专利名称：使用腈水解酶将腈转化为羧酸的改进的方法腈水解酶在水溶液中直接将腈转化为羧酸铵盐，不生成酰胺的中间体。在很多种微生物中鉴定了腈水解酶，例如，Kobayashi等(四面体(Tetrahedron)465587-5590(1990)；细菌学杂志(J.Bacteriology)，1724807-4815(1990))描述了从胭脂红分枝杆菌(Rhodococcus rhodochrous)K22分离出的脂肪族腈水解酶，它催化脂肪族腈水解成它们相应的羧酸铵盐。有人使用粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)1650的立体特异性腈水解酶在手性羧酸的制备中用来拆分外消旋腈，并且克隆和表达了编码腈水解酶的基因(W000/23577)。有人从嗜热菌苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidus)Dac521菌株分离出腈水解酶，它催化脂肪族、芳香族和杂环腈类的水解(Almatawah等，Extremophiles 3283-291(1999))。有人使用来自胭脂红分枝杆菌(Rhodococcus rhodochrous)NCIMB 40757或NCIMB40833的腈水解酶将丙烯腈转化为丙烯酸铵(U.S.5,998,180)。从睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)分离出的腈水解酶，能将很多脂肪族的α，ω-二腈转化为相应的ω-氰基羧酸铵盐或二羧酸二铵盐(CA 2,103,616；S. Lévy-Schil等，Gene 16115-20(1995))。也有人报道通过敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W的腈水解酶活性将脂肪族的α，ω-二腈区域选择地水解为相应的ω-氰基羧酸铵盐(Gavagan等，J.Org.Chem.，634792-4801(1998))。两种酶的组合，腈水合酶和酰胺酶，能被用来在水溶液中将脂肪族腈类转化为相应的羧酸铵盐。这里首先用腈水合酶将脂肪族腈转化为酰胺，然后接着用酰胺酶将酰胺转化为相应的羧酸铵盐。已知很多细菌属具有不同范围的腈水合酶和酰胺酶活性，它们包括红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，节杆菌属(Arthrobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)，无芽孢杆菌属(Bacteridium)，短杆菌属(Brevibacterium)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，和球菌属(Micrococcus)。Cowan等，(Extremophiles 2207-216(1998))最近综合评述了腈降解微生物的腈水解酶和腈水合酶/酰胺酶这两个体系。2-甲基戊二腈是一个使用生物催化剂能被区域选择地转化为ω-氰基羧酸铵盐(即，4-氰基戊酸的铵盐)的脂肪族的α，ω-二腈的例子。先前在U.S.5,814,508和其部分专利U.S.5,858,736，U.S.5,908,954，U.S.5,922,589，U.S.5,936,114，U.S.6,077,955，和U.S.6,066,490中描述过4-氰基戊酸的生物催化制备。这些专利涉及其中在水溶液中利用具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性，或者腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的组合的催化剂将脂肪族α，ω-二腈转化为ω-氰基羧酸的铵盐的方法。当脂肪族的α，ω-二腈在ω-碳原子处还被不对称取代时，腈水解酶制备从ω-腈基水解得到的ω-氰基羧酸铵盐，区域选择性大于98％。U.S.5,814,508尤其公开了在水溶液中将2-甲基戊二腈转化为4-氰基戊酸的方法，在用作酶催化剂之前将敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W热处理(35-70℃)10-120分钟。这种热处理对于选择期望的区域选择的脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性是关键的，同时破坏不期望的非区域选择的腈水合酶活性。4-氰基戊酸然后在商业制备1，5-二甲基-2-哌啶酮的一步化学方法中被用作底物。1，5-二甲基-2-哌啶酮作为工业溶剂具有很多用途，包括电子清除，感光保护膜剥离，工业去油污和金属清洗，树脂清除，油墨配方，工业粘合剂，和作为用于聚合物和化学品的反应溶剂。对于使用生物催化剂的商业规模的应用，与使用非固定化细胞相比，使用固定化微生物细胞具有很多公知的经济利益。一些利益是它们重复使用的能力，它们容易分离，和它们在连续反应中使用。聚合物基质中的细胞内含物使得活体或代谢失活细胞被截留，同时保持高度产物和底物扩散。固定化典型基质的例子是藻酸钠(Bucke，酶学方法(Methods in Enzymology)135175-189(1987))或角叉菜胶(Chibata等，酶学方法(Methods in Enzymology)135189-198(1987))。