专利名称：一种高效抗旱、耐高磷营养丛枝菌根真菌及其生产方法 自然界普遍存在着的由真菌与植物根形成的共生体——菌根，不仅在自然生态系统中有重要意义，同时也对促进植物的生长发育有明显的作用。丛枝菌根是菌根中最普遍、数量最多的一种，且绝大多数农作物形成的都是丛枝菌根。大量科学研究表明，丛枝菌根的存在扩大了植物根系的吸收面积，提高养分(特别是磷素)的吸收能力，增强植株的抗逆、抗病性，促进土壤团粒结构形成。表现在农业生产上能提高磷肥利用率，减少施肥量，提高植物抗旱能力，提高植物对逆境如冷、热、重金属污染等的耐受力，减轻某些土传病害，加快矿区废弃地的复垦速度，它无污染、无毒害，是生产绿色食品的理想制剂。因此，丛枝菌根可以被看作是生物调节剂、生物肥料和生物防治剂，不仅在自然生态系统的恢复中有重要意义，而且在农业生产中也有实际的应用作用，是提倡持续农业的一项重要的生物技术。菌根技术是国际上近十几年以来生物技术中倍受关注的热点课题，其中丛枝菌根技术的应用更具难度。它的应用关键决定于高效菌种的筛选和菌剂的生产。首先，丛枝菌根真菌对宿主植物的选择性专一性不高，同一种丛枝菌根真菌可以同时侵染多种不同的植物，因此应用时必须对菌种的有效性进行筛选。高效菌种应具备较高的侵染速度和强度，丰富的外部菌丝量及其良好的广泛分布，较强的吸磷能力，较大的、抗逆性强的繁殖体产量。另外还应筛选适合不同土壤，宿主和气候的有效菌种，以及考虑土著菌的有效性，研究证明引入种比土著种更具竞争性和有效性。在这类真菌的170多个种中，G.mosseae、G.etuincatum、G.tenue和Gi.margarita是被公认有效的，并经常应用的种。在商业应用和科研活动中，各种菌种特别是一些有效菌株被广泛应用和保藏。另一方面，形成丛枝菌根的真菌属结合菌纲球囊霉目(Glomales)，它是一类严格的共生生物，它的生存依赖于活体高等植物。目前尚不能在培养基上对其进行离体培养，从而限制了对它的深入研究及其在生产实践中的大规模应用。商业化的应用要求有高密度真菌繁殖体和无污染的菌剂，现有条件下只能采用开放式与植物共生的方法培养，方法主要有盆钵培养法、营养薄层法、静水培养法、气雾培养法、双重无菌培养法、玻璃珠培养法、大田培养法等技术等。营养薄层法和静水培养法因产孢子量少，菌丝与侵染根段保存时间短，已经不采用了；双重无菌培养法和玻璃珠培养法可以获得纯净的真菌材料、数量相对少，操作和技术难度大，比较适合科研和特殊目的需要；大田培养法容易受到污染，可以在某些地方当季自产自用，不适合于商业化菌剂；目前用于商业化菌剂生产的方法主要是盆钵培养法，气雾培养法也可以用，但成本和技术要求高，用的很少。盆钵培养法是在温室开放条件下，通过培养基质和植物为载体，控制环境清洁和条件以获得纯度高、质量好的菌剂。国际上随着丛枝菌根菌剂的生产厂家不断增加，应用范围的扩大，丛枝菌根技术在不断生温。我国丛枝菌根真菌的生产与应用仍然处于起步阶段。针对目前丛枝菌根真菌高效菌种的缺少，而我国地大物博有丰富丛枝菌根真菌资源尚待开发，同时我国是农业大国，生态环境的恢复也刻不容缓，因此丛枝菌根技术有着广泛的应用前景。我们在多年全国丛枝菌根真菌资源调查的基础上，筛选得到了一种高效抗旱、耐高磷营养的丛枝菌根菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)。另外，针对丛枝菌根真菌温室盆载生产工艺中的不稳定、不标准和欠缺，并提出该菌种相应的温室盆栽生产工艺。
