专利名称：短时间高温处理生成具有抗炎谱的微生物制品的制作方法短时间高温处理生成具有抗炎谱的微生物制品本发明一般地涉及微生物领域。特别地，本发明涉及受高温处理的微生物(例如，益生菌(probiotics)和乳品起子)，和这些细菌的应用。本发明的一个实施方案涉及受高温处理的微生物(例如，益生菌和乳品起子)，和它们制备组合物以治疗或预防炎性病症的用途。益生菌经常被定义为“当以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活微生物”(FA0/WHO指南)。因此，绝大多数公开的文献涉及活的益生菌。然而，若干研究调查了由非复制型细菌递送的健康益处且它们多数表明了益生菌的失活，例如，通过热处理，导致损失了它们声称的健康益处(Rachmilewitz, D.等人，2004, Gastroenterology 126 :520-528 ；Castagliuolo 等人，2005，FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43 :197-204 ；Gill, H. S.和K. J. Rutherfurd,2001, Br. J. Nutr. 86 :285-289 ；Kaila, M.等人，1995，Arch. Dis. Child72:51-53.)。然而一些研究显示了杀死的益生菌可保留一些健康作用(Rachmilewitz，D.等人，2004，Gastroenterology 126 :520-528 ；Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd，2001 ，Br. J. Nutr. 86 :285-289)。已经在文献中报道并且最近由Dotan等人综述(Dotan, I.和D. Rachmilewitz. 2005 ；Curr. Opin. Gastroentero1. 21 :426-430)益生菌作为治疗或预防炎性肠病的策略的用途。例如，已经显示了八株活的益生细菌(VSL#3)的高度浓缩的混合物在预防(Gionchetti，P.，等人，2003，Gastroenterology 124 :1202-1209)和治疗人类中复发的或难治的隐窝炎(Gionchetti, P,等人，2000, Gastroenterology 119 :305-309 ；Mimura, T.，等人，2004, Gut53 =108-114)中是有效的。令人感兴趣地，使用DSS诱导的结肠炎的鼠模型，Rachmilewitz等人(Rachmilewitz, D.,等人，2004, Gastroenterology 126 :520-528)报道了用活的和受Y照射的VSL#3但是并不热杀菌的VSL#3治疗防御结肠炎。相似地受热杀菌的卷曲乳杆菌(L. crispatus)不能防御DSS诱导的结肠炎而它的活的对应物明确地降低了体重减少和肠中MPO 活性(Castagliuolo,等人，2005,FEMS TmmunoI. Med. Microbiol. 43 :197-204) 这些研究表明在肠炎症环境中活的益生菌比它们的非复制型的对应物更有效。发现失活的路氏乳杆菌(L. reuteri)(受热杀菌和Y照射的)不能够降低TNF a诱导的T84细胞的IL-8生产而它的活的对应物表现出显著的有益作用(Ma，D.，等人，2004，Infect. Immun. 72 :5308-5314)。明显地，失活的益生菌更容易处理(例如，在食品工业中)和/或贮藏。因此，令人鼓舞地看到失活的益生菌对消费者也可具有有益作用，但同时令人失望地看到，与活的益生菌相比，通常发现这些作用被降低或甚至被消除。在文献中描述的使得益生菌株成为非复制型的技术通常为热处理、Y照射、UV光或化学剂(福尔马林、低聚甲醛)。几乎没有任何研究对比不同失活方法在获得的非复制型细菌的生物功能上的作用。除了以上引用的Rachmilewitz的研究之外,一个此类的研究报道受热处理和Y照射的细菌体外诱导上皮细胞的不同水平的细胞因子分泌(Wong，C.和Z.Ustunol. 2006. J. Food Prot. 69 :2285-2288)。然而，在文献中描述和测试的使得益生菌株成为非复制型的技术一般不能应用或不容易在工业环境，特别是食品工业中实施。在它们的生产过程中，当今市场上的多数含有益生菌的产品被热处理。因此，在益生菌保持或提高它们的有益的性质或甚至获得对消费者新的有益的性质的同时，能够与生产的产品一起或至少以相似的方法热处理益生菌将是方便的。然而,在文献中使用的 用来使细菌失活的热处理通常为在从40至100°C不同温度下的长时程处理(从20分钟到I小时或更长)，不容易在工业规模实施。另外，在本领域中此类热处理通常导致益生菌活性的至少部分损失。在工业规模中不使用长时程热处理但是普遍地使用短时程热处理，例如UHT-样热处理。这类热处理减少细菌负荷，并且减少加工时间，从而减少营养物质的损坏。因此期望能够从活的微生物(例如益生细菌或乳品起子)获得微生物细胞制品，所述活的微生物能够以在制造过程中与产品相同的一般地热处理方式受热处理并且生成或改善健康益处例如预防和/或治疗炎性病症。