重组Exendin-4鼻腔喷雾剂及其制备方法[0002] 糖尿病是一种世界性疾病，全球患者达3.66亿，目前中国已超9200万，其中90%为2-型糖尿病。Exendin-4是从希腊毒蜥中分离一种含39氨基酸残基的多肽，与肠促胰岛素GLP-1有53%的同源性。它通过葡萄糖依赖的促胰岛素分泌、改善胰岛细胞质量、抑制胰高血糖素分泌、减缓胃排空等机制维持血糖浓度。2004年美国Amylin公司首先申请了化学合成Exendin-4的专利,商品名exenatide ;其注射液于2005年在美国上市,2009年5月在我国上市，商品名百泌达。目前百泌达医生处方已超过740万张，它能有效降低2-型糖尿病患者空腹及餐后血糖浓度、糖化血红蛋白含量、改善脂代谢，同时减少低血糖发生及体重增加的风险，减少心血管病发生。作为一种治疗2-型糖尿的新药，Exendin-4将给使用口服降糖药不能取得良好效果的患者带来福音。[0003]目前Exendin-4主要采用化学合成,市价高达7000元/mg。本实验室不仅选育了重组Exendin-4高产工程菌(发明专利:ZL 200810049811.5)，探索了重组Exendin-4中试技术，还优化了重组 Exendin-4 纯化工艺(ZL 200810049810.0, ZL 200910172667.9)，使重组Exendin-4成本降至每毫克2.6元。目前临床上Exendin-4采用皮下注射给药,给病人带来了很多不便和痛苦，为了简化其给药方式，本实验室对重组Exendin-4的鼻腔给药途径进行了研究。[0004]蛋白质及多肽药物鼻腔给药限制因素很多，首先是蛋白质及多肽在药剂体系中的稳定性，即在使用状态下蛋白质及多肽在一定的时间如10-15天内不降解；其次是蛋白质及多肽药物的生物利用度，鼻腔粘膜对进出膜的分子具有选择性，这些大分子不容易透过鼻腔粘膜；第三是给药的准确性及对鼻腔粘膜的安全性。由于上述因素的限制，目前鼻腔给药成功的蛋白质及多肽药物，全球只有一种，即鲑鱼降钙素(含32个氨基酸残基的多肽)，有3家公司的鲑鱼降钙素鼻喷雾剂上市，生物利用度达50%。[0005]鼻腔给药进入血液中的剂量因个体差异，没有注射的药物精确，但Exendin-4是依赖于血糖浓度起作用，进入药量不准确，如多一点不会出现低血糖情况，少一点可以加大剂量，非常安全。
[0006]本发明的目的是提供重组Exendin-4鼻喷雾剂的配方及使用方法，用该配方能获得药物稳定性好、生物利用度高的重组Exendin-4鼻喷雾剂。[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
本发明的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂,每100 ml制剂中含:
10-100 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂0.01 mg防腐剂 加缓冲液至100 ml,
所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80?
[0008]所述的粘膜渗透强化剂为壳聚糖。
[0009]所述的防腐剂为苯扎氯铵。
[0010]本发明的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂的制备方法，包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室温配制，灭囷后保存；
(2)将防腐剂加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；
(3)将粘膜渗透强化剂溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节pH为4，然后加入上述缓冲液至终质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10-50mg/ml,然后用缓冲液定容,原药浓度为0.1-lmg/ml ο
[0011]配好的重组Exendin-4鼻喷雾制剂置于4°C保存。
[0012]本发明的有益效果:含1%壳聚糖，鼻喷剂量是注射的5倍时，血浆中重组Exendin-4浓度在给药后I小时内比肌肉注射高约20%，2_6小时内是注射的2_70倍，鼻喷雾剂的生物利用度达40%以上，鼻喷雾剂药效长。而且鼻喷雾剂给药血浆中Exendin-4浓度高峰比肌肉注射提前45分钟，说明使用粘膜渗透强化剂壳聚糖更利于重组Exendin-4进入血液。重组Exendin-4鼻喷剂生物利用度高，说明2-型糖尿病治疗除了肌肉注射外，可以利用更加简便有效的鼻腔喷雾的给药物方式；进入血液比注射快，使其作为药物使用时能快速有效降低糖尿病患者的餐后血糖含量。

[0013]实施例1用于临床前动物实验
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床前动物(如兔子，体重2 Kg)实验，每100 ml制剂中含:
10 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01 mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100 ml,
所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0014]其制备制备方法，包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室温配制，灭囷后保存；
(2)将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；
(3)将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节PH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10mg/ml,然后用缓冲液定容，原药浓度为0.lmg/ml。[0015]实施例2用于临床前动物实验
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床前动物(如兔子，体重2 Kg)实验，每100 ml制剂中含:
20 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01 mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100 ml,
所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0016]其制备制备方法，包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室温配制，灭囷后保存； (2)将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；
(3)将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节PH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10mg/ml,然后用缓冲液定容，原药浓度为0.2 mg/ml。
[0017]实施例3用于临床前动物实验
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂，用于临床前动物(如兔子，体重2 Kg)实验，每100 ml制剂中含:
30 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01 mg防腐剂苯扎氯铵
加缓冲液至100 ml,