本发明的目的是提供一种高效抗旱、耐高磷营养的丛枝菌根真菌摩西球囊霉(Glomus mosseae)，使之能在农业生产和种草造林恢复生态环境中得到有效应用。同时提供一套基于上述菌株的改进的温室生产工艺，使之能稳定地获得高质量无污染的菌剂。本发明的技术解决方案是本发明涉及的高效抗旱、耐高磷营养丛枝菌根真菌是摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6 CGMCC No0927。它是从新疆昭苏县，新疆韭(Alliun flavidum ledeb)植物根区分离到的一株丛枝菌根真菌，此菌株已于2003年5月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏中心地址为中国北京中关村，邮政编码为100080，保藏号为CGMCCNo.0927。该菌株孢子圆至近圆，有时呈不规则形，单生、或端生在根外菌丝丛中，可在枯根内、或在孢子果内，大部分孢子果只含1个孢子，有时4～6个。孢子大小(105～)130～200(～260)μm，孢壁厚(1.5)2～4.5μm，有二层外壁无色透明，0.5～1μm，成熟后常脱落，内壁淡黄或浅黄棕，1.5～3μm。壁在连点处增厚至6μm，连点漏斗状，宽(10～)15～26(～35)μm，漏斗的底部有一个厚凹隔。连孢菌丝8μm。侵入根的皮层，在细胞内形成丛枝，少见泡囊结构，根外菌丝发达，但繁殖体孢子较大相对于Glomus属的其它种，孢子数量较少。
本发明菌种的培养方法如下(1)选取宿主植物高粱(Sorghum vulgare Pers.)；(2)使用的培养菌种是本发明筛选的摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6菌株，用常规方法，按10-15克接种剂/kg基质接种；(3)选取的菌种培养基质包括沸石、河沙混合物，沸石与河沙按体积比为0.5-2∶1混合，沸石粒径1-1.2mm，河沙为普通河沙，过2mm筛，此培养基质100℃间歇灭菌两次；(4)培养容器选用普通塑料花盆，容器高度10-25cm常规清洗消毒；(5)所选用的植物种子经常规消毒催芽后，按7-9株/平方分米的种植密度种植；(6)培养菌种的温室按常规消毒，并在整个培养期间保持清洁，使用pH6.5-7.5的自来水浇水，基质含水量保持在田间持水量的55-65％，温室温度维持在15℃-40℃，每天用农艺钠灯(SON-T AGRO飞利浦)补充光照4-6小时，追施20％-50％浓度(体积比)的霍格兰Hoagland营养液，第三周起至收获前两周每周浇一次营养液，每次营养液量为50-70ml/L基质，培养15-17周；(7)收获采用的后处理方法是在培养结束前两周去掉衰老叶片及顶端幼嫩叶片，收获前一周停止浇水，按常规方法收集培养物即得到接种剂；(8)按常规方法保藏所获得的接种剂，所述方法包括室温干燥或4℃冰箱中保藏。
所述沸石为农用斜发沸石。所述沸石是河北省独石口乡沸石厂的农用斜发沸石。所述菌种培养基质的基本理化性状如下有机质＜0.4％，全氮未检出，全磷＜0.03％，全钾＜2.00％，速效磷＜1.000mg/kg，速效钾＜750mg/kg，pH8.0～9.0。所述的温室温度在15℃-35℃，最高不超过40℃。所述农艺钠灯的瓦数为423W。所述接种剂的收集方法是指待基质风干后，剪去地上部分，取出盆中基质，将根剪成1cm长的根段，即为接种剂，此接种剂是真菌繁殖体与基质的混合物。所述的宿主植物还可是苏丹草或三叶草。所述宿主植物高粱是敖杂一号。
本发明的菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6抗旱(土壤最低含水量4-5％)、耐高磷营养(土壤最高速效磷150-180ppm)，能与多种植物共生，改善植物营养吸收，提高植物抗旱性，促进生长。经试验对草莓、水稻、西瓜、大椒、芹菜、甜瓜、香蕉等作物上有良好的健壮幼苗、增加产量的效果。
本发明的菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6，具有广泛的、可靠的实际应用价值。其抗旱性表现在与试验菌株比较，萎蔫系数的降低程度可以达到25-40％，水分利用效率可以提高10-45％，植株地上部吸磷量可增加30-55％，减少植株叶片中脯氨酸含量15-40％。该菌株还具有耐高磷营养的特性。土壤或培养基质中速效磷含量过高时(一般在40-50ppm以上)，丛枝菌根真菌的侵染率、根内丛枝数量和土壤中孢子数量，会受到抑制或减少。而本发明的摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6可以在土壤速效磷最高到150-180ppm时侵染，并发挥促进生长的作用。
