻、玉解的任意一步(或多步)作为酶处理步骤，进一步优选揉捻工序和/或玉解工序。其中特别优选揉捻工序。同样，当制造红茶等前发酵茶时，优选将揉捻工序和/或发酵工序作为酶处理步骤。
如上所述，将部分通常的制造工序以添加了二糖苷酶的状态进行时，未必是在该工序的最初添加二糖苷酶，可以在该工序中的适当时间添加二糖苷酶。如果这样，就可以调节酶的作用时间，进行所希望的风味改善。进行酶处理时，可调节该工序的加工温度，以使酶促反应良好进行。
另一方面，本发明的酶处理步骤也可以作为独立的工序进行。进行其他工序的同时进行酶处理步骤时，需要根据情况考虑酶的添加是否影响其他工序的加工处理效率等，但如果将酶处理步骤独立，则无须考虑这样的影响。这意味着可在酶处理步骤中自由设定适宜的温度条件、pH条件等，可高效地进行酶处理。
将酶处理步骤作为独立的工序进行时，例如可以在上述通常的制造工序(绿茶为采摘、蒸青、粗揉、揉捻、中揉、精揉、干燥和提取各工序，乌龙茶等半发酵茶为采摘、日晒萎凋、室内萎凋·搅拌、炒叶、揉捻、玉解、干燥和提取各工序，红茶等全发酵茶的通常的制造工序为采摘、揉捻、发酵、干燥和提取各工序)的任意一步或多步工序之前或之后进行酶处理步骤。
在由加工处理的茶叶(茶饮料用茶叶)提取茶的工序(提取工序)中，可以添加二糖苷酶进行酶处理。这里，用高温的热水进行提取工序时，优选在提取液的温度比二糖苷酶失活温度低之后添加二糖苷酶，进行酶促反应，以防止酶失活，实施良好的酶促反应。例如优选在提取液温度为60℃或以下之后再添加二糖苷酶，进行酶促反应(酶处理步骤)。另外优选将添加了二糖苷酶的提取液在适合酶促反应的温度下维持一定时间，以使酶处理高效进行。另一方面，也可以将经过一系列茶饮料制造工序(例如绿茶为采摘、蒸青、粗揉、揉捻、中揉、精揉、干燥和提取工序)所得的提取液(茶饮料)通过喷雾干燥或冷冻干燥等进行干燥处理，然后溶解于水等溶剂中，再向所得溶液中添加二糖苷酶，进行酶处理。
例如也可以将二糖苷酶添加到市售的茶叶(包括袋泡茶)等的提取液中，进行本发明的酶处理，进行风味的改善。
优选在酶处理步骤后的适当时期进行可使添加的二糖苷酶的作用停止的热处理。例如通过在70℃加热处理30分钟，可以使二糖苷酶失活。所述热处理可以用通常的茶饮料制造过程中的干燥工序等来代替。另外，通过添加酸或碱，改变pH，也可以使二糖苷酶的作用停止。
二糖苷酶的添加可通过将配制成液状或粉末状的上述二糖苷酶粗制酶或纯化酶直接添加到茶叶中来进行。在茶叶的加工处理工序中添加时，例如优选通过喷雾来添加液状的二糖苷酶粗制酶或纯化酶，以均匀地向全部茶叶中添加，进行高效的酶促反应。
本发明的酶处理步骤中，来源于微生物的二糖苷酶的用量可以考虑必要的风味改善程度、酶处理步骤中茶叶的状态等而适当决定。在茶叶加工过程(茶饮料用茶叶的制造过程)中进行酶处理时，例如100g茶叶可使用0.01-100000单位的二糖苷酶，优选2.0-10000单位，进一步优选15-3000单位。由茶饮料用茶叶中提取茶时，或对提取的茶进行酶处理时，酶用量也根据所使用的茶饮料用茶叶的量而变化，例如100ml提取的茶可使用0.01-50000单位的二糖苷酶，优选1.0-5000单位，进一步优选5.0-1000单位。这种情况下也可以以用于提取的茶饮料用茶叶的量为基准设定酶的用量。
二糖苷酶的用量过少时，可能不能充分获得目标风味改善效果；相反，过多时制造成本上升，并且因存在于二糖苷酶中的杂质的作用以及味道，可能会有损风味，因而不能说优选。
添加二糖苷酶并使其发生作用时的温度通常为20-70℃，优选30-65℃，更优选40-60℃，特别优选50-55℃。作用温度比上述的通常范围低时，不能充分发挥二糖苷酶的作用，难以获得风味改善的效果；比上述的通常范围高时，二糖苷酶容易发生失活，同时茶叶中的成分受到热变性而变性，可能由此导致风味变差。
另一方面，使二糖苷酶发生作用的pH通常为2.0-8.0，优选3.0-7.0，更优选4.0-6.0，特别优选4.5-5.5。使其发生作用的pH比上述通常的范围低时或高时，二糖苷酶的作用不能充分发挥，难以获得风味改善的效果，另外茶叶中的成分容易受到变性，可能由此导致风味变差。
以上，对特征为通过来源于微生物的二糖苷酶进行酶处理步骤的茶饮料的制造方法进行了说明，上述制造方法中提供了茶饮料用茶叶的制造方法(本发明的另一内容)，该方法通过直到提取工序之前的工序(包括通过二糖苷酶进行酶处理的工序)，可获得提取时风味得到改善的茶饮料。
另一方面，将上述来源于微生物的二糖苷酶添加到按照通常的制造工序进行加工处理的茶饮料用茶叶中，所得茶叶可作为风味得到改善的茶饮料用茶叶应用。例如，在按照上述通常的制造方法制造的绿茶、乌龙茶或红茶等茶叶中添加含有二糖苷酶的溶液，再根据需要进行干燥。使用经这样加工处理的茶叶，在酶不失活的条件下进行提取操作，则在提取时，二糖苷酶作用于茶叶中或由茶叶中提取的香气成分母体，可在提取液中(茶饮料)中生成香气成分。
按照通常的制造方法制造的茶饮料经浓缩而得到的液状或粉末状组合物，通过将上述来源于微生物的二糖苷酶添加到上述组合物中，在稀释或溶解时即可获得风味得到改善的茶饮料，构成所谓的速溶茶。
以下例举实施例，详细说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
来源于微生物的二糖苷酶的制备(1-1)使用多色青霉IAM 7153菌株培养二糖苷酶将含有2.0％脱脂大豆、3.0％葡萄糖、0.5％磷酸二氢钾、0.4％硫酸铵、0.3％干酵母的生长培养基(pH5.6)在121℃灭菌20分钟。相对于100ml灭菌了的培养基，接种1接种环生产菌，在27℃下以140min-1的振荡速度进行预培养。5天后，将20L含有1.0％Sunfiber-R、2.0％磷酸二氢钾、1.0％硫酸铵、3.13％meast PIG的pH4.9的主要培养基装入30L容量的小型发酵罐，以150min-1边搅拌边在121℃灭菌20分钟。将上述预培养的培养基以1.5％(v/v)接种到该主要培养基上，在搅拌速度250min-1、通气量0.75vvm(15L/分钟)、内部压强0.5Kg/cm2(48kPa)、27±1℃的条件下培养8天。
(1-2)二糖苷酶的纯化向培养液中分别加入总液量的2％的Zemlight Super 56M和FineFlow A作为过滤助材，进行硅藻土过滤。用超滤膜UF AIP-2020(MW6,000)浓缩20倍，同时用pH4.7的20mM乙酸缓冲液置换。将该培养液进行无菌过滤、冷冻干燥，以此作为粗制二糖苷酶。向上述超滤浓缩液中加入硫酸铵，进行50％饱和硫酸铵盐析。除去所得沉淀，再向上清中加入硫酸铵，进行80％饱和硫酸铵盐析。回收沉淀，溶解于pH4.7的20mM乙酸缓冲液中。将溶解液过10-DG柱(BioRad Co.)，将缓冲液置换为含有30％饱和硫酸铵的pH4.7的20mM乙酸缓冲液。将该溶液进行疏水层析(HiLoad 16/10苯基琼脂糖凝胶高生产性(Pharmacia))，将显示二糖苷酶活性的流分与β-糖苷酶和β-木糖苷酶活性流分分离。在室温下以2mL/分钟的流速用含有30％饱和硫酸铵的20mM乙酸缓冲液开始洗脱，按照30-0％饱和硫酸铵的直线梯度进行洗脱。在10-12.5％饱和硫酸铵浓度下洗脱出显示二糖苷酶活性的流分。对回收的二糖苷酶流分进行浓缩，将离心分离的上清过10-DG柱，将溶液置换为pH7.1的25mM tris-盐酸缓冲液。将该液体进行等电点层析(Mono-P HR5/20(Pharmacia))，用pH5.0的Polybuffer 74以1mL/分钟、在室温下开始洗脱。在pH6.2-pH6.3处洗脱出目标二糖苷酶活性。将该流分进行SDS电泳，得到单一条带，由此显示二糖苷酶完成纯化。以下，也将该二糖苷酶称为纯化二糖苷酶。
