专利名称：一种抑制血栓形成的药物的制作方法 血栓性疾病可见于临床各科患者，尤其是心脑血管血栓性疾病，已位于我国人口病死原因的第一位，而且发病率有增加趋势，严重危害人类健康。抗血小板药阿司匹林、噻氯匹定和抗凝血药肝素、法华林在血栓性疾病的预防和治疗中发挥了很大的作用。但这些药物也存在局限性，特别是对缺血性心血管病和出血并发症的疗效作用还有待提高。随着对血栓性疾病发病机制的深入研究，近来在所谓第二代药物之外，又出现了许多新的抗血小板药和抗凝药(如表1)(Gresele P，et al.Novel approachesto the treatment of thrombosis.Trends Pharmacol Sci 2002；2325-32)。表1.抗血栓形成药物抗血小板药 抗凝血药第一代阿司匹林肝素噻氯匹定(力抗栓)、氯吡格雷 法华林第二代GPIIb/IIIa拮抗剂低分子量肝素阿司匹林-氯吡格雷混合剂 水蛭素新方法vWF-GPIb相互作用抑制剂 组织因子-VIIa因子途径抑制剂胶原-血小板相互作用抑制剂 选择性因子Xa抑制剂凝血酶诱导的活化抑制剂 选择性凝血酶抑制剂ADP受体拮抗剂 人活化蛋白C释放NO的抗血小板物质可溶性重组血栓调节素缩写GP，糖蛋白；vWF，yon Willebrand因子血小板膜表面糖蛋白Ibα(GpIbα)与vWF的结合引起的血小板与受损血管内皮的粘附，在初期止血和血小板血栓形成中起着至关重要的作用。血小板膜表面存在有多种糖蛋白，其中GPIbα是血管假性血友病因子(vonWillebrand factor，vWF)凝血酶、P-选择素、Mac-1、XII因子和高分子量激肽原的受体，在非活化血小板表面就已表达。GPIbα的分子量约为135000，每个细胞表面大约有30,000个分子，主要分布于血小板、巨核细胞中，属富亮氨酸糖蛋白重复片段(LGR)家族，由610个氨基酸组成，GPIbα与vWF结合区位于GPIbα的氨基端(1-302氨基酸)。血小板粘附于血管内皮下组织涉及三个因素GPIb，vWF及内皮下组织；在血液循环中，血小板并不粘着在血管壁上，也不同其他细胞发生相互作用，而是在近管壁的流层流动；当血管受损时，内皮下组织暴露，血小板迅速粘着于暴露的内皮下组织参与止血反应的第一步。GPIbα是参与粘附作用的主要粘附受体，参与多种生理和病理过程，包括在血管损伤处的黏附，与凝血酶的结合，Bernard-Soulier综合症(BSS)或称巨血小板综合征，血小板型血友病及免疫性血小板减少等(Chester Q.Li，etal.Expression of the Amino-Terminal Domain of Platelet Glycoprotein IbαExploitation of a Calmodulin Tag for Determination of Its FunctionalActivity.Protein Expression and Purification 200122200-210)。正常情况下血小板不能与血管内皮组织结合，血管受损后，vWF首先结合于内皮下胶原纤维，以致vWF发生构型改变，此时血小板GPIb即与vWF结合活化血小板，发挥粘附作用，同时释放ADP，提高胞质中钙离子浓度，活化钙离子依赖的GPIIb-IIIa，暴露出纤原受体，一个纤原可以同时和至少两个GPIIb-IIIa结合，导致血小板的黏附和聚集(Goto S，et al.Distinct mechanisms of platelet aggregationas a consequence of different shearing flow conditions.J Clin Invest.1998.101479)，形成白色血栓(Sugimoto M，et al.Functional property of vonWillebrand factor under flowing blood.Int J Hematol 2002.7519-24；RuggeriZM.Von Willebrand factor.Curr Opin Hematol 2003.10142-149)。这一过程如图1所示。GPIb和vWF的相互作用对血小板黏附、聚集而后形成血栓起着关键的作用，因而，许多研究致力于以二者为靶点的新的抗血栓药物的研制和开发。血栓的治疗可通过以下两条途径抑制vWF和GPIb的相互作用来实现(1)封闭血小板上的GPIbα；(2)特异性结合vWF。目前国外研究的vWF-GPIb相互作用抑制剂有6B4单抗的F(ab’)2片段(GPIb抗体)(Cauwenberghs N.et al.Antithrombotic effect of plateletglycoprotein Ib-blocking monoclonal antibody Fab fragments in non humanprimates.Arterioscler Thrombo Vasc BIol 2000.201347-1353)、AjvW2单抗(GPIb抗体)(Kageyama S.et al.Antinuman yon Willebrand factor monoclonal antibodyAjvW-2 prevents thrombus deposition and neointima formation after ballooninjury in guinea pigs.Arterioscler Thrombo Vasc BIol 2000.202303-2308)、重组vWF片段VCL(Gralnick HR.et al.A monomeric von Willebrand factor fragment，Leu504-Lys728，inhibits von Willebrand factor interavtion with glycoproteinIb-IX.Proc Natl Acad Sci 