专利名称：一种新型预防和治疗乙肝病毒感染的核酸疫备及制备方法乙型病毒性肝炎(Viral hepatitis B)是目前危害我国人民身体健康最为严重的感染性疾病。据调查，我国慢性乙肝病毒感染者多达1.2亿以上，其中慢性乙肝患者达2000万以上。携带者及慢性肝炎患者中部分病例可发展为重症肝炎、肝硬化甚至肝癌，每年死于肝炎及其相关性疾病的患者不下30万例。据估算，每年因为肝炎及其相关性疾病导致的经济支出高达300-500亿元。乙肝病毒感染至今尚无特效治疗方法。目前临床上应用的慢性乙肝治疗药物均存在疗效不尽如人意、副作用多等多方面的缺陷，远不能满足乙肝病毒感染防治的需要，这给乙肝的防治带来了巨大困难。因此，开发高效的抗乙肝病毒药物，具有迫切的临床需要。核酸疫苗及治疗性核酸疫苗是国际上20世纪90年代以后发展起来的新兴生物技术，在预防和治疗慢性乙肝病毒感染方面具有广阔的发展前景。乙肝治疗性核酸疫苗与传统药物相比具有以下优越性(1)传统药物(包括α干扰素，胸腺素α1，拉米夫定等)仅能可逆性地降低HBVDNA复制水平，部分清除HBeAg，而对清除HBsAg基本无效；从理论上讲，治疗性核酸疫苗可望发展为HBV感染的根治药物，不但能清除HBV基因表达产物(HBsAg、HBeAg)，而且可以大幅度降低或清除HBV DNA，使治疗更为完全、彻底。(2)Davis、Hui等通过转基因小鼠动物模型研究发现，治疗性核酸疫苗应用过程中不会导致肝功能指标的升高，不引起肝脏病理损害，这一特点也明显优越于现有的抗病毒药物及免疫调节药物。(3)乙肝治疗性核酸疫苗表达载体为质粒载体，无病毒性载体的安全性顾虑，疫苗接种方法简单、易行，可重复注射，目的基因表达持续时间不长，但足以介导良好的免疫应答，且目的基因不需要精确调控。(4)由于治疗对象均为HBV感染者，且目的基因片段并不含有完整的病毒颗粒，在机体染色体DNA上随机整合率低、应用较为安全。国内外有关乙肝核酸疫苗的研究主要集中在以下方面1.目的基因片段的选择多项研究显示，HBV S基因为诱导HBsAg特异性CTL活性所必需，而preS1或preS2基因的加入可增强机体的免疫应答。Davis等在HBV基因疫苗诱导CTL活性的研究中发现，基因疫苗可十分有效地诱导HBV特异性CTL应答，从而为开发新型乙肝治疗性核酸疫苗提供了强有力的理论依据。Davis等在随后的研究中采用包含HBV DNAS及preS2基因的质粒pCMV-S2S免疫HBsAg转基因小鼠，观察到部分小鼠早在DNA疫苗注射后2周，血清HBsAg即消失，不经加强注射持续至12周以上，而另外一些小鼠，HBsAg水平明显下降且维持在较低水平。同时，血清中抗HBs产生。所有小鼠均未见肝脏出现明显的坏死及炎症病理变化。Hui等构建了包含HBV S基因及preS121-47位多肽编码基因的重组质粒pCMV-SS1，用于免疫HBsAg转基因小鼠，结果发现pCMV-SS1给药导致80％的转基因小鼠循环中HBsAg的清除或水平明显下降(下降至用药前的1/1000水平)，明显高于pCMV-S(40％)，而空载质粒无效，非空载质粒给药组均观察到较高的抗HBs水平，而pCMV-SS1质粒组还观察到抗preS1的产生。这亦为核酸疫苗清除慢性乙肝病毒感染提供了强有力的实验依据。采用HBe/cAg抗原编码基因片段构建核酸疫苗的研究亦见诸报道，但Matti等的研究表明，包含HBe/cAg基因的表达质粒并无清除HBV慢性感染大猩猩体内病毒的作用。目前国内外已经采用的乙肝核酸疫苗基因片段及组合方式主要有S基因、S+preS121-47位多肽编码基因、preS2S、C、SC、preS1preS2S等基因片段，相关专利如下表1 乙肝核酸疫苗基因片段选择相关专利专利号 申请日期 发明人 基因片段 载体1 US05024 1991.07.1Nozaki，et (SC)3PSHB32 US06025 2000.02.1Jack R，et al. S1/S2/S+HCV core pcDNA3 WO0001 2000.03.2Shan LU，etC(35nts deleted) PJW4304 CN11083 1995.09.1李光地 SS1 V.V5 CN17558 1998.03.1李光地 C(AA1-144)(AA1-4 pcDNA6 CN12093 1999.03.0饶伟华 S1/S2/S7 CN13165 2000.06.1陈光明 S2S+GM-CSF/IL-2pcDNA8 CN13246 2001.05.2孙树汉 S2S+CpGpVAX2.