(1-3)二糖苷酶活性测定方法使用自动化学分析装置(东芝制造、TBA-30R)，将对硝基苯(pNP)-樱草苷溶解于乙酸缓冲液(pH5.5)使其浓度为2mM，使30μL二糖苷酶样品与200μL该溶液混合，在40℃以22.5秒循环周期反应9.75分钟，然后加入250μL碳酸钠，测定412nm的吸光度。样品的空白测定是用20mM乙酸缓冲液(pH5.5)代替底物溶液，同样进行测定。将该条件下吸光度提高1的酶量作为1个单位。
上述pNP-樱草苷是使用木糖苷酶(Sigma制备)，使pNP-糖苷(Merk制备)与低聚木糖(和光纯药社)反应，通过β-1，6键使木糖转移1个残基给pNP-糖苷而合成。
对绿茶风味改善效果的评价(2-1)通过仪器分析进行评价(1)绿茶提取液的制备向2g茶叶(Ooi茶(商品名、锅炒绿茶、伊藤园株式会社制))中加入50mL沸水，浸泡1分钟。将其过滤(2号滤纸)，除去不溶性成分，将得到的滤液作为绿茶叶提取液。
另一方面，向煎茶袋泡茶(日本茶贩卖株式会社制)1包(2g)中加入50mL沸水，浸泡30秒钟。将其过滤(2号滤纸)，除去不溶性成分，将得到的滤液作为速溶绿茶提取液。
(2)对绿茶提取液(绿茶叶提取液、速溶绿茶提取液)进行酶处理相对于20mL绿茶叶提取液，加入实施例1中制备的二糖苷酶进行酶处理。处理条件是55℃、3小时。设添加粗制二糖苷酶的组和添加纯化二糖苷酶的组。将粗制二糖苷酶组根据添加量的不同分为4小组(添加量5.2-1040单位)，纯化二糖苷酶组为1小组(添加量52单位)。另外采用未添加二糖苷酶的组(未添加)作为对照。
(3)香气成分的测定、评价酶处理后，通过气相色谱/质谱仪(GC/MS、产品型号“HP6890GC/HP5973MSD”、Agilent Technologies)进行各提取液中香气成分的鉴定。测定结果如下表1、2所示。
(绿茶叶提取液)[表1]
绿茶叶提取液二糖苷酶活性(单位)粗制酶 纯化酶 化合物名1040520525.2 52 未添加167414 135694 61920 N.D. 60284 N.D. 苧烯∞ ∞ ∞-∞ -2053147 23289781204867 1255739 1227035268396 (Z)-3-己烯醇7.6 8.74.5 4.7 4.61.0142494 155832 N.D. N.D. N.D. N.D. (Z)-氧化芳樟醇∞ ∞ - -- -212238 187823 N.D. N.D. N.D. N.D. (E)-氧化芳樟醇∞ ∞ - -- -2918597 30442433083261 2902877 2918035682886 苯甲醛4.3 4.54.5 4.3 4.31.05539577 3807528736214428046 730894 311131 芳樟醇17.812.2 2.4 1.4 2.31.0323270 289633 87635 6753784923 44893牛儿醛7.2 6.52.0 1.5 1.91.0423636 595017 284143N.D. 277301 N.D. 牛儿醇∞ ∞ ∞-∞ -223523 265916 12671777061126230 N.D. 水杨酸甲酯∞ ∞ ∞∞ ∞ -927722 986077 720496277357 700835 N.D. 苄醇∞ ∞ ∞∞ ∞ -274011 247049 N.D. N.D. N.D. N.D. 苯乙醇∞ ∞ - -- -表中的数值中，上行表示峰面积，下行表示相对于未添加的比例。N.D.表示检出限或以下。
如表1所示，粗制二糖苷酶组、纯化二糖苷酶组的各香气成分均上升。由此可知通过添加二糖苷酶，可以带出绿茶提取液中的香气成分，进行风味的改善。用纯化二糖苷酶处理时和用含有相同活性的二糖苷酶的粗制二糖苷酶处理时，各香气成分的增加量几乎相同，显示二糖苷酶对于香气成分的增加发挥着中心作用。随着二糖苷酶的添加量不同，香气成分的增加量也不同(粗制二糖苷酶组)，因此只要调节二糖苷酶的添加量，即可以使各香气成分量改变，由此显示可制造各种香气均衡的绿茶饮料。
(Z)-3-己烯醇被称为青叶醇，令人感受到嫩叶的清爽的清香。氧化芳樟醇令人感受到清爽的三叶草。芳樟醇、 牛儿醇、苄醇和苯乙醇均是令人感受到花香的化合物，已知芳樟醇有铃兰类的花香、 牛儿醇和苯乙醇有蔷薇的花香、苄醇有类似紫罗兰、茉莉的香气。水杨酸甲酯是红茶的主要香气成分之一。 牛儿醛作为葡萄、橙子、柠檬等柑橘类果实的香气成分而周知。
(速溶绿茶提取液)[表2]对速溶绿茶提取液的效果二糖苷酶活性(单位)粗制酶 纯化酶化合物名260 52 5.2 52 未添加189147 74826 N.D. 25865 N.D. 苧烯∞ ∞ -∞ -196777 149273 88587145590 129312(Z)-罗勒烯1.5 1.2 0.7 1.1 1.0256343 126500 N.D. 112054 N.D. (E)-罗勒烯∞ ∞ ∞ ∞ -98707 50486 4498724376 N.D. 松油烯∞ ∞ ∞ ∞ -1240725 805631 647029 81013 131150(Z)-3-己烯醇9.5 6.1 4.9 0.6 1.092179 88041 7751266032 N.D. (Z)-氧化芳樟醇∞ ∞ ∞ ∞ -125566 N.D.N.D. N.D.N.D. (E)-氧化芳樟醇∞ - -- -1110157 648648 809582 935422 73453 苯甲醛15.112.911.0 12.71.03273642 586348 120651 505246 44905 芳樟醇72.913.12.7 11.31.0419112 306721 36569215301 33502 牛儿醛12.59.2 1.1 6.4 1.0150382 243367 46020220124 24142 水杨酸甲酯6.2 10.11.9 9.1 1.0474802 611881 73458574231 59488 牛儿醇8.0 10.31.2 9.7 1.0433322 334208 214609 328145 N.D. 苄醇∞ ∞ ∞ ∞ -
表中的数值中，上行表示峰面积，下行表示相对于未添加的比例。N.D.表示检出限或以下。
如表2所示，即使在速溶绿茶提取液中，因二糖苷酶的添加而使很多香气成分的量增加。因此通过二糖苷酶进行的酶处理对速溶绿茶提取液也有效，即，可知通过添加二糖苷酶，可以有效进行风味的改善。通常人们认为本实施例中使用的袋泡茶等速溶绿茶缺乏香味。因此，上述的风味改善效果对这样的速溶绿茶极有效，对于速溶绿茶，通过增强绿茶的主要香气，可以改善其风味，进而接近茶叶产品的香气品质。
(2-2)由品茶师进行的感官评价(1)绿茶提取液的制备将4g茶叶(Ooi茶(商品名、锅炒绿茶、伊藤园株式会社制))装入茶壶，注入约400mL热水(约90℃)。然后浸泡约40秒钟(摇荡2、3次)，将得到的浸泡液作为绿茶叶提取液。