截留方法较简单，并且凝胶材料是无毒的和低价的。接着用多官能试剂共价交联细胞的交联剂处理细胞小球能进一步提高固定化细胞的″操作″稳定性，所述交联剂是例如戊二醛和聚吖丙啶或六亚甲基二胺。在一个实施例中，就用于制备L-天冬氨酸的κ-角叉菜胶中固定化大肠杆菌细胞而言研究了稳定性(Chibata，1.固定化微生物细胞(Immobilized Microbial Cells)；Venkatsubramanian，K.，编；第106届ACS研讨会(ACS SymposiumSeries 106)；美国化学会(American Chemical Society)；Washington，DC，1979，pp 187-201)。对于用作交联处理的六亚甲基二胺和戊二醛的最佳浓度，固定化细胞的半寿期显著延长超过没有处理过的固定化细胞的半寿期的五倍。此外，Birnbaum等(生物技术快报(Biotechnol.Lett.)3393-400(1981))公开了提高藻酸钙固定细胞的物理稳定性的方法。一种稳定方法使用聚吖丙啶处理(24小时)，接着用戊二醛交联(15分钟)。通过在0.1M磷酸钠缓冲液中将固定化细胞培育10天检查球稳定性。注意由固定化细胞有极少量细胞释放，从而证明提高的小球完整性。同时，该方案有害影响总的催化剂活性。Birnbaum提出这种作用可能是由于戊二醛的毒性。最后，推断为直接固定整个微生物细胞或微生物细胞材料加入聚吖丙啶和戊二醛的优选顺序取决于固定化酶活性对戊二醛的敏感性。U.S.4,288,552公开了用硫醇反应试剂例如戊二醛将戊二醛敏感酶(例如在酶分子的活性位点内或非常接近酶分子的活性位点带有SH基团的巯基-酶和其他酶)灭活。对于这些类型的酶催化剂，本发明要求首先用聚吖丙啶处理微生物细胞，同时或之后加入戊二醛，以消除可能的酶活性损失。相反，U.S.4,355,105教导期望在固定化微生物(所述微生物的酶对戊二醛不灵敏)时在聚吖丙啶之前加入戊二醛。在这种情况下，与在加入戊二醛之前用聚吖丙啶预处理固定化细胞相比，得到的固定化细胞更容易从含水介质中回收。无论在哪一种情况下，用聚吖丙啶和戊二醛处理之前，微生物细胞都不会截留在凝胶或聚合物基质中。因此，要解决的问题是开发一种当被用作将腈转化为相应的羧酸铵盐的催化剂时具有高比活性和延长的物质完整性时间的固定细胞催化剂的经济制备方法。更具体地，使用导致更高产率和更高浓度的4-氰基戊酸，并且比先前公开的那些用起来更方便的酶催化剂的方法会推进本领域发展。
发明概述申请人的发明是一种制备羧酸的方法，包括a)在藻酸盐中固定一种腈水解酶活性特征的酶催化剂；b)向步骤a)的固定化酶催化剂中加入第一种稳定剂，然后加入第二种稳定剂，每种都以足以交联固定酶催化剂的量和时间加入，第一种稳定剂和第二种稳定剂分别选自戊二醛和聚吖丙啶，前提是第二种稳定剂是除了第一种稳定剂之外的；c)在合适的含水反应混合物中使步骤b)的产物接触腈；和d)分离盐形式或酸形式的步骤c)中制备的羧酸。
任选地，步骤c)和d)可以重复。本发明优选的实施方案包括步骤c)的腈是2-甲基戊二腈；步骤c)的含水反应混合物在反应期间含有比例大于20∶1(更优选大于200∶1，最优选大于750∶1)的NH4+∶Ca2+之比；步骤d)中分离出的羧酸是4-氰基戊酸。
优选的酶催化剂是敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W(ATCC55746)，敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72-PF-15(ATCC 55747)，敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72-PF-17(ATCC 55745)，大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)SS1001(ATCC PTA-1177)，或大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)SW91(ATCC PTA-1175)，并且酶催化剂是全细胞或可渗透微生物细胞形式。当酶催化剂是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)时，不需要通过在其固定在藻酸盐中之前热处理将酶催化剂的腈水合酶活性灭活。
生物保藏材料的简要描述申请人根据布达佩斯条约进行了下面生物材料的保藏
如这里使用的，″ATCC″指位于10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-1109，U.S.A.的美国典型培养物国际保藏中心(American Type Culture Collection InternationalDepository)。″ATCC No.″是ATCC保藏培养物登记号。列出的保藏物在所指出的国际保藏中心保存至少三十年(30)，经公开它的专利授权对公众是可以得到的。保藏物的可用性不构成在政府行为准予的专利权部分废除的情况下实施本发明的许可。