因此本发明的一个目的是为本领域提供包含微生物(例如益生细菌或乳品起子)的组合物，所述微生物能够受工业地热处理以降低活的细菌细胞并且由于这个热处理生成或改善健康益处。本发明人惊讶地发现他们能够通过独立权利要求的主题达到这个目标。附属权利要求进一步发展了本发明。发明人第一次展示了不论它们初始的性质，由高温短时间热处理的微生物(例如益生菌株或乳品起子)表现了抗炎的免疫谱。特别地通过此热处理发展新的抗炎谱或加强现有的抗炎谱。因此通过使用特定的热处理参数，现在可能生成具有抗炎免疫谱的非复制型微生物，所述热处理参数对应于一般的工业可应用的热处理，即使活的对应物是非抗炎菌株。对于若干微生物，例如对于益生菌的代表乳杆菌和双歧杆菌以及对于乳品起子培养物已经观察到这个作用。非复制型益生微生物在以下方面具有优势它们比它们的活的对应物处理起来容易得多。另外地，它们更加储藏稳定并且需要更少严格的包装条件。非复制型益生微生物将允许开发多种产品，所述产品由于其本性而不允许在没有额外的保护它们的措施下加入活的益生菌。这在例如供应压缩干粮、果汁、UHT-饮料、贮藏稳定的饮料等中起作用。另外，例如在严重免疫损伤的消费者中，由于患菌血症的潜在危险在特殊情形中活益生菌的使用可受限制。在这里发明人提出生成具有抗炎谱的非活性的细菌的方法，不论它们的初始免疫谱。额外地，非复制型益生微生物的提供允许例如粉状营养组合物的热重构，同时维持了对消费者患者的健康益处。就发明人所知，尚未报道使用短时间高温处理以生成具有抗炎谱的非复制型细菌因此，本发明的一个实施方案是包含微生物的组合物，其中对微生物进行至少71. 5 °C的高温处理至少I秒。微生物优选地为食品等级微生物。如果它被批准用于人或动物消费，微生物为食品等级的。在一个实施方案中，微生物可为益生菌。为了本发明的目的，定义益生菌为“对宿主的健康或安康具有有益作用的微生物细胞制品或微生物细胞组分”(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人“Probiotics howshould they be defined” Trends Food Sci. Technol. 1999 :10 107-10)。在另一个实施方案中,微生物可为乳 品起子培养物。优选地，对微生物进行在约71. 5_150°C达约1-120秒的短时程高温处理。更优选地，对微生物进行在约90_140°C，例如90_120°C，达约1_30秒的短时程高温处理。在本发明的一个实施方案中，此高温处理使得微生物至少部分成为非复制型。“非复制型”微生物包括微生物，例如益生细菌和乳品起子培养物，所述微生物已被热处理。这包括失活的、死亡的、非活的和/或以片段例如DNA、代谢物、细胞质复合物、和/或细胞壁物质存在的微生物。“非复制型”意为没有活细胞和/或菌落形成单位能够由经典的平板培养法检出。此类经典的平板培养法总结于微生物学书中James Monroe Jay, Martin J. Loessner,David A. Golden. 2005. Modern food microbiology.第7版，Springer Science,New York,N. Y. 790p。一般地，能够按如下示出活细胞不存在在琼脂平板上没有可见的菌落或在用不同浓度的细菌制品(“非复制型”样品)接种和在适当条件(需氧和/或厌氧环境至少24小时)孵育之后液体生长培养基中没有增加的浊度。可在正常大气压力但也可在高压力下实施高温处理。一般的压力在从I到50巴范围内，优选地从I到10巴，更为优选地从2到5巴。明显地，加热时，优选在培养基中热处理益生菌，所述培养基为液体或固体。应用的理想的压力将因此取决于提供微生物的组合物的本性和使用的温度。在约71. 5_150°C，优选地约90_120°C，更为优选地约120_140°C的温度范围内可实施高温处理。可实施高温处理达约1-120秒，优选地约1-30秒，更为优选地约5-15秒的短时程。此给出的时间框架指微生物(例如益生菌和乳品起子培养物)在给出的温度的处理时间。需注意的是，取决于提供微生物的组合物的本性和量以及取决于使用的加热装置的构造，热应用的时间可不同。然而一般地，通过高温短时间(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或超高温处理(UHT)来处理本发明的组合物和/或微生物。UHT处理是超高温加工或超热处理(两者都缩写为UHT)，涉及通过大约1_10秒，温度超过135°C (275 T )短时间加热组合物的至少部分灭菌，所述温度是杀死奶中的细菌芽孢所必需的。例如，使用超过135°C温度用这种方法加工奶使得在必要持续时间内(至2-5秒)降低细菌负荷，使能够连续流操作。有两种主要类型的UHT系统直接和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽注射或蒸汽输注处理产品，而在间接系统中，使用平板热交换器、管状热交换器或刮面热交换器热处理产品。