另一方面，将煎茶袋泡茶(日本茶贩卖株式会社制)1包(2g)装入容器，注入约200mL的热水(约90℃)。然后浸泡约40秒钟(摇荡2、3次)，将得到的浸泡液作为速溶绿茶提取液。
(2)对绿茶提取液(绿茶叶提取液、速溶绿茶提取液)进行酶处理相对于20mL绿茶叶提取液，加入实施例1中制备的二糖苷酶进行酶处理。处理条件是55℃、3小时。设添加粗制二糖苷酶的组和添加纯化二糖苷酶的组。将粗制二糖苷酶组根据添加量的不同分为2小组(添加量5.2或52单位)，纯化二糖苷酶组为1小组(添加量52单位)。另外采用未添加二糖苷酶的组(未添加)作为对照。
(3)感官评价使用酶处理后的各绿茶提取液，由5名品茶师进行感官检查(味道、香味)。采用5分评价方法(评分5强；评分4稍强；评分3普通；评分2稍弱；评分1弱)。感官检查的结果如下表3-10所示。
(绿茶叶提取液)[表3]
经酶处理的绿茶叶提取液的感官试验未添加酶品茶师 味道香味综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 鲜香品茶师-A1.01.01.01.0 2.0 2品茶师-B2.01.01.01.0 1.0 3品茶师-C1.01.02.01.0 3.0 2品茶师-D1.02.02.01.0 2.0 1品茶师-E2.01.01.01.0 2.0 2平均分 1.41.21.41.0 2.0 2.0[表4]粗制二糖苷酶5.2单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 鲜香品茶师-A4.02.02.04.0 3.0 3品茶师-B3.02.01.03.0 3.0 3品茶师-C3.03.01.03.0 3.0 2品茶师-D4.02.02.04.0 2.0 3品茶师-E2.02.01.02.0 3.0 4平均分 3.22.21.43.2 2.8 3.0[表5]粗制二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 鲜香品茶师-A4.02.02.05.0 3.0 5品茶师-B5.02.02.03.0 4.04品茶师-C5.02.01.05.0 4.0 5品茶师-D4.03.02.04.0 2.0 3品茶师-E3.03.02.03.0 3.0 5平均分 4.22.41.84.0 3.2 4.4 纯化二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A4.03.01.0 4.0 3.04品茶师-B4.02.02.0 4.0 3.04品茶师-C5.02.01.0 4.0 3.04品茶师-D4.02.02.0 3.0 3.04品茶师-E3.03.02.0 4.0 3.04平均分 4.02.41.6 3.8 3.04.0如上表所示，通过二糖苷酶的处理，使味道及香味增强。特别是可以证实清爽感(润喉)、甜香、鲜香有效增强。上述仪器分析(GC/MS分析)中，已证实增加了的香气成分(芳樟醇和苄醇等)与类似花的甜香气味的增强有很大关系，鲜香的增强与(Z)-3-己烯醇的增加有关。另外，虽然苦味和涩味有少许增强，但如上所显示，清爽感(润喉)得到大幅改善。
(速溶绿茶提取液)[表7]经酶处理的速溶绿茶提取液的感官评价结果未添加酶品茶师 味道 香味 综合评价清爽苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A1.0 1.02.0 1.0 2.01品茶师-B1.0 1.01.0 1.0 1.02品茶师-C1.0 1.02.0 1.0 1.02品茶师-D1.0 1.01.0 1.0 2.01品茶师-E2.0 1.01.0 2.0 1.01平均分 1.2 1.01.4 1.2 1.41.4 粗制二糖苷酶5.2单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香 鲜香品茶师-A2.02.02.0 2.02.0 2品茶师-B1.03.01.0 3.01.0 3品茶师-C2.02.02.0 3.03.0 3品茶师-D3.01.02.0 4.02.0 3品茶师-E2.02.01.0 2.03.0 2平均分 2.02.01.6 2.82.2 2.8[表9]粗制二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味综合评价清爽 苦味 涩味甜香 鲜香品茶师-A2.02.02.0 3.03.0 4品茶师-B2.03.01.0 3.03.0 4品茶师-C3.02.02.0 4.04.0 4品茶师-D4.02.02.0 5.04.0 4品茶师-E3.03.02.0 4.04.0 5平均分 2.82.41.8 3.83.6 4.2[表10]纯化二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽苦味 涩味甜香 鲜香品茶师-A2.0 3.02.0 3.04.0 4品茶师-B2.0 3.01.0 4.03.0 4品茶师-C3.0 2.02.0 4.04.0 3品茶师-D3.0 2.01.0 4.03.0 4品茶师-E2.0 2.02.0 3.04.0 4平均分 2.4 2.41.6 3.63.6 3.8
如上表所示，证实通过二糖苷酶处理，速溶绿茶提取液中也同样增加了类似花的甜香和鲜香。因此可使一直被认为缺乏香气的速溶产品的香气增强、风味改善。关于味道，苦味、涩味增加，但清爽感(润喉)也同时增加，因此整体味道的均衡并没有改变，几乎没有味道品质变差的情况。
对乌龙茶风味改善效果的评价(3-1)通过仪器分析进行评价(1)乌龙茶提取液的制备向2g茶叶(中国名茶乌龙茶(商品名、日本茶贩卖株式会社制))中加入50mL沸水，浸泡1分钟。将其过滤(2号滤纸)，除去不溶性成分，将得到的滤液作为乌龙茶叶提取液。
另一方面，向乌龙茶袋泡茶(中国名茶乌龙茶、日本茶贩卖株式会社制)1包(2g)中加入50mL沸水，浸泡30秒钟。将其过滤(2号滤纸)，除去不溶性成分，将得到的滤液作为速溶乌龙茶提取液。
(2)对乌龙茶提取液(乌龙茶叶提取液、速溶乌龙茶提取液)进行酶处理将乌龙茶提取液按照与上述(2-1)(2)相同的方法进行酶处理。将粗制二糖苷酶组根据添加量的不同分为4小组(添加量5.2-520单位)、纯化二糖苷酶组为1小组(添加量52单位)。另外采用未添加二糖苷酶的组(未添加)作为对照。
(3)香气成分的测定、评价酶处理后，通过气相色谱/质谱仪(GC/MS、产品型号“HP6890GC/HP5973MSD”、Agilent Technologies)进行各提取液中香气成分的鉴定。测定结果如下表11、12所示。
(乌龙茶叶提取液)[表11]