本发明的详细描述本发明涉及使用具有腈水解酶活性的酶催化剂将腈转化为相应的羧酸铵盐的改进的方法。更具体地，本发明使用具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性的酶催化剂在水溶液中将2-甲基戊二腈转化为4-氰基戊酸的铵盐。申请人现在公开了有可能用戊二醛和聚吖丙啶交联之后在藻酸钙中固定具有腈水解酶活性的酶催化剂，使用得到的催化剂在预期导致交联的固定化酶催化剂物理完整性的快速损失的条件下以至少1.50M的浓度制备4-氰基戊酸铵盐。没有意料到的是加入PEI之前对固定细胞进行戊二醛处理没有任何测量到的腈水解酶活性损失，或者当建议不超过20∶1比例时，以至少750∶1的铵/钙离子之比操作反应不会影响催化剂小球的物理完整性。在很多连串循环反应中连续使用酶催化剂不损失物理完整性。
申请人另外公开了随着催化剂小球中细胞干重浓度的增加，戊二醛/聚吖丙啶交联藻酸盐固定酶催化剂的腈水解酶活性提高(与使用角叉菜胶制备的相应的酶催化剂相反)。使用藻酸盐固定化酶催化剂的好处在于当与角叉菜胶固定化酶催化剂相比较时以催化剂使用为基础，它提高总的产品产率。
申请人另外公开在固定化酶催化剂敏捷食酸菌72W情况下，当细胞固定在藻酸盐中并且得到与稳定剂戊二醛和聚吖丙啶交联的酶催化剂时，不需要一般要求灭活不期望的腈水合酶活性的热处理。出人意料的是固定化方法会选择性地并且完全地灭活不期望的腈水合酶活性，不产生可测量到的腈水解酶活性损失，特别是当已知戊二醛能灭活腈水解酶的时候。
当与先前已知的方法相比较时，这里公开的改进的方法在比先前获得的浓度更高的浓度下获得更高产率的产物(以每份重量催化剂的产物的重量计)。权利要求的方法的产物用作在农业和制药业中价值高的聚合物，溶剂(例如，1，5-二甲基-2-哌啶酮)，和化学品的母体。
在本申请中，除非另外具体说明，使用下面的缩写和定义″戊二醛″缩写是GA。
″聚吖丙啶″缩写是PEI。
″2-甲基戊二醛″缩写是2-MGN。
″4-氰基戊酸″缩写是4-CPA。
″酶催化剂″指特征在于腈水解酶活性的催化剂。酶催化剂是全微生物细胞或可渗透微生物细胞形式。
″含水反应混合物″用来指一种含水混合物，含有水，至少2mM浓度的钙盐，和任选地，能将反应初始pH保持在5和10之间，优选6和8之间的缓冲液。
″含水产物混合物″用来指含有由相应的方法步骤得到的产物的含水混合物。
现在公开了用于将2-甲基戊二腈(2-MGN)转化为4-氰基戊酸(4-CPA)铵盐的方法的显著改进。具体地说，本发明的显著改进来自具有下面步骤的方法1)将优选来自敏捷食酸菌72W的特征在于腈水解酶活性的酶催化剂在藻酸盐中固定化，2)以合适的量向固定化酶催化剂中依次加入戊二醛和聚吖丙啶(优选以这个顺序)所用时间足以进行各稳定剂的交联，3)在合适的含水反应混合物中使2-MGN接触交联的固定化酶催化剂，4)分离作为酸或铵盐的4-CPA，和5)交联的固定化酶催化剂再循环至少一次。为了将腈转化为相应的羧酸铵盐使用特征在于腈水解酶活性的其它酶催化剂(例如，胭脂红分枝杆菌(Rhodococcus rhodochrous)，粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，嗜热菌苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidus)，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，红球菌属(Nocardia sp.)，不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，和节杆菌属(Arthrobacter sp.)时也能够实现本发明的优点。
酶催化剂的固定化作用使用两种不同的聚合物基体，藻酸钠和κ-角叉菜胶，实施将酶催化剂固定化的方法。全细胞或可渗透微生物细胞形式的酶催化剂能被固定在藻酸盐或角叉菜胶中；渗透化的方法对于本领域技术人员是公知的，包括但不限于，冷冻-熔化，或者用有机溶剂或洗涤剂处理(Felix，Bioprocess.Technol.11259-278(1991)；Felix，Anal.Biochem.120211-234(1982))。细胞在藻酸盐中固定化是有利的，因为该固定化作用在像5℃这样低的温度下进行。相反，角叉菜胶固定化作用一般需要45-50℃的温度，这能导致腈水解酶失活。
向固定化作用方案中增加戊二醛(GA)和聚吖丙啶(PEI)处理，进一步提高小球的机械稳定性，这样它们能够胜任催化剂再循环的多次连续反应。为交联藻酸盐小球酶催化剂而加入的GA和PEI的量分别是催化剂小球中存在的每细胞干重25wt％，至催化剂小球中存在的每细胞干重2wt％，其中加给催化剂小球的GA与PEI之比范围是3∶1至1∶3。加给固定化酶催化剂的两种交联稳定剂的顺序是下面的任何一种首先GA，然后PEI，或者首先PEI，然后GA。加入两种交联稳定剂的优选顺序是首先GA，接着PEI。第二种稳定剂的加入延迟一段时间，足以允许第一种稳定剂的交联。固定化酶催化剂的GA-交联时间范围自5分钟至2h，优选30分钟至1h。固定化酶催化剂的PEI交联时间范围自30分钟至24h，优选1h至12h。
未知而且出人意料的是GA/PEI的组合会成功地稳定固定化细胞催化剂而对腈水解酶的比活性没有损害，因为已知戊二醛灭活敏捷食酸菌72W腈水解酶(实施例1)。在Cowan等，(Extremophiles 2207-216(1998))中公开了腈水解酶提供激活巯基残基对腈碳原子的亲核进攻而发挥功能；U.S.4,288,552指出戊二醛灭活戊二醛-灵敏酶，例如硫醇-酶。