可在产品制备方法中的任一步骤或多个步骤中应用UHT系统的组合。HTST处理如下定义(高温/短时间)巴氏灭菌法设计达到5-log减少，杀死在奶中活的微生物数量的99. 9999%。对于破坏几乎全部酵母、霉菌和常见的腐败细菌认为这是足够的，并且也保证常见病原性热抗性生物的足够的破坏。在HTST方法中加热奶至71. 70C (161 0F )达 15-20 秒。巴氏瞬间灭菌法是易腐的饮料(像水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品)的热巴氏灭菌法的方法。它先于装入容器中完成，为的是杀死腐败微生物，以使得产品更安全以及延长它们的贮存期限。液体在71. 50C (160 T )到74V (165 T )温度达约15到30秒处理的同时以受控制的连续流移动。为了本发明的目的，术语“短时间高温处理”应包括例如高温短时间(HTST)处理、UHT处理、和巴氏瞬间灭菌法。一旦通过高温短时间处理成为非复制型，获得的非复制型益生菌将展示如上讨论的提高的或新的益处。 任何量的如上讨论的非复制型微生物将会是有效力的。然而，普遍地优选，如果至少90 %，优选地，至少95 %，更优选地至少98 %，最优选地至少99 %，理想地至少99. 9 %，最理想地全部益生菌为非复制型。在本发明的一个实施方案中全部微生物为非复制型。全部微生物可用在本发明的框架内使用。优选地，微生物为食品级别的。典型的食品级别的微生物为益生菌。优选地，使用益生菌并且其可选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、念珠菌属(Candida),或其混合物。例如益生菌可选自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),和 / 或其混合物乳品起子培养物可选自丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，和其混合物。实施高温处理(例如，在约71. 5-1500C )达约1-120秒的短时间是必要的。此处理可施用于活的和/或非活的益生菌。可实施多于一个高温处理(例如，在约71. 5-1500C )达约1-120秒的短时间。在本发明的一个实施方案中益生菌选自双歧杆菌属、乳杆菌属和埃希氏菌属(Escherichia)或其组合。双歧杆菌的典型实例为长双歧杆菌、短双歧杆菌或乳双歧杆菌。乳杆菌的典型实例为类干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。埃希氏菌属的典型实例为声称具有健康益处的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株。在本发明的一个实施方案中，乳品起子培养物为嗜热链球菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。此外，例如，益生菌可选自长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、类干酪乳杆菌NCC 2461、干酪乳杆菌NCC 4006、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、嗜酸乳杆菌NCC 3009、大肠杆菌Nissle 1917，或其组合。 此外，例如，乳品起子可选自嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)NCC 15 和乳酸乳球菌 NCC 2287。全部菌株在布达佩斯条约下保藏如下长双歧杆菌 NCC 3001: ATCC BAA-999长双歧杆菌 NCC 2705: CNCM1-2618短双歧杆菌 NCC 2950 CNCM1-3865乳双歧杆菌 NCC 2818: CNCM1-3446类干酪乳杆菌NCC 2461: CNCM1-2116鼠李糖乳杆菌 NCC 4007: CGMCC 1.3724嗜热链球菌 NCC 2019: CNCM1-1422嗜热链球菌 NCC 2059: CNCM1-4153乳酸乳球菌 NCC 2287: CNCM1-4154干酿乳杆菌 NCC 4006: CNCM1-1518干酪乳杆菌 NCC 1825: ACA-DC 6002嗜酸乳杆菌 NCC 3009: ATCC 700396保加利亚乳杆菌NCC 15: CNCM1-1198 大肠杆菌 Nissle 1917: DSM 6601本发明的组合物包含至少部分地治疗炎性病症和/或它们的并发症的足够量的短时间高温处理的微生物。足够达到此的量被定义为“治疗有效剂量”。对此目的有效的量将依赖于本领域技术人员所知的许多因素例如疾病的严重度和消费者的重量和总体健康状态，并依赖于食物基质的影响。在预防性的应用中，对易感或另外有炎性病症危险的消费者施用足够至少部分地降低患炎性病症的风险的量的根据本发明的组合物。将此类量定义为“预防有效剂量”。再一次，精确的量依赖于许多患者特异性的因素例如患者的健康状态和重量，并依赖于食物基质的影响。