乌龙茶叶提取液二糖苷酶性(单位)粗制酶纯化酶 未添加 化合物名520 260 525.252125167 6647975329 40355 46347N.D. 1-己醇∞ ∞ ∞∞ ∞1006705 1007092 884746736947 55704162867 (Z)-3-己烯醇6.2 6.2 5.4 4.50.3 1.0125428 124821 65263 62901 3857431079(Z)-氧化芳樟醇4.0 4.0 2.1 2.01.2 1.0116712 114358 13259360857 N.D. N.D. (E)-氧化芳樟醇∞ ∞ ∞∞ --1051770 915185 855279709228 856045 330603 苯甲醛3.2 2.8 2.6 2.12.6 1.01431863 1437442 842582407919 445794 232822 芳樟醇6.2 6.2 3.6 1.81.9 1.0189137 140649 119751N.D. 605378 N.D. 牛儿醛∞ ∞ ∞- ∞270514 229313 10467276108 599560 N.D. 牛儿醇∞ ∞ ∞∞ ∞ -862046486310595671932 327410 53322水杨酸甲酯1.6 1.2 2.0 1.36.1 1.0384199 418023 237450150958 228162 N.D. 苄醇∞ ∞ ∞∞ ∞表中的数值中，上行表示峰面积，下行表示相对于未添加的比例。N.D.表示检出限或以下。
如表11所示，各香气成分的增加比例虽有不同，但与上述绿茶提取液的情形相同，通过添加二糖苷酶，香气成分得到增加。由此可知通过添加二糖苷酶，可带出乌龙茶提取液中的香气成分，进行风味的改善。用纯化二糖苷酶处理时和用含有相同活性的二糖苷酶的粗制二糖苷酶处理时，各香气成分的增加量大致相同，这显示二糖苷酶对于香气成分的增加发挥着中心作用。随着二糖苷酶的添加量不同，香气成分的增加量也不同(粗制二糖苷酶组)，由此显示只要调节二糖苷酶的添加量，即可以使各香气成分量改变，进而可制造各种香气均衡的乌龙茶饮料。
(速溶乌龙茶提取液)[表12]速溶乌龙茶提取液二糖苷酶活性(单位)粗制酶纯化酶 未添加 化合物名260 52 5.251304285 766467 600471 449350 206098 (Z)-3-己烯醇6.3 3.72.92.21.0211086 131708 52904 60511 N.D.(Z)-氧化芳樟醇∞ ∞ ∞ ∞ -137521 67305 17642 28843 22151 (E)-氧化芳樟醇6.2 3.00.81.31.01214152 991581 832062 957736 329105 苯甲醛3.7 3.02.52.91.0617863 365279 229910 194358 118184 芳樟醇5.2 3.11.91.61.0249488 81070 N.D. 77360 N.D.松油醇∞ ∞ - ∞ -418448 197851 N.D. 74225 N.D.牛儿醛∞ ∞ - ∞ -119403 87782 N.D. 66803 N.D.δ-杜松烯∞ ∞ - ∞ -177674 143386 53776 85048 N.D.水杨酸甲酯∞ ∞ ∞ ∞ -284081 509534 281640 158641 83073 牛儿醇3.4 6.13.41.91.0297712 362078 166192 338274 N.D.苄醇∞ ∞ ∞ ∞ -表中的数值中，上行表示峰面积，下行表示相对于未添加的比例。N.D.表示检出限或以下。
如表12所示，即使在速溶乌龙茶提取液中，固二糖苷酶的添加而使芳樟醇、 牛儿醇、苄醇等成分增强。这些成分是速溶乌龙茶中特别缺乏的香气成分，显示这样的改变对香气的改善作出了很大贡献。由此可以认定通过二糖苷酶进行的酶处理是极有效的改善速溶乌龙茶提取液的风味的方法。
(3-2)由品茶师进行的感官评价(1)乌龙茶提取液的制备将4 g茶叶(中国名茶乌龙茶(商品名、日本茶贩卖株式会社制))装入茶壶，注入约400mL热水(约90℃)。然后浸泡约1分钟(摇荡2、3次)，将得到的浸泡液作为乌龙茶叶提取液。
另一方面，将乌龙茶袋泡茶(中国名茶乌龙茶、日本茶贩卖株式会社制)1包(2g)装入容器，注入约200mL的热水(约90℃)。然后浸泡约40秒钟(摇荡2、3次)，将得到的浸泡液作为速溶乌龙茶提取液。
(2)对乌龙茶提取液(乌龙茶叶提取液、速溶乌龙茶提取液)的酶处理按照与上述(2-2)(2)同样的方法，通过二糖苷酶对乌龙茶提取液进行酶处理。将粗制二糖苷酶根据添加量的不同分为2小组(添加量5.2或52单位)、纯化二糖苷酶组为1小组(添加量52单位)。另外采用未添加二糖苷酶的组(未添加)作为对照。
(3)感官评价使用酶处理后的各乌龙茶提取液，由5名品茶师进行感官检查(味道、香味)。采用5分评价方法(评分5强；评分4稍强；评分3普通；评分2稍弱；评分1弱)。感官检查的结果如下表13-20所示。
(乌龙茶叶提取液)[表13]经酶处理的乌龙茶叶提取液的感官评价未添加酶品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A1.01.02.0 1.0 3.0 2品茶师-B2.01.01.0 2.0 1.0 3品茶师-C2.01.02.0 2.0 2.0 3品茶师-D2.02.02.0 1.0 1.0 2品茶师-E1.01.01.0 1.0 2.0 2平均分 1.61.21.6 1.4 1.8 2.8 粗制二糖苷酶5.2单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香 鲜香品茶师-A3.02.01.0 4.0 4.0 4品茶师-B2.01.02.0 3.0 3.0 4品茶师-C2.03.03.0 5.0 2.0 3品茶师-D3.02.02.0 4.0 3.0 4品茶师-E3.02.02.0 4.0 3.0 3平均分 2.62.02.0 4.0 3.0 3.6[表15]粗制二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香鲜香品茶师-A2.03.01.05.0 4.0 4品茶师-B3.02.02.04.0 4.0 5品茶师-C2.02.02.05.0 3.0 5品茶师-D3.03.03.05.0 5.0 4品茶师-E3.02.02.05.0 4.0 4平均分 2.62.42.04.8 4.0 4.4[表16]纯化二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A3.02.01.0 5.0 5.04品茶师-B3.02.02.0 4.0 4.04品茶师-C2.02.02.0 5.0 3.03品茶师-D2.03.02.0 4.0 4.04品茶师-E3.02.02.0 5.0 4.05平均分 2.62.21.8 4.6 4.04.0