本发明的培养方法克服了丛枝菌根真菌温室盆载培养工艺中的不稳定、工艺不标准的缺点，通过试验研究规范明确了基质、种植密度、水质与水量、光照补充及营养液使用的标准方法。以区别于靠经验和粗放管理的传统盆栽生产，从而可以获得稳定的、高质量的、无污染的菌剂。保证菌剂中孢子含量在40-65个/ml干菌剂。
本发明的培养方法选用的沸石沙混合基质在其它盆载培养与生产中尚未使用过。并具有来源广泛，理化性状稳定，病源污染少，易于消毒，易于植物与真菌生长，易于繁殖体的检测，价格便宜的优点。
本发明的培养方法在收获前采用的后处理方法，到目前为止尚未见相关文献报道及在盆栽培养应用，是本发明的独创。该工艺的使用可以大幅度地提高菌剂中繁殖体孢子的数量(提高40-50％)，是保证接种剂高质量的关键。
AM真菌菌种抗旱性试验1.材料与方法1.1材料1.1.1供试基质∶沙土比为3∶1的混合基质，其中河沙采自北京市卢沟桥附近永定河河床，土壤采自北京市农林科学院小麦试验田，接种前基质100℃间歇灭菌两次装盆。基质基本理化性状如下速效氮，10.7mg/kg；速效磷，9.49mg/kg；速效钾，81.0mg/kg；全氮，0.0451％；全磷，0.0905％；全钾，1.71％；有机质，0.989％；pH，8.5；田间持水量，11.63％；土壤含水量1％。
1.1.2供试植物大豆中黄七号(Glycine max (L.)Merr.)，由北京市农林科学院种子公司提供。
1.1.3供试菌种Glomus.versiforme 1(台湾的菌种)(G.v1)，Glomus.mosseae 93-6(分离自新疆昭苏县，新疆韭Allium flavidum Ledeb.根际)(G.m)，Glomus.diaphanum(分离自新疆沙湾县，苦豆子Sophoraalopecuroides L.)根际)(G.d)，和Glomus.versiforme 2(分离自新疆沙湾县，苦豆子Sophora alopecuroides L.根际)(G.v2)。
1.2试验设计试验设三个基质水分处理，基质相对含水率分别为25％、50％、80％。4个菌株，G.v1、G.m、G.d、G.v2加不接种的对照处理，每个处理重复9次。试验在北京市农林科学院作物所的温室中进行，于2002年3月23日播种，每盆定苗4株，采用层施法接种，1350g土/盆，接种剂5g/盆。生长周期为4个月，在此期间，分2次取样，初期(植株生长一个月后)和后期(植株生长的第四个月)测定。
1.3试验管理水分控制播种后两周开始基质水分处理，用称重法保持基质含水率。
2.测定指标与方法2.1萎蔫系数的测定停止补水，直至植株萎蔫，过夜后仍不能恢复时，称重计算此时土壤含水量对土壤干重的百分率。
2.2水分利用效率的测定由每天浇水的记录计算植株在整个试验期内的水分利用效率。
2.3叶片脯氨酸测定酸性茚氨酮染色法。
2.4植株地上部磷含量钒钼黄比色法。
3.试验结果3.1接种不同AMF菌株对大豆萎蔫系数的影响接种4个菌株对大豆萎蔫系数的影响如图1所示。萎蔫是植株叶片减少直接辐射，防止或减轻过热和水分蒸腾的一种被动运动。萎蔫系数的高低，反应了植株抗旱能力。萎蔫系数越低，其抗旱能力越强。总的来说，接种4个菌株都显著降低了大豆的萎蔫系数。在基质含水率为25％和50％时接种G.m菌株对大豆植株的萎蔫系数的降低程度较其它三种大，G.v1菌株次之，G.d菌株降低程度最小。在基质干旱处理(含水率为25％)时接种G.m菌株对大豆植株的萎蔫系数的降低程度较其它3个菌株降低了25.6-36.3％。