1992.897880-7884)、重组vWF片段AR545C(GurevitzO.et al.Recombinant von Willebrand factor fragment AR545C inhibits plateletaffregation and enhances thrombolysis with rtPA in a rabbit thrombosis model.Arterioscler Thrombo Vasc BIol 1998.18200-207)和黄酮类化合物(Murk JS.etal.Flavone-8-acetic acid(flavonoid)profoundly reduces platelet-dependentthrombosis and vasoconstriction after deep arterial injury in vivo.Circulation 2000.101324-328)等。基于GPIbα在血小板膜上分布相对较多，并且在血小板与血管壁粘附作用和血栓形成中起着至关重要的作用，使得GPIbα成为研究血小板相关药物的重要靶点之一。目前制备的许多GPIb抗体在体外稳定或者流动条件下都能有效的发挥抑制作用。在两例以豚鼠为动物模型的体内研究成功的报道中，6B4和AjvW2证实能够在不明显延长出血时间的情况下延长小动脉血管血栓形成的时间。在另一例豚鼠模型中，PG-1抗体可以有效的减少激光损伤处的血栓形成，但这个抗体虽然能够特异性的结合豚鼠血小板却不能与人血小板发生交叉反应。另有研究数据表明，TGX-6B4 Fab段抑制剂能够与GPIbα氨基端(His1-Val289)抗原决定簇结合，阻断瑞斯托霉素或布妥霉素诱导的血小板聚集。重要的是在治疗剂量，这个抗体能够抑制血小板的粘附而不发生严重的血小板减少症，同时没有延长出血时间。TGX-6B4的进一步研制有可能提供一种抗血栓形成的辅助用药。总的来说，GPIb抗体到目前为止还不理想，部分可能是由于种属的不同，例如，鼠抗人单抗长期应用会产生人抗鼠抗体反应，因此限制了6B4和AjvW2在人体的应用，也可能是由于二价抗体与GP1b分子交联导致严重的血小板减少症造成的。另一方面，由于大量数据表明血浆vWF水平的升高与血栓栓塞性疾病的发生有关，所以很多研究致力于研究VWF分子GPIb结合区的重组片段及VWF的抑制剂。重组vWF片段VCL(Leu504-Lys728)和AR545C(Ala444-Asp730)可与GPIb结合，而且这两个片段的抗栓剂量对于出血时间只有轻微的延长。由此可以看出，其他膜蛋白如GPIa/IIa和GPIIb-IIIa等，都参与了血栓的形成。由于这种GPIb抑制剂阻止血小板黏附，延缓血栓形成，但不阻止血栓形成，因此需要与阿司匹林或溶栓药合用。由于vWF是由内皮细胞和巨核细胞产生的一种糖蛋白，在内皮细胞受到刺激时释放入血浆，故血浆vWF水平的升高可作为内皮细胞受损的标志。已有大量数据证实多种血管病变，如糖尿病的血管病变，血浆vWF水平升高，vWF可与GPIb、GPIIb-IIIa、凝血因子VIII、纤维连接蛋白、胶原结合，促进血小板在内皮下的黏附，诱导血小板的聚集，促进血栓形成。因此，对血浆vWF水平升高这一类的血管病变，重组vWF片段的作用有限。
Plaimauer B等(Plaimauer B.et al.Cloning，expression，and functionalcharacterization of the von Willebrand factor-cleaving protease(ADAMTS13).Blood 2002.1003626-3632)克隆了vWF裂解蛋白酶(ADAMTS13)的基因，并在HEK293细胞中进行了表达，在体外可裂解vWF多聚体，并可被血栓性血小板减少性紫癜患者的血浆(含有该酶的抑制剂，IgG)所抑制。但该酶的抗栓作用还未得到证实。
发明创造内容本发明的目的是提供一种以vWF为作用靶点的抑制血栓形成的药物。
本发明所提供的抑制血栓形成的药物，它的活性成分是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
SEQ ID №2的氨基酸残基序列，名称为重组血小板糖蛋白rGP302，由324个氨基酸残基组成，包括血小板糖蛋白GPIbα的vWF结合域，可与vWF结合。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为0.1μg-1000mg/kg/day疗程为10至30天。
本发明的第二个目的是提供一种重组血小板糖蛋白rGP302的编码基因。
重组血小板糖蛋白rGP302的编码基因，是下列核苷酸之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码SEQ ID №2的氨基酸残基序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1109个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第17位到第1105位碱基，包含1089个碱基。
重组血小板糖蛋白rGP302与血浆中和内皮下的vWF结合后，可使vWF不能与血小板上的GPIb结合，从而阻断血小板在内皮下的黏附。同时vWF与GPIIb-IIIa的结合也会受到影响，并进一步影响血小板的聚集功能，从而达到防止血栓形成的目的。实验表明，体外可溶性rGP302能够抑制瑞斯托菌素诱导的血小板凝集，延长凝血时间，血小板聚集率由对照的100％降低至13％。
本发明为血栓性疾病的预防和治疗提供了一种新的思路和方法，从而为进一步的理论研究和制备新型抗血栓药物奠定了基础，具有重要的意义。