本领域技术人员将能够适当地调整治疗有效的剂量和/或预防性有效的剂量。总之，本发明的组合物含有治疗有效剂量和/或预防有效剂量的“短时间高温”处理的微生物。一般地，治疗有效剂量和/或预防有效剂量是每日剂量在约0. 005mg-1000mg非复制型，“短时间高温”处理的微生物范围内。在数量方面，“短时间高温”处理的非复制型微生物可按照对应于IO4和IO12等价的cfu/g干组合物之间的量存在于组合物中。显而易见地，非复制型微生物不形成菌落，因而，此术语理解为从IO4到IO12CfVg的复制型细菌获得的非复制型微生物的量。这包括失活的、非活的或死亡的或以片段例如DNA或细胞壁或细胞质复合物存在的微生物。换句话 说，组合物含有的微生物的量被表示为如同全部微生物是活的时该量微生物的菌落形成能力(cfu)，而不考虑它们是否实际上是非复制型的，例如失活的或死亡的、片段化的或任何或全部这些状态的混合物。优选地，微生物以等价于IO4和109cfu/g干组合物之间的量存在，甚至更优选地以等价于IO5和108cfu/g干组合物之间的量存在。本发明的组合物可为任何种类组合物。例如，可口服、肠内、肠胃外(皮下或肌内)、阴道内、直肠内、局部或眼施用组合物。例如它可为药物组合物、营养品、食品添加剂、化妆品组合物、宠物食品、食品产品，或饮料。根据本发明食品产品包括乳产品，例如发酵的乳产品，例如，酸乳酪(yoghurt)、酪乳(buttermilk),等；冰激凌；浓缩乳；乳；乳制奶油(dairy cream);调味乳饮料；基于乳清的饮料；烧头(toppings);咖啡奶精(coffee creamers);巧克力；基于乳酪(cheese)的产品；汤(soup);调味料(sauce);浓汤(puree);调味品(dressing);布丁(pudding);蛋羹(custard);婴儿食品；营养配方乳(formula)，例如对完全营养的那些，例如对婴儿、儿童、青少年、成人、老人或者危重病人的；谷物和压缩干粮(cereal bar),例如。饮料包括例如基于乳或酸乳酪的饮料、发酵乳、蛋白质饮料、咖啡、茶、能量饮料、大豆饮料、水果饮料和/或蔬菜饮料、水果汁和/或蔬菜汁。化妆品组合物可包括例如洗液(lotion)、香波(shampoo)、滴眼剂、面霜。食物添加剂或药剂例如可为片剂；胶囊剂；锭剂；小药囊；凝胶剂；或液体，例如营养溶液的形式。组合物还可含有组合物可以进一步包含保护性的水状胶体(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、封装剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、辅助化合物、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、口味遮蔽剂、增重剂、成凝胶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗菌齐U。还可以含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任何起源的明胶、植物性树胶、木质素磺酸盐(Iigninsulfonate)、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、芳香剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液、润滑剂、着色剂、湿润剂、填充剂等。此外，组合物可含有适合于口腔或者肠内施用的有机或无机载体物质以及维生素、矿物质痕量元素和根据政府单位推荐的其他微量营养物例如USRDA。取决于组合物的预期用途，本发明的组合物可还包含其他活性剂。例如可使用疼痛或发热缓解剂以帮助使由炎性病症引起的不舒服的感觉最小化。可加入稳定剂以稳定组合物和它的组分。可加入调味剂或着色剂以调整味道和给予组合物颜色，所述颜色容易鉴别和/或令人感觉愉快。可加入益生素。在它们成为非复制型之前，益生素可支持益生菌的生长。益生素也可与存在于组合物中和/或可加入的活的益生细菌协同作用。“益生素”意为在肠中促进有健康益处的微生物和/或益生菌生长的不可消化的食品物质。它们不在胃和/或肠上部被分解或在摄入它们的人的胃肠道中被吸收，但它们由胃肠小型生物群和/或由益生菌发酵。例如由Glenn R. Gibson和Marcel B. Roberfroid,Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125 :1401-1412 定义益生素。根据本发明使用的益生素没有特别的限制，包括促进肠道中的益生菌或健康的有益微生物生长的所有食物物质。优选的，它们可以选自寡糖，任选的含有果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纤维，特别是可溶性纤维、大豆纤维；菊粉；或其混合物。