一种大蒜芥抗旱基因及其应用的制作方法[0002]水资源短缺一直都是人类面临的难以解决的问题，目前全球有1/3以上的土地为干旱或半干旱的地区。干旱严重制约和影响着农作物的生长和产量，因此提高农作的抗旱性，培育抗旱品种也逐渐成为科学家的焦点，研究生物的抗旱性成为农业领域的热点。国内外学者经过几十年来的努力，在植物的抗旱机制以及相关抗旱基因的挖掘方面做出了很大的贡献。近年来，随着分子遗传学、转录组学、蛋白质组学和基因表达调控的研究，也发现了一些与植物抵抗干旱胁迫相关的物质，如脯氨酸、甜菜碱、丙二醛、抗氧化酶类等，并分离鉴定出这些物质的基因以及相关的调控因子，初步揭示了植物抗旱的分子机制。随着分子生物学与生物技术的快速发展，也实现了相关抗旱基因的克隆，利用基因工程手段将克隆出的抗旱相关基因导入植物的基因组中，以此得到抗旱性较强的新品种。[0003]短命植物是一类生长于干旱荒漠地区，具有生长发育节律快、生活周期短、能在短时间内完成生活史等特性的特殊生态类型植物。根据生长季节可以将短命植物分为三类:冬季一年生植物、夏季一年生植物和早春短命植物。由于大多短命植物生长的环境较为严酷，分布于干旱荒漠地区的也有不少，所以它们具有一定的防风固沙、保持水分的作用，对改善土壤环境具有重要意义。一些分布在新疆北疆地区的短命植物因为枝叶嫩软成为草原上家畜的优良牧草。同时，它们开花时色彩鲜艳，具有观赏价值，在花卉及园林绿化中发挥重要作用。此外， 也有一些短命植物是传统中药药材，具有药用价值。另一方面，短命植物在与逆境相适应的同时逐渐产生了一定的抗逆性，其抗逆基因资源的研究和挖掘对于作物抗逆育种也具有重要意义。
[0004]本发明的目的在于提供一种大蒜芥抗旱基因，其喊基序列如SEQ ID N0:1所不。[0005]本发明的第二个目的在于一种大蒜芥抗旱基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。[0006]本发明的第三个目的在于提供一种含有大蒜芥抗旱基因的表达载体。[0007]所述表达载体为植物表达载体。
[0008]本发明的第四个目的在于提供大蒜芥抗旱基因在提高植物抗旱性中的应用。
[0009]本发明的第五个目的在于提供一种提高植物抗旱性的方法，将大蒜芥抗旱基因导入植物组织或细胞，得到具有抗旱性的植物，所述大蒜芥抗旱基因是下述核苷酸序列之
[0010]I) SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列；
[0011]2)编码SEQ ID NO:2所示氨基酸残基序列的DNA序列。
[0012]所述大蒜芥抗旱基因通过含有所述大蒜芥抗旱基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。
[0013]所述植物表达载体为pCAMBIA2300-35S-SaHRD-0CS。
[0014]本发明的技术路线为:
[0015]I)利用分子生物学方法从大蒜芥中克隆抗旱基因，命名为SaHRD ；
[0016]2)构建SaHRD植物表达载体，用农杆菌转化烟草，获得转SaHRD基因烟草；
[0017]3)结果表明=SaHRD基因在烟草中表达，转SaHRD基因的烟草有明显的抗旱效果。
[0018]本发明克隆了一种大蒜芥抗旱基因SaHRD，构建SaHRD植物表达载体，用农杆菌转化烟草，获得转SaHRD基因烟草；结果表明=SaHRD基因在烟草中表达，转SaHRD基因的烟草有明显的抗旱效果。



[0019]图1SaHRD植物表达载体构建流程图；
[0020]图2SaHRD转基因烟草RNA琼脂糖凝胶电泳检测图，M =Marker, I和2分别代表不同的转基因烟草植株；
[0021]图3SaHRD转基因烟草RT-PCR检测电泳图，M =Marker, I和2分别代表不同的转基因烟草植株；
[0022]图4A经浓度为5%的PEG处理后，转SaHRD基因烟草与非转基因烟草的生长状况；
[0023]图4B经浓度为25%`的PEG处理后，转SaHRD基因烟草与非转基因烟草的生长状况；

[0024]以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0025]本发明用到的材料、试剂和仪器:
[0026]植物材料:大蒜芥种子采自乌鲁木齐烈士陵园，采后于4°C保存。
[0027]菌株材料:大肠杆菌DH5 a。
[0028]质粒材料:pMD18_T，购自TaKaRa公司。