有人报道过钙交联的藻酸盐在高浓度的其它阳离子存在下不稳定。具体地说，不推荐超过20∶1或25∶1的铵/钙离子之比(Klein，J.和Vorlop，K.D.，生物技术聚焦1(Biotechnology Focus1)；Finn，R.F.，Ed.；牛津大学出版社New York；1998，pp 325-336；Smidsrod等，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)8，71-78(1990))。Klein等阐述，对于藻酸盐与高比例的L-古洛糖醛酸，电介质(Na+，K+，NH4+，Mg2+的摩尔总和)与Ca2+之比应该不大于20∶1。在本发明的应用中，用戊二醛和聚吖丙啶交联之后，藻酸盐凝胶酶催化剂(其含有高比例的L-古洛糖醛酸)，当在制备高浓度的4-氰基戊酸铵盐的至少195次连续间歇式反应中再循环时保持它们的物理完整性。在含有最小钙离子浓度是2mM的这些反应中，铵离子和钙离子的比例一般至少是750∶1(参见实施例4)。这些反应在铵离子和钙离子的比例是200∶1,750∶1，和950∶1下进行。这些结果当然没有被预示过。
当进行商业方法时，期望具有高比活性，这里定义为酶活性/催化剂重量。在本发明应用中，腈水解酶的比活性随着藻酸盐小球中细胞干重浓度的增加而提高，但是在角叉菜胶小球中则不是这样。对于角叉菜胶小球，或者活性有小幅度提高(7％)，30℃下细胞干重增加50％，或者在35℃下比活性稍有降低(参见实施例4)。
敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)在戊二醛/聚吖丙啶交联藻酸盐中的固定化先前从暴露给脂肪族腈或二腈类的土壤样品中分离出敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(U.S.5,814,508及其部分专利U.S.5,858,736，U.S.5,908,954，U.S.5,922,589，U.S.5,936,114，U.S.6,077,955，和U.S.6,06 6,490)。(U.S.5,814,508在此引作参考)。当敏捷食酸菌72W被用作用于不对称取代的α-烷基-α，ω-二腈水解的微生物全细胞催化剂时，除了期望的ω-氰基羧酸之外生成相应的二羧酸一酰胺和二羧酸。这种全细胞催化剂的不期望的非区域选择性腈水合酶活性产生不期望的二羧酸一酰胺，酰胺酶将其进一步转化为相应的二羧酸。酶催化剂例如敏捷食酸菌72-PF-15，敏捷食酸菌72-PF-17，大肠杆菌SS1001和大肠杆菌SW91，它们的特征在于敏捷食酸菌72W的腈水解酶活性但是不具有敏捷食酸菌72W的腈水合酶活性，不产生不期望的二羧酸一酰胺和二羧酸副产物。
发现在合适的缓冲液中在35-70℃下将敏捷食酸菌72W(ATCC55746)的悬浮液短时间加热灭活不期望的腈水合酶活性而不影响期望的腈水解酶活性。因此，特别高区域选择性地将2-甲基戊二腈(2-MGN)水解为4-氰基戊酸(4-CPA)铵盐的先前的方法要求在35-70℃下将敏捷食酸菌72W的悬浮液加热处理以灭活不期望的腈水合酶活性并且消除不期望的副产物2-甲基戊二酸的产生(Gavagan等，微生物技术应用(Appl.Microbiol.，Biotechnol.)，52654-659(1999)；U.S.5,814,508)。这种热处理不产生任何腈水解酶活性损失，并且还在制备固定化细胞催化剂中常规使用。
用于商业生产4-氰基戊酸的本发明提供的另一个好处是在藻酸盐中没有热处理的敏捷食酸菌72W细胞的固定化去除了大约90％的不期望的腈水合酶活性。接着戊二醛(GA)或戊二醛和聚吖丙啶(GA/PEI)交联藻酸盐固定化的敏捷食酸菌72W细胞进一步将由催化剂产生不期望的副产物(2-甲基戊二酸)的生产率减小至对热处理过的细胞所发现的那样，并且没有可检测的腈水合酶活性(参见实施例10)。申请人的公开是令人惊奇的和出乎意料的，因为此前U.S.5,814,508中要求的热处理步骤不再是需要的。未知的是，在藻酸盐中将敏捷食酸菌72W细胞固定化，接着进行GA或GA/PEI-交联，将选择性地并且完全地灭活不期望的腈水合酶活性，同时不引起可检测到的期望的腈水解酶活性的损失。这个结论是特别出人意料的，因为戊二醛灭活腈水解酶是公知的。
2-甲基戊二腈的水解选择水解反应的温度使得反应速率和酶催化剂活性的稳定性都最佳。反应温度范围可以自刚高于悬浮液的凝固点(大约0℃)至60℃，反应温度的优选范围是5℃至35℃。通过将催化剂悬浮于蒸馏水中，或者反应初始pH保持在5.0和10.0之间，优选6.0和8.0之间的缓冲液水溶液中，可以制备固定化酶催化剂悬浮液。随着反应的进行，反应混合物的pH由于从二腈相应的腈官能度形成羧酸的铵盐而可以变化。不控制pH，或者在反应过程中能加入合适的酸或碱以保持期望的pH，能够进行反应完成二腈的转化。以至少2mM的浓度向水解反应加入钙盐，包括但不限于氯化钙或醋酸钙，以保持交联固化的酶催化剂的物理完整性。