优选的益生素是果糖寡糖(FOS)、半乳糖寡糖(GOS)、异麦芽糖寡糖(IMO)、木糖寡糖(XOS)、阿拉伯-木糖寡糖(AXOS)、甘露糖寡糖(MOS)、大豆的寡糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳糖基蔗糖(LS)、半乳糖苷果糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)寡糖(PAO)、麦芽寡糖、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物。可向组合物加入其他的益生素。额外地可加入全部益生微生物。优选地，为此目的，益生菌可选自双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharoymces)、念珠菌属、埃希氏菌属,特别地选自长双歧杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约汉逊氏乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)，酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomycesboulardii、大肠杆菌和/或其混合物，优选地选自长双歧杆菌NCC 3001 (ATCC BAA-999)、长双歧杆菌NCC 2705 (CNCM 1-2618)、长双歧杆菌NCC 490 (CNCM 1-2170)、乳双歧杆菌NCC2818 (CNCM 1-3446)、短双歧杆菌 NCC 2950 (CNCM 1-3865)、类干酪乳杆菌 NCC 2461 (CNCM1-2116)、约汉逊氏乳杆菌NCC 533 (CNCM 1-1225)、鼠李糖乳杆菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳杆菌 NCC 4007 (CGMCC I. 3724)、屎肠球菌 SF68 (NCC 2768 ；NCIMB10415)，和其混合物。 本发明的组合物可意图用于任何哺乳动物，但是优选地意图用于人或宠物。组合物也可含有在每日饮食中理解为必需的营养显著的量的全部维生素和矿物质。对于某些维生素和矿物质已经建立了最低需要量。任选地存在于组合物中的矿物质、维生素和其他营养物的实例包括维生素A、维生素BI、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钥、牛磺酸和L-肉碱。通常以盐的形式加入矿物质。特定矿物质和其他维生素的存在和量将取决于所针对的消费者而变化。本发明的组合物可含有至少一个蛋白质源、至少一个糖类源以及至少一个脂类源。可使用任何合适的膳食蛋白，例如动物蛋白(例如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)；植物蛋白(例如大豆蛋白、小麦蛋白、稻蛋白，和豌豆蛋白)；自由氨基酸的混合物；或其组合。特别地优选乳蛋白例如酪蛋白和乳清，和大豆蛋白。就乳清蛋白而言，蛋白源可基于酸乳清或甜乳清或其混合物并且可包括任何预期比例的a-乳清蛋白和￠-乳球蛋白。然而优选地，特别是如果组合物是喂养婴儿的配方乳，蛋白质源为基于改性的甜乳清蛋白。甜乳清是容易获得的制备乳酪的副产品并且频繁地用在基于牛乳的婴儿配方乳的生产中。蛋白质可为完整的或水解的或完整的和水解的蛋白质混合物。可期望提供部分水解的蛋白质(水解程度在2和20%之间)。、
如果需要水解的蛋白质，可如预期的且如本领域所知的实施水解过程。例如，可通过一步或多步的酶促水解乳清部分制备乳清蛋白水解物。如果本发明的组合物含有蛋白源，那么在组合物中蛋白质或蛋白质等价物的量一般在I. 6-7. 5g/100kcal组合物的范围内。特别地对于营养配方乳，蛋白质源应该提供达到必需氨基酸含量的最低要求。如果组合物含有糖类源，不特定限制使用的糖类种类。可使用任何合适的糖类，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精、淀粉和其混合物。可使用不同糖类源的组合。优选地糖类可提供组合物能量的30%至80%。例如，组合物可包含9-18g/100kcal组合物的量的糖类源。如果组合物含有脂类源，不特定限制使用的脂类的种类。如果组合物包括脂类源，脂类源可提供组合物能量的5%至70%。可加入长链n-3和/或n-6多聚不饱和脂肪酸，例如DHA、ARA和/或EPA。使用油菜油、玉米油、高油酸向日葵油和中链甘油三酯油的混合物可获得合适的脂类谱。组合物可包含I. 5-7g/100kcal组合物的量的脂类源。也可加入膳食纤维。它们可为可溶的或不可溶的并且总体上优选两类的混合物。合适的膳食纤维源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、果糖寡糖、半乳糖寡糖、唾液酸乳糖和源自动物乳的寡糖。优选的纤维混合物是菊粉和较短链果糖寡糖的混合物。通过任何本领域已知的方法可制备本发明的组合物。例如，如果组合物是营养配方乳(例如喂养婴儿的配方乳)，可通过以适宜的比例将蛋白质源、糖类源，和脂肪源一起混合制备它。