3.2接种不同AMF菌株对大豆水分利用效率的影响现将接种4个菌株处理下大豆植株的水分利用效率列于表1。作物的水分利用效率取决于干物质积累数量和耗水量。由大豆水分利用效率结果可以看出，4个菌株都不同程度的提高了大豆的水分利用效率，这种效果在25％时更为明显。尤其以接种G.m菌株为最大，与其它3个菌株相比较水分利用效率提高了13.9-41.8％。
表1接种四个AMF菌株对植株水分利用效率的影响基质相对含水率％菌株25％ 50％ 80％Ck 3.17d2.21c 2.23bG.v1 4.02b2.37bc2.49aG.v2 3.23d2.42abc 2.23bG.m 4.58a2.50ab2.32abG.d 3.62c2.62a 2.14b
3.3接种不同AMF菌株对大豆地上部磷吸收量的影响接种4个菌株对大豆地上部吸磷量的影响如表2所示。可以看出，在基质相对含水率为25％时，接种G.m菌株较对照处理大幅度提高地上部吸磷量，增加了约9倍。比G.d、G.v1和G.v2菌株地上部吸磷量提高了32.4-53.0％。
表2接种AMF菌株对大豆地上部磷吸收量的影响地上部含磷量地上部磷吸收量菌株 25％ 50％ 80％25％ 50％80％Ck 0.081e 0.142c 0.129e 0.237e 0.824d 1.041eG.v1 0.263d 0.285ab 0.463a 1.126d 1.944b 4.070aG.v2 0.333c 0.335a 0.394b 1.489c 2.395a 3.117bG.m0.438a 0.231b 0.329d 2.396a 1.471c 2.806cG.d0.349b 0.373a 0.354c 1.619b 2.29ga 2.280d3.4接种不同菌株对大豆植株叶片脯氨酸含量的影响接种4个AMF菌株在不同水分处理下大豆叶片的脯氨酸含量如图2所示。脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质。由于脯氨酸是水溶性最大的氨基酸(162.3克/百克水，25℃)易于水合或具有较强的水合力，植物受到水分胁迫时一些植物通过合成大量的脯氨酸等有机溶质提高细胞渗透势，有助于细胞或组织的持水，这有助于提高其抗旱性。且脯氨酸对植物无毒害作用，可以保护酶活性，从而使叶绿素的和对蛋白质合成正常进行。因而脯氨酸含量大小可以反映植物遭受水分胁迫的程度。由2图可以看出，在三个基质水分处理下，接种4个菌株的大豆植株叶片中脯氨酸含量显著低于对照处理。在含水率为25％和50％时，接种G.m菌株的处理叶片中所含脯氨酸量最少。比其它3个菌株的脯氨酸含量低了17.2-38.9％。


图1接种四个AMF菌株对大豆植株萎蔫系数的影响/(％)；图2接种4个AMF菌株在不同水分处理下大豆叶片的脯氨酸含量。
菌种保藏说明本发明的摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6的菌株已于2003年5月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏中心地址为中国北京市中关村中国科学院微生物所内，邮政编码为100080，保藏号为CGMCCNo.0927。

实施例1摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6的培养以高粱(Sorghum vulgare Pers.，敖杂一号)为菌剂生产宿主。菌种为本发明筛选的摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6菌株，以高粱为宿主扩大繁殖获得的内含该菌株孢子、被侵染根段及根外菌丝的土沙混合物为接种剂。培养基质为沸石沙混合物(体积比为1∶1)，其中河沙采自北京市卢沟桥附近永定河床，过2mm筛。沸石购于河北省独石口乡沸石厂的农用斜发沸石，粒径1.2mm。其基本理化性状有机质0.366％，全磷0.024％，全钾1.88％，速效磷0.957mg/kg，速效钾720mg/kg，pH8.8。