表达载体的选择和载体构建方法核酸疫苗常以高效哺乳动物细胞表达质粒为载体或采用逆转录病毒载体。质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝扩增，哺乳动物细胞内高效表达，而不能复制，同时也不含有在宿主细胞基因中整合的序列。目前常用于构建核酸疫苗的表达质粒主要包括(1)pcDNA3Invitrogen公司开发的商品化质粒载体，是常用的克隆与表达目的基因载体，含CMV立即早期启动子、多克隆位点及牛生长激素多聚腺苷酸信号序列，采用新霉素抗性基因进行抗性筛选。(2)pVAX1Invitrogen公司开发的商品化质粒载体，为FDA批准唯一用于核酸疫苗的表达载体，含CMV和T7启动子、BGH多腺苷酸信号尾和Kan抗性基因。(2)pRC/CMVClontech公司开发的商品化质粒载体，广泛用于研究，含CMV立即早期启动子，外源基因有较高的表达效率，注射后可产生较高的体液免疫及细胞免疫应答。(3)pCIPromega公司开发的商品化质粒载体，含CMV立即早期启动子、多克隆位点、SV40晚期多聚腺苷酸信号序列及能够提高目的基因表达水平的嵌合型内含子。载体的选择和构建方法对于提高核酸疫苗的免疫效应至关重要。其影响因素主要包括(1)目的基因片段的优化和连接方法核酸疫苗本身不带目的基因的蛋白合成系统，完全依赖于宿主细胞调控。将外源基因优化为宿主细胞偏好的密码子，可改善目的蛋白的合成，从而增强免疫效果。对于多个片段组成的共表达形式，各个片段之间的连接方式亦非常重要。目前大多数学者主张采用Gly4Ser1编码基因的2-4次重复序列作为不同基因片段之间的连接序列，以利于蛋白质更好地表达及生物学活性的稳定。此外，目的基因转录翻译起始区应含有核糖体结合位点，以提高基因转录和蛋白质的表达效率。
(2)外源基因转录启动子/增强子序列一类是致病性的病毒启动子，在多数哺乳动物细胞中具有较高水平的转录起始能力，目前认为hCMV启动子较SV40及MPSV启动子能更好地发挥作用。另一类是哺乳动物启动子，适合在人体或动物中使用，如来自哺乳动物的MHC I启动子/增强子BL3-60prmtr(HarmsJS，et al.Braz J Med Biol Res1999，32155-62)，人肌肉特异性肌酸激酶启动子(Baztlett et al.，1996)；鼠金属硫蛋白基因启动子、免-β心肌重链及轻链1/3增强子；β-actin启动子与CMV增强子合用等(Niwa etal.，1991)。
(3)内含子序列载体中插入的内含子序列有利于抗原的高效表达，可能因为RNA聚腺苷酸化和/或核转录连接的RNA剪切速率提高的缘故。Brinster等研究表明，内含子可提高转基因鼠的外源基因转录效率10-100倍。内含子序列位于抗原基因编码区的上游才能较好地促进外源基因的表达，增强免疫应答。目前已有载体本身包含了能增强外源基因转录翻译的内含子序列，如pCI载体中含有嵌合型内含子序列。
(4)聚腺苷酸化(poly A)信号聚腺苷酸化信号序列定位于多克隆位点的下游，可提高转录RNA的稳定性及翻译效率，促进目的基因的有效加工。核酸疫苗载体中聚腺苷酸化终止序列常来源于牛生长激素或晚期SV40聚腺苷酸化信号，如pcDNA3.1mychis(BGH、SV40)、pCI(SV40)、VR1012(BGH)、pVAX1(BGH)等。
(5)其它免疫增强序列1)CpG基序作为免疫调节序列来源于细菌的DNA序列有调控动物免疫功能的作用，这些序列大部分是以CpG(非甲基化胞苷酸鸟苷)为基元的寡聚体，其排列通常遵循5-purpur CG pyrpyr-3的规律(Krieg AM，et al.，Nature1995，374546-9)。CpG可诱导IL-2的释放、增加内源性IFN-γ的合成，下调IgE水平，具有TH1定向免疫调节的优势，因此广泛用于多种慢性病毒性感染、过敏性疾病以及肿瘤核酸疫苗的研制。