通过用浓盐酸调节反应混合物的pH在2.0和2.5之间，用氯化钠饱和得到的溶液，并且用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯，乙醚，或二氯甲烷)萃取4-氰基戊酸，也可以从产物混合物(去除催化剂之后)分离出4-氰基戊酸。然后合并有机提取物，与合适的干燥剂(例如硫酸镁)一起搅拌，过滤，并且去除溶剂(例如，通过旋转蒸发)，以高产率和高纯度(一般98-99％纯)制备期望的产物。如果期望，通过重结晶或蒸馏能进一步纯化产物。或者，可以在一个接着发生的反应中直接使用4-氰基戊酸铵盐，如1，5-二甲基-2-哌啶酮的制备情况一样(U.S.5,814,508及其部分专利U.S.5,858,736，U.S.5,908,954，U.S.5,922,589，U.S.5,936,114，U.S.6,077,955和U.S.6,066,490)。
实施例在下面的实施例中，它们是为了进一步详细说明本发明而不是限制本发明，2-甲基戊二腈的回收率％和微生物水解反应期间形成的水解产物4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的产率％以反应混合物中存在的2-甲基戊二腈的初始量为基础(除非另有说明)，并且利用折射指数检测器和Supelcosil LC-18-DB柱(15cm×4.6mm直径)通过HPLC检测，洗脱剂由10mM乙酸，10mM醋酸钠，和7.5％(v/v)甲醇水溶液构成。
缩写意义如下″sec″意思是秒，″min″意思是分钟，″h″意思是小时，″d″意思是天，″μL″意思是微升，″mL″意思是毫升，″L″意思是升，″mm″意思是毫米，″nm″意思是纳米，″mM″意思是毫摩尔，″M″意思是摩尔，″mmol″意思是毫摩尔，″μmole″意思是微摩尔，″g″意思是克，″μg″意思是微克，″ng″意思是纳克，″U″意思是单位，和″dcw″意思是细胞干重。
实施例1用戊二醛灭活敏捷食酸菌72W腈水解酶实施例1详细描述戊二醛对腈水解酶活性的毒性。
从细胞提取液分离出敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈水解酶，并且通过Q-Sepharose离子交换介质接着在Hiload 16/60Superdex 200柱子上凝胶过滤，精制达＞90％纯度。在纯化过程中通过监测苄腈转化为苯甲酸的速率监测腈水解酶活性，如根据100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)中5mM苄腈溶液在245nm下吸收度的增加所指示的。纯化过的酶的腈水解酶活性是25.7U/mg蛋白质。当在戊二醛(0.10M)存在下进行酶分析时，腈水解酶的比活性降低至6.65U/mg，酶活性损失74％。
实施例2敏捷食酸菌72W在藻酸钙中的固定化作用实施例2详细描述未交联的和GA/PEI-交联的藻酸钙中敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞的固定化作用。
快速搅拌下，向装有磁性搅拌棒并且含有50℃的22.9g蒸馏过的去离子水的100-mL培养瓶中缓慢加入1.10g的FMC BioPolymerProtanal?LF 10/60藻酸盐。快速搅拌下将混合物加热至75-80℃直到藻酸盐完全溶解，并且在水浴中将得到的溶液冷却至25℃。将0.15M乙酸钠缓冲液(16mL总体积，pH7.0)中敏捷食酸菌72W的悬浮液(50％细胞湿重，11.5％细胞干重)加热至50℃15分钟，然后冷却至25℃，并且在搅拌下加至25℃的藻酸盐溶液。在搅拌下用注射器将细胞/藻酸盐混合物滴加至213mL的25℃的0.20M醋酸钙缓冲液(pH7.0)。搅拌2h之后，从得到的小球倾析出缓冲液，将它重新悬浮于25℃的84mL of 0.20M醋酸钙缓冲液(pH7.0)。搅拌下，加入0.88g的25wt％戊二醛(GA)水溶液，并且在25℃下混合小球1.0h。然后向悬浮液加入3.5g的12.5wt％聚吖丙啶(PEI)(BASF Lupasol＜b PR971 L，重均分子量大约750,000)水溶液，在25℃下再混合小球1h。然后用25℃的84mL的0.20M醋酸钙缓冲液(pH7.0)将交联的小球洗涤两次，在5℃下在相同的缓冲液中贮存。
通过上述方法制备没有交联的小球，除了不向0.20M醋酸钙缓冲液中的小球悬浮液加入GA和PEI。
实施例3用干制备4-氰基戊酸的未交联和GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W细胞/藻酸盐小球催化剂之比较实施例3详细描述在连续间歇式反应中GA/PEI-交联催化剂小球比没有交联的小球以更高收率产生4-氰基戊酸。
向独立的两个125-mL夹套反应器(用循环温度浴将温度控制在30℃)加入16.5g的未交联的或者根据实施例2所述制备的GA/PEI-交联的敏捷食酸菌72W细胞/藻酸盐小球。向各反应器加入68.25 mL蒸馏过的去离子水，1.0mL的0.50M醋酸钙缓冲液(pH7.0，反应混合物中最终钙离子浓度是5.0mM)和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二醛，并且在30℃下搅拌混合物。反应混合物样品(0.100mL)与0.400mL的水混合，然后将0.360mL稀释的样品与水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外标)和0.020mL的6.0N HCl混合。过滤各容器中的得到的混合物(0.22μm)，并且用HPLC对滤液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。对于未交联的和GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W细胞/藻酸盐小球，4-氰基戊酸的制备速率分别是193mM/h和198mM/h。2-甲基戊二腈完全转化时，在各反应器中，4-氰基戊酸铵盐和2-甲基戊二酸二铵盐的产率一般分别是98.5％和1.5％。