如果使用，可在混合物中包括乳化剂。维生素和矿物质可这时候加入，但通常稍后加入以避免热降解。混合之前可将任何亲脂的维生素，乳化剂等溶解入脂肪源中。然后可混入水，优选地受到反渗透的水以形成液体混合物。然后可热处理液体混合物以降低细菌负载。例如，可将液体混合物迅速加热至约120°C到约140°C范围内的温度达约5秒至约30秒。这可通过蒸汽注射或通过热交换器(例如平板热交换器)实施。然后可冷却液体混合物达约60°C至约85°C ;例如，通过瞬间冷却。然后可搅匀液体混合物；例如在两个阶段中，在第一个阶段中约7MPa至约40MPa，在第二阶段中约2MPa至约14MPa。可进一步冷却搅匀的混合物以加入任何热敏感组分；例如维生素和矿物质。此时方便地标准化搅匀的混合物的pH和固体含量。将搅匀的混合物转移到合适的干燥装置(例如喷雾干燥器或冷冻干燥器)并转化为粉末。粉末应该具有少于约以重量计5%的含湿量。
可根据任何合适的方法培养益生菌，并且通过例如冷冻干燥或喷雾干燥可制备用于加入到营养组合物的益生菌。然后在热处理组合物以降低细菌负载之前可向组合物加入益生菌。这将自动地使得益生菌至少部分为非复制型的。备选地，当然，也可単独地短时间高温处理益生菌，并且然后以例如液体或粉末的形式，向组合物中加入作为非复制型的益生菌。可根据任何合适的方法培养ー个或多个选择的益生菌，并且通过例如冷冻干燥或喷雾干燥可制备用于加入到营养组合物的所述益生菌。备选地，能够从特定的供应者购买已经以适于加入到食品产品的形式制备的的细菌制品。通过分析活的和“短时间高温”处理的益生细菌制品的免疫谱，发明人评价益生菌诱导从人血细胞分泌特定的细胞因子的能力。将活的益生菌的免疫谱与“短时间高温”处理的细胞的免疫谱比较。发现“短时间 高温”处理的益生菌比它们的活的对应物诱导不同水平的细胞因子分泌。与它们的活的对应物相比，“短时间高温”处理的益生菌诱导更少的促炎细胞因子(TNF- a、IFN-Y、IL-12p40)而维持或诱导更高的IL-10分泌。与活细胞相比，任何“短时间高温”处理的益生菌的获得的IL-12p40/IL-10比率是更低的。与之相比，在85°C热处理达20分钟的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，导致更高的IL-12p40/IL-10比率，显示了此类热处理对于本发明是必要的。通过用益生菌体外孵育PBMC获得的IL-12p40/IL_10比率是体内抗炎作用预测性的(Foligne, B.，等人，2007, World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。本发明也涉及本发明的混合物，用于治疗或预防炎性病症。因此，一个实施方案是本发明的组合物的用于制备治疗或预防炎性病症的产品的用途。不特别地限制通过由使用本发明制备的组合物能够治疗或预防的抗炎性病症。例如，它们可选自急性炎症例如脓毒病；灼伤；和慢性炎症，例如炎性肠病，例如，克隆病、溃疡性结肠炎、隐窝炎(pouchitis);坏死性小肠结肠炎；皮肤炎症，例如UV或化学诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；肠易激综合征；眼炎症；过敏反应、哮喘；肥胖相关的炎症；年龄相关的低度炎症，和它们的组合。本发明也扩展到提供微生物(例如益生菌和/或乳品起子培养物，特别地具有抗炎作用的活的益生菌和/或活的乳品起子培养物)或改善微生物(特别地活的益生菌和/或活的乳品起子培养物)的抗炎性效果的方法，所述方法包括步骤为对微生物进行至少71. 5°C达至少I秒的短时间的高温处理，例如在约71. 5-150°C达约1-120秒的短时间的高温处理。如果在本方法中使用活的益生菌和/或乳品起子培养物，“短时间高温”处理将导致使得至少部分益生菌和/或乳品起子培养物成为非复制型。“短时间高温”处理可导致使得至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地全部的益生菌为非复制型。在本发明的优选的实施方案中，方法包括向组合物加入活的益生菌和对含有益生菌的组合物进行“短时间高温”处理的步骤。在补充进入产品之前也可热处理微生物。
组合物可为任何组成但是例如为用益生菌补充的食品或营养产品或饮料。根据本发明也扩展到提供包含微生物(例如，益生菌和/或乳品起子培养物，优选地具有抗炎性质的活的益生菌和/或活的乳品起子培养物)的组合物或改善它的现有的抗炎性质的方法，所述方法包括步骤为对微生物进行至少71. 5°C至少I秒的高温处理，例如在约71. 5-150°C约1-120秒的短时间的高温处理。能够方便地在エ业设施中实施此“短时间高温”处理步骤，但也能够在家实施，使用例如气蒸器(steamer)。这种方法，能够在消耗之前直接 赋予产品抗炎作用。本领域技术人员将理解他们能够自由地组合本发明此处描述的全部特征而不偏离本发明公开的范围。特别地，描述本发明的用途和方法的图可用于本发明的组合物和方法并且反之亦然。本发明另外的优势和特点从下述实施例和图中显而易见。