如上表所示，通过二糖苷酶的处理，味道及香味的所有项目均得到增强。使用纯化二糖苷酶的组中，对涩味的评价几乎没有变化，因此显示二糖苷酶本身几乎与这些风味无关。另外也明确了通过二糖苷酶的处理，类似红茶的香味得到增强。(速溶乌龙茶提取液)[表17]经酶处理的速溶乌龙茶提取液的感官评价未添加酶品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香鲜香品茶师-A1.01.02.01.0 2.0 1品茶师-B2.02.02.01.0 2.0 2品茶师-C1.01.01.01.0 2.0 2品茶师-D2.02.01.02.0 2.0 2品茶师-E1.01.01.01.0 1.0 1平均分 1.41.41.41.2 1.8 1.6[表18]粗制二糖苷酶5.2单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽苦味 涩味 甜香 鲜香品茶师-A2.0 2.02.03.0 2.02品茶师-B2.0 1.03.02.0 1.02品茶师-C1.0 3.01.03.0 3.03品茶师-D2.0 1.01.04.0 2.03品茶师-E2.0 2.02.02.0 2.02平均分 1.8 1.81.82.8 2.02.4 粗制二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香鲜香品茶师-A3.02.02.04.0 2.03品茶师-B2.02.02.03.0 1.04品茶师-C1.03.02.04.0 2.04品茶师-D3.02.03.04.0 3.05品茶师-E3.02.01.05.0 3.04平均分 2.42.22.04.0 2.24.0[表20]纯化二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香鲜香品茶师-A 2.02.02.03.0 2.04品茶师-B 2.02.01.04.0 2.04品茶师-C 2.02.02.04.0 2.03品茶师-D 3.02.02.03.0 2.03品茶师-E 2.02.02.04.0 2.04平均分2.22.01.83.6 2.03.6如上表所示，通过二糖苷酶处理，速溶乌龙茶提取液中也同样特别增加了甜香。因此可使一直被认为缺乏香气的速溶产品香气增强、风味改善。
对红茶风味改善效果的评价(4-1)通过仪器分析进行评价(1)红茶提取液的制备向2g茶叶(Brookbond Hotel & Restaurant blend Darjeeling红茶(商品名、BBL Japan株式会社制))中加入50mL沸水，浸泡1分钟。将其过滤(2号滤纸)，除去不溶性成分，将得到的滤液作为红茶叶提取液。
另一方面，向红茶袋泡茶(Darjeeling红茶(IKE株式会社))1包(2g)中加入50mL沸水，浸泡45秒钟。将其过滤(2号滤纸)，除去不溶性成分，将得到的滤液作为速溶红茶提取液。
(2)对红茶提取液(红茶叶提取液、速溶红茶提取液)进行酶处理按照与上述(2-1)(2)同样的方法对红茶提取液进行醇处理。将粗制二糖苷酶组根据添加量的不同分为4小组(添加量5.2-520单位)，纯化二糖苷酶组为1小组(添加量52单位)。另外采用未添加二糖苷酶的组(未添加)作为对照。
(3)香气成分的测定、评价酶处理后，通过气相色谱/质谱仪(GC/MS、产品型号“HP6890GC/HP5973MSD”、Agilent Technologies)进行各提取液中香气成分的鉴定。测定结果如下表21、22所示。
(红茶叶提取液)[表21]红茶叶提取液二糖苷酶活性(单位)粗制酶纯化酶 未添加化合物名520 260 525.252396067182776169409N.D. 154420 N.D. 1-己醇∞∞∞- ∞ -1560554 1059009 840112831310 1403752 474847(Z)-3-己烯醇3.3 2.2 1.8 1.83.0 1.01562811 1386873 1017438 815849 1008654 556643苯甲醛2.8 2.5 1.8 1.51.8 1.02610268 2648097 1667423 13953371984231 1690567 芳樟醇1.5 1.6 1.0 0.812 1.094750 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Hotrienol∞- - - --180499110123N.D. N.D. N.D. N.D. β-倍半水芹烯∞∞- - --41275329555250057 N.D. 46257N.D. 牛儿醛∞∞- - ∞ -18773822262714450780570 9012489334 水杨酸甲酯2.1 2.5 1.6 0.91.0 1.0668273587961428682159633 263321 82720 牛儿醇8.1 7.1 5.2 1.93.2 1.0
表中的数值中，上行表示峰面积，下行表示相对于未添加的比例。N.D.表示检出限或以下。
如表21所示，通过添加二糖苷酶，红茶的主要香气成分 牛儿醇、芳樟醇、(Z)-3-己烯醇、1-己醇等增加。由此可认为通过添加二糖苷酶，可以带出红茶的主要香气成分，制造风味丰富的红茶饮料。
红茶(茶叶)制造工序的特征是制造中茶叶的内源性酶不失活。因此，在茶叶的制造过程中，内源性酶之一的β-樱草苷酶可充分作用，存在于茶叶中的香气母体-苷完全被水解，甚至可以说不存在于茶叶中。但是，由以上的结果可知一部分苷因未受到茶叶本身的β-樱草苷酶的水解而残留。因此由二糖苷酶将该残留的苷水解，从而显示了可改善香气的可能性。
用纯化二糖苷酶处理时和用含有相同活性的二糖苷酶的粗制二糖苷酶处理时，各香气成分的增加量大致相同，这显示二糖苷酶对于香气成分的增加发挥着中心作用。随着二糖苷酶的添加量不同，香气成分的增加量也不同(粗制二糖苷酶组)，因此只要调节二糖苷酶的添加量，即可以使各香气成分量改变，进而显示可制造各种香气均衡的红茶饮料。
(速溶红茶提取液)[表22]
速溶红茶提取液二糖苷酶活性(单位)粗制酶 纯化酶未添加 化合物名26052 5.2521147607924520 793825 915620442849 苯甲醛2.62.1 1.82.1 1.024807922076575 16348392102747 1641185 芳樟醇1.51.3 1.01.3 1.0149607 8238274805 71852 72487松油醇2.11.1 1.01.0 1.0226966 6851574343 64037 60969牛儿醛3.71.1 1.21.1 1.0167332 121086 37322 31058 29973水杨酸甲酯5.64.0 1.21.0 1.0431856 372951 189388 21835465909牛儿醇6.65.7 2.93.3 1.0359911 282244 192181 158801N.D. 苄醇∞ ∞ ∞ ∞-表中的数值中，上行表示峰面积，下行表示相对于未添加的比例。N.D.表示检出限或以下。
如表22所示，即使在速溶红茶提取液中，红茶的几种主要香气成分得到增强。由此可认为二糖苷酶进行的酶处理是有效的改善速溶红茶提取液的风味的方法。
(4-2)由品茶师进行的感官评价(1)红茶提取液的制备将8g茶叶(Brookbond Hotel & Restaurant blend Darjeeling红茶(商品名、BBL Japan株式会社制))装入茶壶，注入约400mL热水(约90℃)。然后浸泡约2分钟(摇荡2、3次)，将得到的浸泡液作为红茶叶提取液。
另一方面，将红茶袋泡茶(Darjeeling红茶(IKE株式会社))1包(2g)装入容器，注入约150mL的热水(约90℃)。然后浸泡约1分钟(摇荡2、3次)，将得到的浸泡液作为速溶红茶提取液。
(2)对红茶提取液(红茶叶提取液、速溶红茶提取液)进行酶处理按照与上述(2-2)(2)相同的方法，用二糖苷酶对红茶提取液进行酶处理。将粗制二糖苷酶组根据添加量的不同分为2小组(添加量5.2或52单位)，纯化二糖苷酶组为1小组(添加量52单位)。另外采用未添加二糖苷酶的组(未添加)作为对照。