反应结束时，从催化剂小球倾析出产物混合物。在如上所述条件下这些小球又在11次连续间歇式反应中重新使用。如表1所示，对于未交联的和GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W细胞/藻酸盐小球来说，反应12中4-氰基戊酸的制备速率分别是64mM/h和118mM/h。每套11次循环反应完全时，4-氰基戊酸的最终浓度至少是1,550mM。
表1
实施例4钙离子浓度对用于制备4-氰基戊酸的GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W细胞/藻酸盐小球催化剂的影响实施例4详细描述在高浓度铵离子存在下制备GA/PEI-交联藻酸盐小球催化剂能更稳定。这项发现与现有技术相反(Klein，J.和Vorlop，K.D.，生物技术聚焦1(In Biotechnology Focus 1)；Finn，R.F.，编著；牛津大学出版社New York；1998，pp 325-336)。
分别向三个125-mL夹套反应器(用循环温度浴将温度控制在30℃)加入16.5g如实施例2所述制备的GA/PEI-交联的敏捷食酸菌72W细胞/藻酸盐小球。向各反应器加入68.25mL蒸馏过的去离子水，和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二腈。然后向三种反应混合物的每一种分别加入a)1.0mL的0.50M醋酸钙缓冲液(pH7.0)，b)0.20M醋酸钙(pH7.0)，或c)蒸馏水，使得三种反应混合物中最终钙离子浓度分别是5.0mM，2.0mM，或0mM。在30℃下搅拌混合物。反应混合物样品(0.100mL)与0.400mL的水混合，然后0.360mL稀释的样品与水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外标)和0.020mL的6.0N HCl混合。过滤得到的混合物(0.22μm)，并且用HPLC对滤液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。含有5mM，2mM，或0mM钙离子的反应中4-氰基戊酸的制备速率分别是236mM/h，233mM/h，和232mM/h。
2-甲基戊二腈完全转化之后，从催化剂小球倾析出产物混合物。测定催化剂重量并且在如上所述条件下这些小球又在10次连续间歇式反应中重新使用。各组循环反应中，2-甲基戊二腈完全转化之后，4-氰基戊酸的最终浓度至少是1,550mM，由于从前面的反应保留了反应剩余物(催化剂加产物混合物)。表2给出了各组反应中回收的催化剂的重量。
表2
重复上述一套三个反应，除了三个反应混合物中醋酸钙的浓度分别是2.0mM，1.0mM，和0.5mM。在用催化剂再循环又进行10次反应之后，含有0.5mM醋酸钙的反应中的催化剂小球破碎，反应混合物含有显著量的颗粒物质。含有1.0mM醋酸钙的反应中的催化剂小球在催化剂再循环的第十二次反应中开始破碎，18次反应之后催化剂破碎并且反应混合物含有显著量的颗粒物质。含有2.0mM醋酸钙的反应中的催化剂小球不破碎，用催化剂再循环进行60次之多的连续反应之后，反应混合物中没有显著产生颗粒物质，。
实施例5大肠杆菌转化体SS1001细胞在角叉菜胶中的固定化作用实施例5详细描述大肠杆菌转化体SS1001(ATCC PTA-1177)细胞在角叉菜胶中的固定化作用。
快速搅拌下向250-mL培养瓶(装有磁性搅拌棒并且含有50℃的64.12g蒸馏过的去离子水)缓慢加入3.38g的FMC BioPolymerISAGEL?RG 300角叉菜胶。快速搅拌下将混合物加热至75-80℃，直到角叉菜胶完全溶解，在自动调温器水浴中将得到的溶液冷却至55-56℃(凝胶化温度大约52℃)。将0.35M磷酸氢钠缓冲液(45mL总体积，pH7.3)中大肠杆菌转化体SS1001(ATCC PTA-1177)的悬浮液(12.5％细胞干重)加热至50℃12分钟，然后搅拌下加至55-56℃的角叉菜胶溶液。使用高架的搅拌器在搅拌下将细胞/角叉菜胶混合物立即缓慢加至50℃的450mL豆油中。通过控制搅拌速率在油中产生期望大小的细胞/角叉菜胶液滴之后，将油的温度降至35℃使液滴凝胶化，从得到的小球倾析出油，将其用0.10M碳酸氢钾缓冲液(pH7.3)洗涤。将小球的20-克部分重新悬浮于48.8mL的0.10M碳酸氢钾缓冲液(pH7.3)中，并且加入水中0.25g的25wt％戊二醛，并且在25℃下将小球混合1.0h。然后向混合物加入水中1.0g的12.5wt％聚吖丙啶(BASF Lupasol PR971 L，重均分子量大约750,000)，小球在25℃下再混合1小时。然后用50mL的0.30M碳酸氢铵(pH7.3)在25℃下洗涤交联的小球，并且在5℃下在相同的缓冲液中贮存。