2)细胞因子的免疫佐剂效应业已发现多种细胞因子具有免疫佐剂作用，可调节免疫应答的强度和方向。TH1细胞主要产生IL-1、IFN-γ，在促进细胞免疫、清除细胞内病原体方面具有优势；TH2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，以促进抗体产生为主，而IL-4又对TH1细胞因子产生明显的抑制作用。在核酸疫苗的应用中，通常倾向于采用细胞因子作为佐剂。在使用方式上，除可直接使用细胞因子外，还可以将细胞因子表达质粒与疫苗质粒共免疫，或构建共表达质粒。IL-2是目前广泛使用的细胞因子佐剂，在不同的模型中均表现出增强机体免疫保护作用。如融合或非融合形式的IL-2与乙肝病毒表面抗原的共表达质粒可导致体液和细胞免疫反应水平的升高(Chow YH，et al.，J Immunol1998，1601320-9)。与IL-2相比，IL-12是使抗原特异性幼稚CD4+细胞向TH1方向转变的更为关键的细胞因子，能调节免疫应答向着有益的TH1型方向发展，在核酸疫苗研制中越来越多地被采用。
3)共刺激因子的佐剂效应共刺激因子(costimulatory factors)如B7、ICAM-1、VCAM-1、LFA-3等是T细胞激活的第二信号，目前较受重视的是B7-1(CD80)和B7-2(CD86)分子。TCR与抗原结合产生T细胞活化的第一信号，而T细胞表面的CD28/CTLA-4与抗原提呈细胞表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被充分活化。缺乏B7等共刺激分子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫耐受。用B7基因(Allovectin-7)转染肿瘤细胞，可打破机体对肿瘤细胞的免疫耐受状态，能引起强烈的免疫反应，使肿瘤消退。在艾滋病核酸疫苗的研究中，以B7基因与HIV-1重组质粒共同接种，虽不能使体液免疫显著改变，但CTL应答显著增强，且TH细胞发生增殖。
3.核酸疫苗的制剂及给药途径其它增强疫苗免疫应答的措施主要取决于制剂及给药途径。目前，核酸疫苗的主要制剂形式是脂质体药物形式，脂质体包裹既是一种制剂形式，同时又是一种良好的免疫佐剂。脂质体药物的主要优点是1)脂质体药物具有缓释和较好的靶向作用，主要分布于网状内皮细胞，能有效地增强巨噬细胞和树突细胞对抗原的摄取、提呈，故能有效地刺激T细胞。2)脂质体能靶向性激活MHC-I和MHC-II类分子的处理和递呈，刺激IL-2的产生。这些特性有助于提高机体细胞免疫和体液免疫应答。3)脂质体无免疫原性，不过敏，性质稳定，机体耐受良好。4)可粘膜给药，产生高水平分泌性IgA，提高粘膜局部免疫能力。
核酸疫苗的免疫途径有多种(见表2)，以肌肉注射接种较为常见。但传统的给药途径存在不足，这主要在于疫苗进入机体后，能被机体细胞摄入并表达的外源基因终究是少数。故近年来相继开发出了许多新型DNA导入方法。如基因枪技术(Yang Ns，et al.，1980)、阳离子脂质体(Gregoriadis et al.，1997)、Cochleate包被(Mannino RJ et al.，1997)、可降解微粒包裹(Jone et al.，1997)、某些细菌减毒株(Darji A et al.，1997)等。国外近年来开发的一些给药系统专利产品见表3。
表2核酸疫苗相关的免疫途径注射途径报道作者肌肉注射Davis，et al.，1996皮下注射Yokeyama，et al.，1996；Liu et al.，1997皮内注射Gramzinski，et al.，1993；Condon et al.，1996腹腔注射Fynan et al.，1993静脉注射Fynan et al.，1993；Zhang GF，et al.，1999动脉注射Nabel，et al.，1993口腔粘膜Jones DH，et al.，1997；Chen SC.，et al.，1998鼻腔粘膜Fynan EF，et al.，1993；Sasaki S，et al.，1998支气管粘膜 Tsan MF，et al.，1995；Meyer KB，et al.，1995