图IA和B显示了受“短时间高温”处理的益生菌的抗炎免疫谱的增強。图2显示了非抗炎益生菌株变为抗炎的，即非抗炎益生菌株在受“短时间高温”处理后表现了显著的体外抗炎免疫谱。图3A和B显示了在可商购的产品中使用的益生菌株，在被“短时间高温”处理之后所述益生菌株表现了增强的或新的体外抗炎免疫谱。图4A和B显示了乳品起子菌株(即Lcl起子菌株)，在高温热处理时所述起子菌株表现了增强的或新的体外抗炎免疫谱。图5显示了非抗炎益生菌株，在被HTST处理之后所述益生菌株表现了体外抗炎免疫谱。图6 :用以它们活的和热处理(140°C达15秒)形式的益生和乳品起子菌株生成的PBMC数据的主成分分析(IL-12p40、IFN- y、TNF- a、IL-10)。每ー个点代表用NCC数字或名称标识的活的或热处理的ー株菌株。图I显示了活的和热处理的(85°C，20分钟)菌株的IL-12p40/IL_10比率。总体地，在85°C达20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比率上升，与本发明的“短时间高温”处理相反(

图1、2、3、4、和5)。
实施例方法学细菌制品通常认为活的益生菌制剂对宿主免疫系统递送的健康益处是菌株特异性的。已经显示了诱导高水平的IL-10和/或体外诱导低水平的促炎细胞因子(PBMC測定法)的益生菌是强烈的体内抗炎菌株(Foligne, B.等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 236-243)。使用若干益生菌株以研究热处理的益生菌的抗炎性质。这些菌株为长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、和大肠杆菌Nissle。也测试了包括商业用于生产Nestl6Lcl发酵产物的一些菌株在内的若干起子培养物菌株嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC2059、保加利亚乳杆菌NCC 15和乳酸乳球菌NCC 2287。在对每ー菌株优化的条件中在5-15L的生物反应器中培养细菌细胞。全部的典型细菌生长培养基为可用的。此类培养基为本领域技术人员所知。当调整pH至5.5时，连续地加入30%碱溶液(NaOH或Ca(OH)2)。当足够时，通过用CO2充气液面上空间维持厌氧的条件。在标准需氧条件下培养大肠杆菌。
通过离心(5000xg，4°C)收集细菌细胞并且重悬于足够体积的磷酸缓冲盐水(PBS)中以达到约109-101QCfu/ml的最终浓度。一部分制品以15%甘油冷冻在-80°C。通过以下方法热处理另一部分细胞-超高温140°C达15秒；通过间接蒸汽注射。-高温短时间(HTST):通过间接蒸汽注射74°C、90°C和120°C达15秒。-在水浴中长时间低温度(85°C，20分钟)热处理后，在-80°C冻存样品直到使用。细菌制品的体外免疫谱分析评价活的和热处理的细菌制品的免疫谱(即从体外人血细胞诱导特定细胞因子分泌的能力)。从血液过滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。在通过细胞密度梯度分离之后，收集并用Hank平衡盐溶液洗涤两次单核细胞。随后在用10%胎牛血清(Bioconc印t，Paris，法国)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)和0. I %庆大霉素补充的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma)中重悬细胞。随后在48孔板中用活的和热处理的细菌(等同于7xl06cfu/孔)温育PBMC (7xl05个细胞/孔)达36小吋。在来自8个个体供体的PBMC上测试活的和热处理的细菌的作用，所述个体供体被分为两个分离的实验。在温育36小时之后，冷冻并在_20°C保存培养板直到细胞因子測量。对活细菌和它们热处理的对应物平行地实施(即，在同一实验中对同一批PBMC实施)细胞因子谱分析。在36小时温育后依照制造者的说明书通过ELISA(R&D DuoSet Human IL-10, BDOptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF a、BD OptEIA人IFN- y )确定在细胞培养物上清液中的细胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40、和 TNF-a是促炎细胞因子，而IL-IO是强烈的抗炎介质。用4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM表示结果，并且结果代表了两个单独实验，每ー个所述単独实验用4个供体实施。对每ー菌株计算IL-12p40/IL-10的比率作为体内抗炎作用的预测值(Folign6，B.，等人，2007，WorldJ. Gastroenterol. 13 :236-243)。把对每ー菌株通过ELISA(见上)确定的许多细胞因子数值(pg/ml)转移入BioNumerics v5. 