(3)感官评价使用酶处理后的各红茶提取液，由5名品茶师进行感官检查。采用5分评价方法(评分5强；评分4稍强；评分3普通；评分2稍弱；评分1弱)。感官检查的结果如下表23-30所示。
(红茶叶提取液)[表23]经酶处理的红茶叶提取液的感官评价未添加酶品茶师 味道香味 综合评价清爽苦味涩味甜香鲜香品茶师-A1.0 2.0 3.0 3.0 2.02品茶师-B2.0 2.0 3.0 2.0 1.02品茶师-C2.0 1.0 2.0 2.0 1.01品茶师-D2.0 2.0 2.0 3.0 2.02品茶师-E2.0 1.0 2.0 2.0 2.01平均分 1.8 1.6 2.4 2.4 1.61.6[表24]粗制二糖苷酶5.2单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A2.02.03.0 3.0 2.03品茶师-B2.01.03.0 3.0 3.02品茶师-C2.02.03.0 3.0 2.02品茶师-D3.02.02.0 3.0 3.03品茶师-E2.01.02.0 2.0 3.03平均分 2.21.62.6 2.8 2.62.6 粗制二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香鲜香品茶师-A2.02.03.04.0 2.0 4品茶师-B2.02.03.03.0 4.0 3品茶师-C2.02103.03.0 3.0 4品茶师-D2.03.03.03.0 3.0 4品茶师-E3.02.02.02.0 4.0 3平均分 2.22.22.83.0 3.2 3.6[表26]纯化二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香 鲜香品茶师-A2.02.03.0 3.04.03品茶师-B3.02.02.0 3.03.04品茶师-C2.02.03.0 3.03.03品茶师-D2.02.01.0 3.03.05品茶师-E3.01.02.0 2.03.03平均分 2.41.82.2 2.83.23.6如上表所示，味道因通过二糖苷酶的处理而多少发生了变化，但并未观察到大的变化。而香味方面，则证实鲜香味特别增强。可认为这与上述仪器分析(GC/MS分析)中验证的1-己醇、(Z)-3-己烯醇、 牛儿醇、芳樟醇等香气成分的增加有关。
(速溶红茶提取液)[表27]
经酶处理的速溶红茶提取液的感官评价未添加酶品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A1.02.02.0 2.0 1.01品茶师-B2.02.02.0 1.0 1.02品茶师-C1.02.02.0 2.0 1.02品茶师-D1.01.03.0 1.0 2.03品茶师-E1.01.02.0 2.0 1.01平均分 1.21.62.2 1.6 1.21.8[表28]粗制二糖苷酶5.2单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 鲜香品茶师-A1.01.03.02.02.03品茶师-B2.02.02.02.02.03品茶师-C2.02.02.03.02.03品茶师-D1.02.03.02.03.03品茶师-E1.01.03.02.03.02平均分 1.41.62.62.22.42.8[表29]粗制二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A2.0 2.03.0 3.0 2.03品茶师-B1.0 2.02.0 2.0 3.04品茶师-C1.0 2.03.0 3.0 3.03品茶师-D1.0 3.03.0 3.0 3.04品茶师-E1.0 1.03.0 3.0 3.03平均分 1.2 2.02.8 2.8 2.83.4 纯化二糖苷酶52单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A2.02.02.0 2.0 2.04品茶师-B2.02.02.0 2.0 3.03品茶师-C1.02.02.0 3.0 2.03品茶师-D1.02.02.0 3.0 3.03品茶师-E1.02.03.0 3.0 3.03平均分 1.42.02.2 2.6 2.63.2如上表所示，证实通过二糖苷酶处理，速溶红茶提取液中也同样增加了甜香和鲜香。
目前，袋泡红茶的消费在全世界呈增加趋势。袋泡茶中使用了CTC红茶。CTC红茶是在内源性酶尚未对香气母体充分水解时即进行了细粉碎，因此氧化反应加快进行，香气醇的量减少，大量生成(E)-2-己烯醛。
通过二糖苷酶处理，可使CTC红茶中容易缺乏的醇系香气成分增加，因此显示可接近正宗的红茶香气。另外，通过调节二糖苷酶的添加量，可以调节上述香气成分的量，可制造各种香气强度的红茶饮料。
以上的实施例当中，对用二糖苷酶处理茶叶(绿茶、乌龙茶、红茶)的提取液时的风味改善效果进行了研究。以下，例举在茶叶制造工序中使二糖苷酶发生作用，研究风味改善效果的实施例。
绿茶制造工序中风味改善的研究(5-1)茶叶的加工方法及酶处理方法绿茶(绿茶饮料用茶叶)的制造通过采摘、蒸青、粗揉、揉捻、中揉、精揉和干燥一系列工序进行。各工序的加工条件如下。共处理了约2kg茶叶原料。
(1)蒸青目的是使茶叶中的酶失活，同时提高茶叶的柔软性，使揉捻容易进行，除去生味等。将采摘的茶叶装入蒸青机，将蒸汽通入蒸青机，在茶叶与蒸汽充分接触的状态下，在95℃处理20分钟。
(2)粗揉是通过将茶叶在热风中搅拌、揉压，使茶叶各部分的水分均匀，有效率地进行干燥的工序。将茶叶的温度保持34-36℃，处理30分钟。
(3)揉捻(酶处理)补充粗揉中的揉搓不足，减少茶叶水分的不均。揉捻开始10分钟后，用喷雾器喷二糖苷酶的水溶液，再揉捻30分钟。使用粗制二糖苷酶制造2批次(添加量为260单位和5200单位的批次)、使用纯化二糖苷酶制造1批次(添加量为260单位)。以不添加酶制造的批次(未添加)作为对照。
(4)中揉与粗揉同样，是一边吹热风一边进行揉搓的工序。将茶叶的温度保持在34-36℃，处理30-40分钟。
(5)精揉制造出煎茶的形状为一直延伸的形状的工序。处理50分钟。
(6)干燥在送热风的干燥室中干燥至含水率为约5％。处理约60分钟。
向进行如上加工处理的茶叶中加入热水，得到绿茶提取液。将提取液用于GC/MS仪器分析和感官评价。
(5-2)通过仪器分析进行评价使用气相色谱/质谱仪(GC/MS、产品型号“HP6890 GC/HP5973MSD”、Agilent Technologies)进行各批次茶叶提取液中所含香气成分的鉴定。结果如表31所示。