图1为血小板黏附和聚集过程的示意2为GPIbα的vWF因子结合域的cDNA的RT-PCR的电泳3为真核表达质粒pcDNA3.1(+)图4为真核表达质粒pSecTaq2/HygroB图5为鉴定真核表达质粒pGP302的电泳6为可溶性rGP302的dot blot结果图7为可溶性rGP302的Westernblot结果图8a为Ristocetin诱导的血小板聚集曲线图8b为CHO-空载体表达蛋白血小板聚集曲线图8c为CHO-pGP302重组蛋白的血小板聚集曲线
实施例1、重组血小板糖蛋白rGP302的制备重组血小板糖蛋白rGP302的制备，包括以下步骤1、设计引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’为便于基因定向插入表达载体pcDNA3.1(+)(Invitro公司产品)，在上游引物中引入BamH I酶切位点序列，在下游引物中引入EcoR I酶切位点序列。
2、自人红白血病细胞系TF-I细胞株(CRL-2003 Homo sapiens(human)TF-1)中提取细胞总RNA。
3、利用下述的上、下游引物，以提取的细胞总RNA为模板利用RT-PCR钓取GPIbα的全长cDNA，上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3。
4、以GPIbα cDNA为模板，用步骤1合成的上、下游引物，PCR法克隆GPIbαvWf因子结合域的cDNA，如图2所示，其中带1显示GPIbαvWF因子结合域，带2是核酸分子量Mark2000，1000，750，500，250，100bp；该步骤中PCR的条件是50μl总反应体系中，依次加入dNTP至终浓度0.2mM，MgCl2至终浓度2.5mM，加入上下游引物至终浓度为0.4μM，加入0.5μg模板，10×RT-PCR缓冲液5μl，Taq酶1μl(5U/μl)。在PE-2400型PCR仪上按下述条件扩增94℃，5Min；94℃，45s，60℃，45s，72℃，延伸1Min，共30个循环；再在72℃，延伸7Min。
5、将GPIbαvWf因子结合域的cDNA克隆至质粒T-Vector(Promega公司产品)，由上海博亚生物工程公司测定其序列正确，其序列如序列表中SEQ ID №1。
6、以BamH I和EcoR I双酶切将目的片段自T-Vector切下，回收目的片段，插入与经BamHI和EcoR I双酶切处理后的真核表达质粒pcDNA3.1(+)(其图谱如图3所示)构建pcDNA3.1-GP302，经鉴定正确。
7、真核表达质粒pGP302的构建以pcDNA3.1-GP302真核表达载体为模板，设计了一对含有Hind III或Not I的两条引物引物I 5’-GCAAGCTTCACCCCATCTGTGAGGTC引物II 5’-GAGCGGCCGCGGCTTTGGTGGGGAACTT将GP302基因插入真核表达载体pSecTaq2/HygroB(如图4，含有6个纯化标签His6和检测标签c-myc)中，构建了真核表达质粒pGP302。真核表达质粒pGP302经HindIII/NotI酶切鉴定，结果如图5所示，表明所构建的质粒结构正确。
8、将pGP302用脂质体法转染COS-7以及CHO细胞，培养72小时收集细胞培养上清，SDS-PAGE显示有新生蛋白带出现。用c-myc抗体和GPIb单抗做点印迹以及Westernblot，结果如图6和图7所示，表明表达的特异性重组蛋白质为可溶性rGP302。图6中，1为CHO表达上清，2为CHO-pGP302表达上清，3为CHO-p空载体表达上清；图7中，1，3为GP302重组蛋白，2为CHO培养上清。
9、将细胞系在含10％胎牛血清的培养基中培养至细胞80％满底，以无血清的培养基洗细胞，并在无血清培养基中培养24小时，收集含rGP302的上清液；10、收集后的上清液以镍亲合柱纯化，得到rGP302，其氨基酸序列为SEQ ID №2。
实施例2、rGP302的抑制凝血效果从健康人采集全血按1∶10与3.14％的柠檬酸钠混合，100g离心15分钟收集富含血小板的上清(PRP)，以无血小板的血清(PPP)调节血小板浓度为300×106/ml。将浓度为0.5mg/ml的rGP302先与PRP在室温孵育5分钟后，将瑞斯托菌素加入PRP中至终浓度为1.5mg/ml，在血小板聚集仪上测定10分钟凝集率，结果如图8a，8b和图8c所示，表明体外可溶性rGP302能够抑制瑞斯托菌素诱导的血小板凝集，延长凝血时间，血小板聚集率由对照的100％降低至13％。
序列表<160>2<210>1<211>1109<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1ctggctagcc accatggaga cagaeacaet cctgctatgg gtactgctgc tctgggttcc 60aggttccact ggtgacgcgg cccagccggc caggcgcgcg cgccgtacga agcttcaccc 120catctgtgag gtctccaaag tggccagcca cctagaagtg aactgtgaca agaggaatct 180gacagcgctg cctccagacc tgccgaaaga cacaaccatc ctccacctga gtgagaacct 240cctgtacacc ttctccctgg caaccctgat gccttacact cgcctcactc agctgaacct 300agataggtgc gagctcacca agctccaggt cgatgggacg ctgccagtgc tggggaccct 360ggatctatcc cacaatcagc tgcaaagcct gcccttgcta gggcagacac tgcctgctct 420caccgtcctg gacgtctcct tcaaccggct gacctcgctg cctcttggtg ccctgcgtgg 480tcttggcgaa ctccaagagc tctacctgaa aggcaatgag