[0029]试剂:氯仿，异戊醇，乙醇，异丙醇等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)，溴乙锭(EB)购自天根生化科技有限公司；蛋白胨，酵母提取物、氨苄青霉素购自宝信生物科技公司。
[0030]试剂盒和酶:pMD18_T载体、大肠杆菌感受态细胞制备试剂盒购自TaKaRa公司；质粒DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；Taq酶购自购自北京百泰克生物技术有限公司。
[0031]LB液体培养基:胰蛋白胨0.5g，酵母提取物lg，NaCl lg，调pH值至7.0_7.5，定容到 IOOmL。
[0032]LB固体体培养基:胰蛋白胨0.5g，酵母提取物lg，NaCl lg，琼脂粉1.5g，调pH值至 7.0-7.5，定容到 100mL。
[0033]主要仪器:电热恒温水槽(DK-8D)、高速离心机(Centrifuge 5415R)、PCR仪(AG2233IHamburg)、电泳仪(DYY-6D)、超净工作台(BHC-1300A/B3)、凝胶成像系统(FluorChemFC2)。[0034]实施例1 SaHRD基因克隆
[0035]提取大蒜芥基因组DNA
[0036]参照CTAB法稍作改动。分别称取大蒜芥和线果芥叶片0.5-lg置于研钵中，液氮充分研磨，迅速将粉末转移至1.5mL离心管；向离心管中加入700 μ L经65°C水浴后的CTAB提取液，加入β -疏基乙醇30 μ L ;混匀置于65°C水浴lh，每隔20min上下颠倒混匀I次；4°C，12000rpm离心lOmin，取上清转移至新离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀；4°C，12000rpm离心lOmin，取上清至新离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，于_20°C冰浴30min,6000rpm离心5min ;弃上清,70%乙醇洗漆沉淀2次；自然晾干后加Λ 40 μ LTE充分溶解DNA，_20°C保存备用。
[0037]扩增SaHRD某闵
[0038]以大蒜芥基因组DNA做为扩增目标基因的模板，进行PCR扩增，得到长度为549bp的DNA片段，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，命名为:SaHRD。SaHRD基因其编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，蛋白分子量为:19.69KDa，等电点为:6.53，同时拥有一个由64个氨基酸组成的AP2/ERF结构域。
[0039]引物序列为:
[0040]上游引物:5’-GGTACCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC-3’
[0041 ]下游引物:5’ -CTGCAGTCATGGAAAATTCCACAAGT AAT-3’
[0042]上游引物上加KpnI酶切位点，下游引物上加Pst I酶切位点，以利于下一步扩增产物连接到载体上。
[0043]
PCR 反应体系:IOX Buffer2.0 μ?,
dNIP0.5 μ?..Taq B0,4 μ?
引物IΙμΙ
引物2ΙμΙ
模板DNA2 pL
ddH20补充至20 μ￡
[0044]混匀，短暂离心至管底，进行以下PCR程序:
[0045]94 dC 预变性5min
[0046]
94 °C 变ft50 s -η
50 °CiM火50 s r*- 35cycles
72 eC延伸I min」
[0047]72 °C 彻底延伸IOmin
[0048]4 °C保存
[0049]PCR扩增目的条带进行回收然后连接PMD18-T载体进行测序，验证其准确性。[0050] 连接体系如下:
[0051 ] 纯化的目的DNA 4.5 μ L
[0052]pMD18-T0.5 μ L
[0053]Solution I5 μ L
[0054]连接条件:16 °C水浴过夜。
[0055]实施例2 SaHRD植物表达载体构建
[0056]SaHRD植物表达载体pCAMBIA2300-35S-SaHRD_0CS构建过程参见图1。