GC/MS分析结果二糖苷酶活性(单位)粗制酶 纯化酶 未添加化合物名5200260260210456 155023 60284N.D. 苧烯∞ ∞ ∞ -867207 368792.0 330261 125465(E)-2-己烯醛6.9 2.92.6 1.01047265 620475 478525 3054241-己醇3.4 2.01.6 1.04456735 22457501458325 458361(Z)-3-己烯醇9.7 4.93.2 1.0302548 285463 175215 N.D. (Z)-氧化芳樟醇∞ ∞ ∞ -421347 187823 182020 N.D. (E)-氧化芳樟醇∞ ∞ ∞ -6937784 48588464426070 1425687 苯甲醛4.9 3.43.1 1.01107954275150565654178 622250芳樟醇17.812.1 9.1 1.0223523 265916 126230 N.D. 水杨酸甲酯∞ ∞ ∞ -665244 582054 165863 85485 牛儿醇7.8 6.81.9 1.01874544 18421541431607 N.D. 苄醇∞ ∞ ∞ -580242 404989 388241 N.D. 苯乙醇∞ ∞ ∞ -(5-3)由品茶师进行的感官评价感官检查结果如表32-35所示。由5名品茶师对味道、香味进行5分评价(评分5强；评分4稍强；评分3普通；评分2稍弱；评分1弱)。

对揉捻工序中添加酶而制造的绿茶进行的感官评价未添加酶品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香 番茶味鲜香品茶师-A1.01.03.01.04.0 2.02品茶师-B2.01.02.01.03.0 1.01品茶师-C2.01.01.01.04.0 1.01品茶师-D1.02.01.01.03.0 2.01品茶师-E2.01.01.01.03.0 2.01平均分 1.61.21.61.03.4 1.61.2[表33]粗制二糖苷酶260单位品茶师 味道 香味综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 番茶味 鲜香品茶师-A 4.02.02.04.01.0 3.0 4品茶师-B 3.02.02.03.02.0 3.0 3品茶师-C 4.03.02.03.01.0 4.0 4品茶师-D 4.03.03.04.01.0 3.0 4品茶师-E 3.02.01.03.02.0 3.0 5平均分 3.62.42.03.41.4 3.2 4.0[表34]粗制二糖苷酶5200单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 番茶味 鲜香品茶师-A3.03.02.02.01.03.04品茶师-B4.02.03.03.01.04.03品茶师-C3.04.04.02.01.04.03品茶师-D3.03.03.02.01.03.04品茶师-E3.03.04.03.02.02.04平均分 3.23.03.22.41.23.23.6 纯化二糖苷酶260单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味涩味 甜香番茶味 鲜香品茶师-A4.0 2.0 2.0 4.0 1.0 4.0 5品茶师-B5.0 3.0 2.0 4.0 1.0 3.0 4品茶师-c4.0 3.0 2.0 3.0 1.0 4.0 4品茶师-D4.0 2.0 2.0 4.0 1.0 3.0 4品茶师-E3.0 2.0 2.0 3.0 2.0 3.0 4平均分 4.0 2.4 2.0 3.6 1.2 3.4 4.2由以上香气成分鉴定结果可知与实施例2同样(酶处理茶叶提取液的情况)，通过添加二糖苷酶，使得香气成分被带出。由感官评价可知甜香和鲜香增加，且番茶味道降低。这样，通过在制造工序中组合进二糖苷酶处理步骤，显示出可以制造风味得到改善的绿茶饮料(或绿茶饮料用茶叶，它可提供提取时风味得到改善的绿茶饮料)。这里，新茶中含有芳樟醇、 牛儿醇、(z)-3-己烯醇等作为香气成分，具有良好的风味。而所述番茶是使用的2番茶、3番茶，叶片硬、缺少新茶中所含的上述香气，具有被称为番茶味的独特的令人不快的香味。因此，在加工等级低的茶叶的过程中，通过进行二糖苷酶酶处理，可以制造茶饮料用茶叶，该茶叶可提供品质高，即风味得到改善的茶饮料。另外，也有可能改善长时间存放、变陈的茶叶的香气。当然，对于像新茶那样有丰富香气的茶，为了进一步增强香气成分、改善乃至改变香气的均衡，也可以将二糖苷酶处理组合到制造工序中。
乌龙茶制造工序中风味改善的研究(6-1)茶叶的加工方法及酶处理方法乌龙茶(乌龙茶用茶叶)的制造通过采摘、日晒萎凋、室内萎凋、锅炒、揉捻和干燥一系列工序进行。各工序的加工条件如下。共处理了约2kg茶叶原料。
(1)日晒萎凋一边将茶叶的温度调节为30-40℃，一边处理30分钟。
(2)室内萎凋每隔1-2小时进行搅拌。如此重复5次。第1次搅拌极轻柔进行，约1分钟，第5次搅拌后静置2小时，然后转入以下操作。
(3)锅炒将茶叶装入圆筒形炒茶机，在140-160℃处理2-3分钟。
(4)揉捻(酶处理)·干燥揉捻10分钟后，抖开茶叶块，装入干燥器中。揉捻开始后立即用喷雾器喷二糖苷酶的水溶液。使用粗制二糖苷酶制造2批次(添加量为520单位和5200单位的批次)、使用纯化二糖苷酶制造1批次(添加量为520单位)。以不添加酶制造的批次(未添加)作为对照。
向如上进行加工处理的茶叶中加入热水，得到乌龙茶提取液。将提取液用于GC/MS仪器分析和感官评价。
(6-2)通过仪器分析进行评价使用气相色谱/质谱仪(GC/MS、产品型号“HP6890 GC/HP5973MSD”、Agilent Technologies)进行各批次茶叶提取液中所含香气成分的鉴定。结果如表36所示。

GC/MS分析结果粗制二糖苷酶活性(单位)纯化酶(单位)未添加 化合物名520 5200 520420847 696897 531740576061己醛1.0 1.7 1.3 1.4221358 282406 2367353110871-己醇1.0 1.3 1.1 1.4274238 492148 455800427895(Z)-3-己烯醇1.0 1.8 1.7 1.6193291 266598 2961722968602-己烯醛1.0 1.4 1.5 1.5462753 538533 467101658283(Z)-戊烯醇1.0 1.2 1.0 1.4N.D. 220887 260996294126(Z)-氧化芳樟醇-∞ ∞∞3614660742 84451 46077 (E)-氧化芳樟醇1.0 1.7 2.3 1.3161568 226320 320156286788苯甲醛1.0 1.4 2.0 1.874885111798 134785128883芳樟醇1.0 1.5 1.8 1.7154024 457602 957502399821水杨酸甲酯1.0 3.0 6.2 2.6438750 557602 678195502593牛儿醇1.0 1.3 1.5 1.1649244 1620380 1810367 1375125 苄醇1.0 2.5 2.8 2.1507163 941025 1428901 886723苯乙醇1.0 1.9 2.8 1.7(6-3)由品茶师进行的感官评价感官检查结果如表37-40所示。由5名品茶师对味道、香味进行5分评价(评分5强；评分4稍强；评分3普通；评分2稍弱；评分1弱)。