10 软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。在此数据集上实施主成分分析(PCA，量度技木)。此分析包括从数值减去平均值和数值除以方差。结果通过超高温(UHT)/高温短时间(HTST)样处理生成的抗炎谱研究中的益生菌株受到一系列热处理(超高温(UHT)、高温短时间(HTST)和85°C达20分钟)并且把它们的免疫谱和活细胞的那些免疫谱体外作比较。当与人PBMC—起温育时(图1、2、3、4和5)活微生物(益生菌和/或乳品起子培养物)诱导了细胞因子产生的不同水平。这些微生物的热处理以温度依赖性的方式改变了由PBMC生产的细胞因子的水平。“短时间高温”处理(120°C或140°C达15秒)生成了具有抗炎免疫谱的非复制型细菌(图1、2、3和4)。实际上，在維持或诱导额外的IL-IO产生的同时(与活的对应物对比)，UHT-样处理的菌株(140°C，15秒)诱导了更少的促炎细胞因子(TNF-a，IFN-Y，IL-12p40)。对于任何UHT-样处理的菌株获得的IL-12p40/IL-10比率与活细胞相比更低(图1、2、3和4)。对于由HTST-样处理，即受至IJ 120°C达15秒(图1、2、3和4)、或74。。和90°C达15秒(图5)处理的细菌此现象也是有效的。热处理(UHT-样或HTST-样处理)在益生菌株体外免疫谱(图1、2、3和5)和乳品起子培养物上(图4)具有相似的效果。对用活的和热处理的(140°C，15秒)益生菌和乳品起子菌株生成的PBMC数据的主成分分析揭示了活的菌株全部沿X轴分散，表明菌株表现了非常不同的体外免疫谱，为促炎细胞因子的从低(左側)到高(右側)的诱导物。热处理的菌株聚集在图表左侧，显示了热处理菌株更少诱导促炎细胞因子(图6)。与之相反，在85°C达20分钟的热处理的细菌比活细胞诱导较多的促炎细胞因子和较少的IL-10，导致更高的IL-12p40/IL-10比率(图7)。由UHT-样和HTST-样处理增强或生成抗炎谱。 无论它们各自初始的免疫谱(活细胞)，UHT和HTST处理的菌株表现了抗炎谱。在“短时间高温”处理以后，显示了已知为体内抗炎和体外表现抗炎谱的益生菌株(长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950，乳双歧杆菌NCC 2818)表现出增强的体外抗炎谱。如图I中所示，UHT-样处理的双歧杆菌属菌株的IL-12p40/IL-10比率比低于来自活的对应物的那些比率，因此显示了 UHT-样处理的样品的提高的抗炎谱。更突出地，对于非抗炎活菌株也确认了由HUT-样和HTST-样处理生成抗炎谱。活鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC2461都表现了体外高IL_12p40/IL_10比率(图2和5)。显示了两个活菌株对小鼠中TNBS-诱导的结肠炎是非保护性的。在“短时间高温”处理以后(UHT或HTST)由鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL-12p40/IL_10比率剧烈下降，低至用双歧杆菌属菌株获得的水平。这些低IL-12p40/IL-10比率由干与没有变化(鼠李糖乳杆菌NCC4007)或IL-10分泌的剧烈诱导(类干酪乳杆菌NCC2461)(图2)相结合的低水平IL-12p40产生所致。因此-通过UHT-样和HTST-样热处理能够增强活微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌NCC 2705、长双歧杆菌NCC 3001、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)。-通过UHT-样和HTST-样热处理能够从非抗炎活微生物生成抗炎谱(例如鼠李糖乳杆菌NCC 4007、类干酪乳杆菌NCC2461、乳品起子嗜热链球菌NCC 2019)。-对于从可商购的产品(图3A&B)(包括益生大肠杆菌菌株)分离的菌株也显示了抗炎谱。对于全部测试的益生菌和乳品起子例如乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属，UHT/HTST-样处理的影响是相似的。对若干乳杆菌、双歧杆菌和链球菌施用UHT/HTST-样处理表现了不同的体外免疫谱。在UHT/HTST-样处理以后全部的菌株诱导了比它们活的对应物较少的促炎细胞因子(图1、2、3、4、5和6)，这展示了 UHT/HTST-样处理在获得的非复制型细菌的免疫性质上的作用能够概括到全部益生菌，特别地到乳杆菌属和双歧杆菌属和特定的大肠杆菌株以及到全部乳品起子培养物，特别地到链球菌属、乳球菌属和乳杆菌属。


本发明一般地涉及细菌领域。特别地，本发明涉及“短时间高温”处理的益生菌和/或乳品起子培养物和这些细菌的应用。本发明的一个实施方案涉及“短时间高温”处理的益生菌和/或乳品起子培养物以及它们制备治疗或预防炎性病症的组合物的用途。