基质100℃间歇灭菌两次装入2.4L的塑料盆中(上口直径17cm，下口直径11cm，高15cm)，塑料盆使用前用1∶20的“84”消毒液消毒。高粱种子用40％甲醛稀释100倍液浸泡15分钟，28℃催芽，70％种子露白即播种。播种时，每盆先装基质2kg，然后将接种剂30g层铺其上，再覆基质0.5kg，播种后盖基质，出苗1周后定苗，20株/盆。温室用白菌清熏蒸消毒，并在整个培养期间保持清洁。生长期内用pH7.5的自来水浇水，自来水可用H2SO4或NaOH调pH值，基质含水量保持在田间持水量的60％。温度维持在15℃-35℃。每天用SON-T AGRO飞利浦农艺钠灯瓦数为423W补充光照6小时(16:00至22:00)。从第三周起至收获前两周每周浇20％浓度(体积比)霍格兰Hoagland营养液一次，每盆150ml。培养16周。提前两周去掉高粱衰老叶片及顶端幼嫩叶片，提前1周停止浇水。待基质风干后，剪去地上部分，取出盆中基质，将根剪成1cm长的根段，即为接种剂。其中摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6菌株的孢子数为62个/ml干基质。真菌繁殖体与基质的混合物在室温干燥或4℃冰箱中保藏。
实施例2摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6在番茄种植中的应用实例草炭与蛭石按体积比2∶1混合作为苗期培养基质。常压蒸汽间歇灭菌三次，每次1小时。基质养分状况见表1。供试作物番茄品种为伽粉2号。试验菌种为摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6从高粱盆栽繁殖获得。番茄种子用40％甲醛1∶100的水溶液中浸泡25分钟消毒后，在25℃催芽48小时备用。72孔苗盘用水洗净，75％酒精擦洗，装入已灭菌苗期培养基质，每穴分别加入接种菌剂1克。最后每穴播种番茄种子3粒(待出苗后间苗留2株)，覆盖蛭石并浇水至饱和。成苗后定植于温室土壤中(土壤不灭苗)。温室土壤养分状况见表1。
表1供试土壤基本理化性状土样有机质/％ 全N/％ 全P/％ 速效P/mg.kg-1苗培基质486.2 8.621.4725.4温室土壤40.7 1.532.35171.0
表2接种AM真菌对番茄穴盘苗苗期生长和侵染的影响处理株高/cm 地上部干重/g菌根侵染率/％CK 7.040.11093-69.420.1630.04表3菌根化处理对番茄的初花时间、果重和品质的影响处理总果重/kg 水溶总糖/％ 维生素C/mg(100g-1)CK 15.11.5725.493-617.01.6331.4结果接种的番茄植株都被摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6侵染。菌根对植物生长的促进作用很显著，接种处理的番茄株高和地上部干重分别高于对照33％和45％(表2)。按番茄成苗标准，处理比对照早成苗10天。接种的菌根化苗定植后，比对照提前现蕾、开花和结果，且果品质量优良(表3)。处理提早11天初花，果重比对照增加31％。果实的水溶总糖和Vc含量也高于对照。


本发明涉及一种高效抗旱、耐高磷营养的丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)93－6及其生产方法。该方法选用高粱作为宿主植物；采用沸石沙混合物作为培养基质；以高粱为宿主扩大繁殖获得的内含该菌株孢子、被侵染根段及根外菌丝的土沙混合物为接种剂；按照本发明所公开的方法培养后能稳定地获得高质量无污染的该菌剂，该菌剂中孢子含量为40－65个/ml干菌剂。该菌株能与多种植物共生，具有改善植物营养吸收，提高植物抗旱性，促进植物生长的特点。经试验对草莓、水稻、西瓜、大椒、芹菜、甜瓜、香蕉等作物上有良好的健壮幼苗、增加产量的效果。