专利名称:新的水解酶蛋白的制作方法(1S,2S)-1_烷氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸为对正在作为丙型肝炎治疗药开发的各种HCV NS3蛋白酶抑制剂等的制备有用的中间体。在非专利文献I中记载有将2-こ烯基环丙烷-1,I- ニ甲酸ニ甲酯通过酶水解,制得(1S,2S)-I-甲氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的方法,但酶的光学选择性不足,制得的(1S,2S)-1-甲氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的光学纯度为90% e. e.,不适合作为药品中间体的エ业制备方法。另外,枯草芽孢杆菌subtilis) ATCC23857的基因组序列众所周知,源于该枯草芽孢杆菌ATCC23857株的对硝基苄基酯酶(以下有时称为“PNBE23857”)的氨基酸序列登记于GenBank登录号ZP_03593235中。先前技术文献 非专利文献 非专利文献 I :c. Fliche 等,Synth. Commun. 24(20), 2873-2876 (1994)。
发明所要解决的课题 本发明所要解决的课题在于,提供用于将2-こ烯基环丙烷-1,I-ニ甲酸ニ烷基酯通过酶水解,有效制得可用作丙型肝炎治疗药制备用中间体的(1S,2S)-I-烷氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸的新的水解酶蛋白。解决课题的手段 本发明人为解决上述课题而深入研究的结果发现源于枯草芽孢杆菌的对硝基苄基水解酶蛋白可以良好的选择性水解2-こ烯基环丙烷-1,I-ニ甲酸ニこ酷,有效制得(IS, 2S)-1-こ氧基羰基-2-こ烯基环丙烷甲酸。另外,当根据已知的源于枯草芽孢杆菌的对硝基节基水解酶蛋白的DNA序列/[目息,克隆近未的枯草芽抱杆菌所具有的对硝基节基水解酶基因,确认该基因所编码的对硝基苄基水解酶蛋白的活性时,成功获得以高于已知的对硝基苄基水解酶蛋白的选择性催化上述水解反应的新的同源物。此外,当根据对硝基节基水解酶蛋白的已知的立体结构信息,进行上述新的同源物的同源建模(homologymodeling),进行相对于底物结合部位附近的氨基酸残基的诱变试验时,成功制备以更高的选择性催化上述水解反应的水解酶蛋白。本发明基于上述见解完成。即,根据本发明,提供以下发明。[I]水解酶蛋白,所述水解酶蛋白包含如序列号2 5的任一项所示氨基酸序列,具有以高于包含如序列号I所示氨基酸序列的蛋白质的选择性催化如式(I)所示反应的活性
本发明的课题在于提供用于将2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯通过酶水解,有效制得可用作丙型肝炎治疗药合成中间体的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的新的水解酶。根据本发明,可提供包含如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列,具有以高于包含如序列号1所示氨基酸序列的蛋白质的选择性,催化由2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二乙酯向(1S,2S)-1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的反应的活性的水解酶蛋白。
新的水解酶蛋白制作方法
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