实施例6用于制备4-氰基戊酸的未交联和GA/PEI-交联大肠杆菌SS1001/角叉菜胶小球催化剂之比较实施例6详细描述在连续间歇式反应中GA/PEI-交联角叉菜胶小球比没有交联的小球以更高生产率产生4-氰基戊酸。
向独立的两个125-mL夹套反应器(用循环温度浴将温度控制在30℃)加入12.375g的未交联的或者根据实施例6所述制备的GA/PEI-交联的大肠杆菌SS1011(ATCC PTA-1177)/角叉菜胶小球。向各反应器加入51.9mL蒸馏过的去离子水，其中含有20mM碳酸钾缓冲液(pH7.0)和10.71mL(10.17g，1.25M)的2-甲基戊二醛，并且在30℃下搅拌各混合物。反应混合物样品(0.100mL)与0.400mL的水混合，然后0.360mL稀释的样品与水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外标)和0.020mL的6.0N HCl混合。过滤得到的混合物(0.22μm)，并且通过HPLC对滤液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。对于未交联的和GA/PEI-交联大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)/角叉菜胶小球，4-氰基戊酸的制备速率分别是254mM/h和310mM/h。2-甲基戊二腈完全转化时，在各反应器中，4-氰基戊酸铵盐和2-甲基戊二酸二铵盐的产率一般分别是98.8％和1.2％ 。
反应结束时，从催化剂小球倾析出产物混合物。在如上所述条件下这些催化剂小球又在11次连续间歇式反应中重新使用。表3说明对于未交联的和GA/PEI-交联大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)/角叉菜胶小球来说，反应4中4-氰基戊酸的制备速率分别是120mM/h和290mM/h。
表3
实施例7敏捷食酸菌72W细胞在角叉菜胶中的固定化作用实施例7详细描述敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞在角叉菜胶中的固定化作用。
快速搅拌下，向(装有磁性搅拌棒并且含有50℃的64.12g蒸馏过的去离子水的)250-mL培养瓶中缓慢加入3.38g的FMC BioPolymerISAGEL?GR 300角叉菜胶。快速搅拌下将混合物加热至75-80℃直到角叉菜胶完全溶解，并且在自动控制温度水浴中将得到的溶液冷却至55-56℃(凝胶化温度大约52℃)。将0.35M磷酸氢钠缓冲液(45mL总体积，pH7.3)中的敏捷食酸菌72W细胞的悬浮液(12.5％细胞干重)加热至50℃60分钟，然后在搅拌下加至55-56℃的角叉菜胶溶液。使用高架的搅拌器在搅拌下将细胞/角叉菜胶混合物立即缓慢加至50℃的450mL豆油中。通过控制搅拌速率在油中产生期望大小的细胞/角叉菜胶液滴之后，将油的温度降至35℃使液滴凝胶化，从得到的小球倾析出油，将其用0.10M碳酸氢钾缓冲液(pH7.3)洗涤。将小球的20-克部分重新悬浮于48.8mL的0.10M碳酸氢钾缓冲液(pH7.3)中，并且加入水中0.25g的25wt％戊二醛，并且在25℃下将小球混合1.0h。然后向混合物加入水中1.0g的12.5wt％聚吖丙啶(BASFLupasol PR971 L，重均分子量大约750,000)，小球在25℃下再混合1小时。然后用50mL of 0.30M碳酸氢铵(pH7.3)在25℃下洗涤交联的小球，并且在5℃下在相同的缓冲液中贮存。
也用0.30M碳酸氢铵(pH7.3)在25℃下洗涤没有加入戊二醛的没有交联的小球，并且在5℃下在相同的缓冲液中贮存。
实施例8制备4-氰基戊酸的未交联和GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W/角叉菜胶小球催化剂之比较实施例8详细描述在连续间歇式反应中GA/PEI-交联角叉菜胶小球比没有交联的小球以更高生产率产生4-氰基戊酸。
向独立的两个125-mL夹套反应器(用循环温度浴将温度控制在30℃)加入16.5g的未交联的或者根据实施例7所述制备的GA/PEI-交联的敏捷食酸菌72W/角叉菜胶小球。向各反应器加入72.1mL蒸馏过的去离子水，其中含有50mM碳酸钾缓冲液(pH7.0)和11.40mL(10.83g，1.0M)的2-甲基戊二醛，并且在30℃下搅拌混合物。反应混合物样品(0.100mL)与0.400mL的水混合，然后0.360mL稀释的样品与水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外标)和0.020mL的6.0N HCl混合。过滤得到的混合物(0.22μm)，并且通过HPLC对滤液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。对于未交联的和GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W/角叉菜胶小球，4-氰基戊酸的制备速率分别是266mM/h和235mM/h。2-甲基戊二腈完全转化时，在各反应器中，4-氰基戊酸铵盐和2-甲基戊二酸二铵盐的收率分别是98.5％和1.5％。