对揉捻工序中添加酶制造的乌龙茶进行的感官评价未添加酶品茶师 味道香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香鲜香品茶师-A1.02.02.0 3.0 2.01品茶师-B1.02.02.0 2.0 1.01品茶师-C1.03.02.0 1.0 1.02品茶师-D2.02.02.0 1.0 2.01品茶师-E2.02.03.0 2.0 1.03平均分 1.4 2.22.2 1.8 1.41.6[表38]粗制二糖苷酶520单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香 鲜香品茶师-A2.03.03.0 4.03.03品茶师-B3.03.02.0 3.03.04品茶师-C3.03.03.0 4.04.04品茶师-D3.03.03.0 4.03.04品茶师-E3.02.02.0 4.03.03平均分 2.82.82.6 3.83.23.6[表39]粗制二糖苷酶5200单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味甜香 鲜香品茶师-A3.03.03.0 4.03.02品茶师-B3.04.03.0 5.04.03品茶师-C4.03.03.0 5.03.04品茶师-D3.04.03.0 4.03.03品茶师-E3.03.04.0 5.04.03平均分 3.23.43.2 4.63.43.0 纯化二糖苷酶520单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 鲜香品茶师-A2.03.02.03.02.03品茶师-B3.02.03.04.04.04品茶师-C3.03.02.04.03.03品茶师-D3.02.03.04.04.04品茶师-E3.03.02.03.03.04平均分 2.82.62.43.63.23.6由以上香气成分鉴定结果可知与实施例3(酶处理茶叶提取液的情况)同样，通过添加二糖苷酶，使得香气成分被带出。由感官评价可知清爽感和甜香、鲜香等增加，风味得到了改善。这样，通过在制造工序中组合进二糖苷酶处理步骤，显示出可以制造风味得到改善的乌龙茶饮料(或乌龙茶饮料用茶叶，它可提供提取时风味得到改善的乌龙茶饮料)。
红茶制造工序中风味改善的研究(7-1)茶叶的加工方法及酶处理方法红茶(红茶用茶叶)的制造通过采摘、萎凋、揉捻、发酵和干燥一系列工序进行。各工序的加工条件如下。共处理了约2kg茶叶原料。
(1)萎凋将采摘(Benihomare种)的茶叶分为各500g，在室温下处理过夜(16-19小时)。
(2)揉捻(酶处理)将萎凋的茶叶用揉捻机(伊达式制茶机器)进行揉捻处理。揉捻条件如下。首先，将加盖重物进行的磨碎工序(5分钟)与打开盖子进行搅拌的工序交互分别进行4次。随着周期数的增加而慢慢增加重物(1200g、1800g、2400g、2700g)。在第3个周期中添加实施例1中制备的二糖苷酶。二糖苷酶的添加是将制备的酶溶液(5ml)用喷雾器喷雾而进行，其中制备的酶溶液含有规定单位数的酶。
接着，不改变重物的量，将磨碎工序(10分钟)和打开盖子进行搅拌的工序进行1个周期。
根据使用的酶的不同、以及酶添加量的不同，制造4批次，包括不添加酶的未添加(对照)共5批次。各批次中使用的酶剂的种类、添加量如表41所示。
500g茶叶中酶的添加量和活性酶 添加量活性(单位)(mg/5mL)β-Pri β-Glc β-Xyl α-Rhm①粗制二糖苷酶 5.3 10 6 1194② 52.6100 58 13 1937③ 526.3 1000579132 19368④纯化二糖苷酶 6.8 100 13 717⑤未添加(加水) - - - --向上述加工处理的茶叶中加入热水，得到红茶提取液。将提取液用于GC/MS仪器分析和感官评价。
(7-2)通过仪器分析进行评价使用气相色谱/质谱仪(GC/MS、产品型号“HP6890 GC/HP5973MSD”、Agilent Technologies)进行各批次茶叶提取液中所含香气成分的鉴定。结果如表42所示。

GC/MS分析结果二糖苷酶活性(单位)粗制酶 纯化酶 化合物名未添加10 1001000 1001357103 102829819431402218127 1277388 (E)-2-己烯醛1.0 0.81.41.6 0.991473 146357 182946 210388 164651 (E)-氧化芳樟醇88737 106484 133106 133106 124232 (Z)-氧化芳樟醇1.0 1.21.51.5 1.41111136 144447717778181914506 1333363 苯甲醛1.0 1.31.81.7 1.2612145 918218 11630761163076 1101881 芳樟醇1.0 1.51.91.9 1.8ND 304744 439958 358174 204617 萘，1，2，3，4-四氢-1，6-二甲基- ∞ ∞ ∞ ∞-1-4-(1-甲基乙基)-ND 421365 260552 183489 131735 α-金合欢烯- ∞ ∞ ∞ ∞931276 138800522913911822184 1067267 δ-杜松烯1.0 1.52.52.0 1.1261155 325140 377667 225027 204646 水杨酸甲酯1.0 1.21.40.9 0.8179967 251954 251954 323941 233957 苄醇1.0 1.41.41.8 1.3174113 278581 400460 365637 348226 苯乙醇10 1.62.32.1 2.0(6-3)由品茶师进行的感官评价感官检查结果如表43-47所示。由5名品茶师对味道、香味进行5分评价(评分5强；评分4稍强；评分3普通；评分2稍弱；评分1弱)。

对揉捻工序中添加酶制造的红茶进行的感官评价未添加酶品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 番茶味 鲜香品茶师-A1.01.01.01.01.0 2.02品茶师-B1.02.02.01.01.0 3.01品茶师-C1.01.02.01.01.0 2.01品茶师-D2.01.01.01.01.0 1.01品茶师-E1.01.02.01.01.0 2.02平均分 1.21.21.61.01.0 2.01.4[表44]粗制二糖苷酶10单位品茶师 味道香味综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 番茶味 鲜香品茶师-A2.02.02.03.0 1.0 3.05品茶师-B2.02.02.01.0 1.0 3.04品茶师-C1.01.03.02.0 1.0 3.03品茶师-D2.01.02.02.0 1.0 3.03品茶师-E1.01.02.01.0 1.0 3.04平均分 1.61.42.21.8 1.0 3.03.8[表45]粗制二糖苷酶100单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香 番茶味 鲜香品茶师-A2.03.02.03.01.0 3.0 4品茶师-B2.03.03.02.01.0 2.0 4品茶师-C1.02.03.02.01.0 3.0 3品茶师-D2.02.02.02.01.0 2.0 2品茶师-E1.02.02.02.01.0 3.0 3平均分 1.62.42.42.21.0 2.6 3.2 纯化二糖苷酶1000单位品茶师 味道 香味 综合评价清爽 苦味 涩味 甜香番茶味鲜香品茶师-A2.03.02.03.0 1.0 1.0 3品茶师-B2.04.03.03.0 1.0 2.