[0057]用限制性内切酶KpnI和PstI分别双酶切载体pCAMBI2300-35s_0CS和目的基因SaHRD的PCR扩增产物，酶切产物用T4DNA连接酶进行粘性末端的连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5a进行PCR检测，得到SaHRD植物表达载体，命名为pCAMBIA2300-35S-SaHRD-0CS。
[0058]实施例3SaHRD植物表达载体农杆菌介导转化烟草
[0059]1、农杆菌的培养
[0060]将含有SaHRD的质粒pCAMBIA2300-35S-SaHRD_0CS用液氮冻融法转化到农杆菌AgrO感受态中，条件:液氮冻3min，37°C 5min。筛选阳性单菌落，用含Rif (50mg/L),Sm(100mg/L)和Kan(100mg/L)的液体LB中28°C振荡培养2d至对数生长期。
[0061]2、农杆菌侵染及再生苗培养
[0062]将W38烟草无菌苗叶片切`成0.5cm2的小块(伤口)，用经过MS0液体培养基稀释的农杆菌菌液侵染15min，侵染后的叶片用无菌纸吸干，除去多余的农杆菌菌液，将侵染后的叶片放入MS0培养基中共培养(暗培养)2d。
[0063]将共培养后的叶盘转移到含MSq+6_BA (2mg/mL)+Car (500mg/mL) +NAA (lmg/mL)+PPT (lOmg/mL)的分化培养基上。待分化出的芽Icm左右大小时，转到含MSO+PPT (IOmg/L) +Car (500mg/L)的生根培养基上，3周左右形成不定根。将生根后的烟草苗移栽至温室中。
[0064]3、转基因烟草的鉴定
[0065]提取转基因烟草叶片的总DNA和RNA，进行PCR和RT-PCR检测。
[0066]PCR 反应体系(20 μ L)为:10 X buffer 2 μ L;
[0067]dNTPs (2.5mmol/L) 2 μ L;
[0068]引物各 I μ L;
[0069]模板 I μ L;
[0070]Taq DNA 聚合酶(10000U/mL) 0.5 μ L。
[0071]反应条件为:94°C预变性5min ；94°C 30s,55°C 30s, 72°C lmin30s，30 个循环；然后72°C IOmin。
[0072]SaHRD转基因烟草RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，所提RNA结构完整，符合接下来的RT-PCR检测要求。
[0073]SaHRD转基因烟草RT-PCR检测结果如图3所示，根据RT-PCR结果来看，筛选出的转基因烟草RNA水平都有SaHRD基因的表达。
[0074]实施例4转基因烟草的抗旱性实验
[0075]种子胁迫处理[0076]转SaHRD基因烟草种子和非转基因烟草分别经过75%酒精处理之后，用无菌水润洗数次，再播种于铺有两层滤纸的培养皿中，每个培养皿播种30粒，做3次重复，滤纸事先分别用0%，5%，10%, 15%和20%PEG-6000水溶液完全浸润，然后封口置于光照培养箱中培养，考察种子萌发特性。
[0077]在PEG浓度为20%时，转SaHRD基因烟草和非转基因烟草基本不萌发，而在PEG的浓度在15%时，非转基因烟草不萌发，转SaHRD基因烟草的发芽率为56%。当PEG的浓度在5%-10%时，转SaHRD基因烟草和非转基因烟草都发芽，但转SaHRD基因烟草的发芽率要高于非转基因烟草。结果表明:转SaHRD基因烟草在干旱胁迫中保持较高的萌发率，表现出较好的抗旱性。
[0078]幼苗胁迫处理
[0079]转SaHRD基因烟草和非转基因烟草培养幼苗四周后采用0%，5%，10%, 15%，20%，25%PEG-6000水溶液浇灌，做3次重复，观察叶片变化。
[0080]干旱处理后，PEG浓度为5%时，转SaHRD基因烟草与非转基因烟草的生长状况相比无表型上的差别(如图4A所示)，随着浓度的增加，叶片开始发生不同程度的萎蔫，当PEG浓度达到25%时，非转基因烟草表现出失水严重的现象，转SaHRD基因烟草叶片有部分萎蔫，还有部分发生卷曲，表现出对干旱胁迫具有一定的耐受性(如图4B所示)。
[0081]SaHRD基因在干旱胁迫中的表达变化
[0082]用浓度为20%的PEG溶液浇灌转SaHRD基因烟草，分别提取经干旱胁迫处理8小时、12小时、24小时和48小时的转SaHRD基因烟草叶片RNA，经反转录后PCR扩增SaHRD，
比较基因表达量的变化。
`[0083]转基因烟草SaHRD基因在胁迫初期持续上调，至8h时达到最大值，为胁迫前的25.3倍，随后在12h和24h时出现不同程度的下降，48h时出现大幅度下降，此时表达量仅为比胁迫前高出1.2倍。