反应结束时，从催化剂小球倾析出产物混合物。如上所述又在9次连续间歇式反应中重新使用催化剂小球。表4说明对于未交联的和GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W/角叉菜胶小球来说，反应9中4-氰基戊酸的制备速率分别是144mM/h和200mM/h。
表4
实施例9在GA/PEI-交联藻酸盐或角叉菜胶小球中固定化的敏捷食酸菌72W细胞作为制备4-氰基戊酸的催化剂之比较实施例9详细描述腈水解酶的比活性随着藻酸盐小球催化剂中细胞干重浓度的增加而提高，但是在角叉菜胶小球催化剂中则不是这样。
向独立的两个125-mL夹套反应器加入a)16.5g固定化敏捷食酸菌72W催化剂小球和68.25g蒸馏过的去离子水，或者b)22g固定化敏捷食酸菌72W催化剂小球和62.75g蒸馏过的去离子水。催化剂选自GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W细胞/藻酸盐小球(根据实施例2描述的方法制备)或GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W细胞/角叉菜胶小球(根据实施例5描述的方法制备)。用5％细胞干重(dcw)或7.5％dcw捷食酸菌72W细胞制备催化剂小球。对于7.5％dcw催化剂小球，用来交联小球使用的GA和PEI的量增加两倍，来制备完全交联的催化剂。向各反应器立即加入1.0mL的0.20M醋酸钙缓冲液(pH7.0)和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二腈，并且在30℃或35℃下搅拌各反应混合物，同时用循环温度浴保持温度。反应混合物样品(0.100mL)与0.400mL的水混合，然后0.360mL稀释的样品与水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外标)和0.020mL的6.0N HCl混合。过滤得到的混合物(0.22μm)，并且通过HPLC对滤液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。表5列出在相同的反应条件下使用两种催化剂在反应进行中4-氰基戊酸制备的反应速率和催化剂比活性表5
实施例104-氰基戊酸(铵盐)的制备实施例10详细说明在藻酸盐中固定化敏捷食酸菌72W去除大约90％的不期望的腈水合酶活性。另外，GA或GA/PEI的加入去除附加的不期望的腈水合酶活性。制备4-氰基戊酸的现有技术要求对细胞的热处理步骤以去除不期望的腈水合酶活性(上文所述U.S.5,814,508和它的部分专利)。
重复实施例2中的程序，制备三种分开的敏捷食酸菌72W/藻酸盐小球催化剂，除了在与藻酸盐溶液混合之前不在50℃下将敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞悬浮液热处理15分钟。在固定化作用之前使用0.3M 2-甲基戊二腈在25℃下测定细胞的腈水解酶和腈水合酶/酰胺酶活性，2-甲基戊二酸(2-MGA，细胞的腈水合酶/酰胺酶活性的产物)的制备速率是4-氰基戊酸(4-CPA)的制备速率的34％。关于根据实施例2所述制备的加热过的细胞悬浮液来说，2-甲基戊二酸的制备速率一般是4-氰基戊酸的制备速率的1.5％。对于三组制备的催化剂，1)一组敏捷食酸菌72W/藻酸盐小球没有用GA或PEI交联，2)第二组只用GA交联，3)第三组用GA和PEI交联。
向三个分开的125-mL夹套反应器(用循环温度浴将温度控制在35℃)加入16.5g的如上所述制备的三种催化剂之一。然后向各反应器加入68.25mL蒸馏过的去离子水，1.0mL的0.20M 醋酸钙缓冲液(pH7.0，反应混合物中最终钙离子浓度是2.0mM)和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二腈，并且在35℃下搅拌混合物。反应混合物样品(0.100mL)与0.400mL的水混合，然后0.360mL稀释的样品与水中0.040mL的0.75M N-甲基丙酰胺(HPLC外标)和0.020mL的6.0N HCl混合。过滤得到的混合物(0.22μm)，并且通过HPLC对各滤液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。使用没有GA或PEI交联的敏捷食酸菌72W/藻酸盐小球的2-甲基戊二酸的制备速率是4-氰基戊酸的制备速率的3.6％，降低34％(表6)。只有GA交联的敏捷食酸菌72W/藻酸盐小球的2-甲基戊二酸的制备速率是4-氰基戊酸的制备速率的1.7％，使用GA和PEI交联的敏捷食酸菌72W/藻酸盐小球的2-甲基戊二酸的制备速率是4-氰基戊酸的制备速率的1.5％。
表6
实施例11用于4-氰基戊酸制备的GA/PEI-交联大肠杆菌SS1001/藻酸盐小球催化剂在反应混合物中使用2mM醋酸钙，使用用于4-氰基戊酸制备的GA/PEI-交联大肠杆菌SS1001/藻酸盐小球催化剂重复其中使用GA/PEI-交联敏捷食酸菌72W SS1001小球催化剂的实施例3中的反应。
195次连续催化剂再循环之后，反应速率是初始反应速率的67％，催化剂小球的物理完整性没有显著损失。


本发明涉及使用腈水解酶催化剂从相应的腈制备羧酸的改进的方法。更具体地，本发明使用具有腈水解酶活性的，在藻酸盐中固定化的，并且用戊二醛和聚吖丙啶交联的酶催化剂在水溶液中将2－甲基戊二腈转化为4－氰基戊酸。