ctgaagaccc tgcccccagg 540gctcctgacg cccacaccca agctggagaa gctcagtctg gctaacaaca acttgactga 600gctccccgct gggctcctga atgggctgga gaatctcgac acccttctcc tccaagagaa 660ctcgctgtat acaataccaa agggcttttt tgggtcccac ctcctgcctt ttgcttttct 720ccacgggaac ccctggttat gcaactgtga gatcctctat tttcgtcgct ggctgcagga 780caatgctgaa aatgtctacg tatggaagca aggtgtggac gtcaaggcca tgacctctaa 840cgtggccagt gtgcagtgtg acaattcaga caagtttccc gtctacaaat acccaggaaa 900ggggtgcccc acccttggtg atgaaggtga cacagaccta tatgattact acccagaaga 960ggacactgag ggcgataagg tgcgtgccac aaggactgtg gtcaagttcc ccaccaaagc1020cgcggccgct cgaggagggc ccgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc1080cgtcgaccat catcatcatc atcattgag 1109<210>2<211>324<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)<400>2His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn1 5 10 15Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp20 25 30Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu35 40 45Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg50 55 60Cys Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly65 70 75 80Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly85 90 95Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu100 105 110Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu115 120 125Leu Tyr Leu Lys Gly Ash Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu130 135 140Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu145 150 155 160Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr165 170 175Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe180 185 190Gly Ser His Leu Leu Pro Phe Ala Phe Leu His Gly Asn Pro Trp Leu195 200 205Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu Gln Asp Ash Ala210 215 220
Glu Asn Val Tyr Val Trp Lys Gln Gly Val Asp Val Lys Ala Met Thr225 230 235 240Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp Lys Phe Pro Val245 250 255Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly Asp Glu Gly Asp260 265 270Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr Glu Gly Asp Lys275 280 285Val Arg Ala Thr Arg Thr Val Val Lys Phe Pro Thr Lys Ala Glu Glu290 295 300Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His305 310 315 320His His His His32

本发明公开了一种抑制血栓形成的药物。本发明所提供的抑制血栓形成的药物，它的活性成分是SEQ ID №2的氨基酸残基序列，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。重组血小板糖蛋白rGP302编码基因，是下列核苷酸之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码SEQID №2的氨基酸残基序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明为血栓性疾病的预防和治疗提供了一种新的思路和方法，从而为进一步的理论研究和制备新型抗血栓药物奠定了基础，具有重要的意义。