所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0018]其制备制备方法，包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室温配制，灭囷后保存；
(2)将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；
(3)将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节PH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度10mg/ml,然后用缓冲液定容，原药浓度为0.3 mg/ml。
[0019]实施例4用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂,用于临床研究(60-80kg体重,每100 ml制剂中含:
40 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01 mg防腐剂苯扎氯铵 加缓冲液至100 ml,所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0020]其制备方法包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室温配制，灭囷后保存；
(2)将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；
(3)将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节PH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml,然后用缓冲液定容，原药浓度为0.4 mg/ml。
[0021](5)使用时采用在4°C保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100 μ I。
[0022]实施例5用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂,用于临床研究(60-80kg体重,每100 ml制剂中含:
60 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂壳聚糖 0.01 mg防腐剂苯扎氯铵 加缓冲液至100 ml,
所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0023]其制备方法包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室温配制，灭囷后保存；
(2)将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；
(3)将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节PH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml,然后用缓冲液定容，原药浓度为0.6 mg/ml ο
[0024](5)使用时采用在4°C保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100 μ I。
[0025]实施例6用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂,用于临床研究(60-80kg体重,每100 ml制剂中含:
80 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01 mg防腐剂苯扎氯铵 加缓冲液至100 ml,
所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0026]其制备方法包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80，室温配制，灭囷后保存；
(2)将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；(3)将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节PH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml,然后用缓冲液定容，原药浓度为0.8 mg/ml。
[0027](5)使用时采用在4°C保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100 μ I。
[0028]实施例7用于临床
本实施例的重组Exendin-4鼻腔喷雾剂,用于临床研究(60-80kg体重,每100 ml制剂中含:
40 mg 重组 Exendin-4
I mg粘膜渗透强化剂壳聚糖
0.01 mg防腐剂苯扎氯铵 加缓冲液至100 ml,
所述的缓冲液组成为20mM Tr1-Cl, ρΗ6.0，含0.8%的NaCl及0.1%的Tween-80。
[0029]其制备方法 包括如下步骤:
(1)基本缓冲液配制:20mMTr1-Cl，ρΗ6.0，含 0.8% 的 NaCl 及 0.1% 的 Tween-80,室温配制，灭囷后保存；
(2)将防腐剂苯扎氯铵加入上述缓冲液，质量体积浓度为0.01% ；
(3)将粘膜渗透强化剂壳聚糖溶于0.5%的盐酸溶液中使其质量体积浓度为4%，然后调节PH为4，然后加入上述缓冲液至质量体积浓度1% ；
(4)原药浓度:将冷冻干燥的重组Exendin-4用去离子水稀释至储液浓度50mg/ml,然后用缓冲液定容，原药浓度为0.4 mg/ml。
[0030](5)使用时采用在4°C保存15天的小包装如50ml，每次每个鼻孔喷100 μ I。
[0031]本发明重组Exendin-4鼻喷雾制剂的稳定性及生物利用度鉴定。
[0032](I)稳定性鉴定:依据蛋白质鼻喷雾制剂的使用方法，一般保存在冰箱的4°C冷藏室。我们对PH5.0至7.0的一系列鼻喷雾制剂的稳定性进行了鉴定。每隔3天从不同pH值得鼻喷雾制剂取20 μ I样品，变性后，利用Ticin-SDS-PAGE鉴定重组Exendin-4的降解程度。发现pH6的鼻喷雾制剂稳定性最好,在4°C保存15天时,重组Exendin-4约为对照的60% (见图1)。而且每天喷26ug(200ul)，连续I个月对日本大耳白兔鼻喷实验结果表明，该鼻喷雾制剂对兔子鼻腔无刺激性，兔子生长正常。
[0033](2)生物利用度测定:
本研究利用3月龄日本大耳白兔子进行了重组Exendin-4鼻喷雾制剂生物利用度测定。兔子皮下注射重组Exendin-4剂量为2.6 μ g/Kg,给药200 μ I。鼻喷重组Exendin-4剂量为13μ g/Kg，每个鼻孔各喷100 μ I。耳缘静脉取血每次抽0.2ml，血样于4°C、3200rpm离心10min,上清于-80°C保存备用。利用Exendin-4 EIA试剂盒(型号:s_1297, Bachem)及Multiskan GO型酶标仪测定血衆中重组Exendin-4浓度。利用0rigin8.0软件来处理数据，利用SPSS 18.0分析血浆中重组Exendin-4浓度，利用DAS 2.0软件分析药代动力学特征。结果表明含1%壳聚糖的重组Exendin-4鼻喷雾制剂于给药后25min血衆Exendin-4中重组达到高峰，皮下注射于给药后Ihr达到高峰；鼻腔给药比皮下注射药效快。其次，含1%壳聚糖的重组Exendin-4鼻喷雾制剂可以较长时间在血液中维持一定的浓度，生物利用度高达40%以上(见图2)。[0034] 本实验室在大量实验基础上确定了重组Exendin-4鼻喷雾剂缓冲成分、pH值、吸收促进剂，给药体积、给药剂量，与注射方法相比，重组Exendin-4鼻喷雾剂的生物利用度达40%以上，而且血浆中Exendin-4高峰比注射提前45分钟。