生殖道粘膜 Wang B，et al.，1997；Livingston JB，et al.，1998颊内注射Etchart et al.，1997；Hinkula et al.，1997乳腺内注射 Furth et al.，1992表3 国外开发的给药系统专利产品给药系统 开发/或专利拥有公司1.PowderJect systemPowderJect vaccines Inc(Oxford，London and Madison，Wisconsin)2.Lipoplex-Biovector systemBITVECTOR THERAPEUTICS3.Biojector2000?jet Bioject Medical Technologies Incinjection delivery system(Vical，U.S.A)4.Geneswitch Gene Medicine Inc(U.S.A)5.Bacfotection Institute of Human Virology(IVH，U.S.A)目前并没有一种具有绝对优势的给药途径。肌肉注射仍是使用最广、效果较肯定的一种；粘膜免疫能较好地诱导产生分泌性IgA抗体；基因枪接种诱生的血清抗体水平最高，而细胞免疫应答略嫌不足；静脉注射易扩散至淋巴结甚至骨髓处，有可能转染分裂活跃的干细胞而导致细胞恶变，故难以应用到临床。因此根据核酸疫苗的类型和用途，采用相应的接种措施，才有可能取得最佳的免疫防护效果。


本发明所要解决的技术问题是提供一种能大幅度提高慢性乙肝病毒感染的预防和治疗效果的新型乙肝病毒基因片段组合核酸疫苗。
本发明公开的新型乙肝病毒基因片段组合核酸疫苗是一种包含乙型肝炎病毒非天然新型基因片段组合的表达载体，该表达载体是将所述的基因片段组合连接到各种非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中获得的。
所述的基因片段组合为PreS2S+linker+preS2，简称S2SS2，分子量为43KD，其碱基序列见序列6，氨基酸序列见序列7；其中linker片段基因序列为[(GGT)4TCT1]n，n＝2～4次重复，其编码aa为(Gly4Ser1)；基因序列来自于中国HBV感染者血清，其基因型为B或C型。
所述的非复制型哺乳动物细胞高效表达载体为pcDNA系列、pRc/CMV、pCI或pVAX1等。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述核酸疫苗的制备方法。
本发明公开的上述核酸疫苗的制备方法包括(1)HBVDNA模板制备取中国HBV慢性感染患者混合血清，设计5’-端包含Kpn I酶切位点(引物序列1，PF1)、3’-端包含linker融合负链(引物序列2，PL1)的preS2/S基因扩增引物以及5’端包含linker融合正链(引物序列3，PL2)、3’端包含Not I的酶切位点(引物序列4，PB2)的preS2引物，分别扩增preS2/S片段及preS2片段，经凝胶回收纯化的preS2/S片段与preS2片段采用PCR方法(引物序列1、序列4)进行连接和扩增，得到全长preS2/S preS2基因片段；preS2/S preS2基因片段经凝胶回收、纯化。
(2)将步骤(1)获得的基因片段连接到非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中，将其大量扩增纯化，即得。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述核酸疫苗在制备预防和治疗人或哺乳动物乙肝病毒感染疫苗中的应用。
本发明S2SS2疫苗可用于哺乳动物或人体的HBV持续感染的预防和治疗，其中预防人群为经检测未受HBV感染群体或经常规HBV疫苗注射后无免疫应答的个体。HBV持续感染包括HBV携带者、各种慢性乙肝患者、乙肝肝硬化及乙肝后肝癌而HBV DNA复制活跃者、HBV DNA呈整合状态者等。
本发明S2SS2疫苗可制成生理上可以接受的液体制剂、乳液制剂、冻干制剂等。经皮下、肌肉、静脉、腹腔内注射或口服、金或钨颗粒包被基因枪轰入等途径给药。
大部分乙肝核酸疫苗所使用的编码基因来源于前S/S区和C区。前S/S区的基因天然组合方式有S、preS2/S、preS1/preS2/S三种，分别编码乙肝病毒外膜抗原的主蛋白、中蛋白和大蛋白。我们采用了前S/S片段的非天然重复组合，具体组合方式为preS2S+linker+preS2。选择重复preS2拷贝的原因在于1)前S2表面含有多聚人血清白蛋白受体(PHSR)，HBV可通过前S2蛋白、S蛋白与肝细胞表面受体结合进入肝细胞，从而导致病毒的感染。2)前S2还与病毒的免疫逃避、宿主细胞核内整合具有相关性。前S2蛋白和单体人血清白蛋白联结后，稳定存在于血液循环中，逃避机体的抗病毒免疫应答。因此采用重复preS2拷贝的包含前S/S基因片段组合的乙肝核酸疫苗从理论上讲具有更好的预防及治疗效应。
本发明哺乳动物细胞表达载体选择了pcDNA系列、pRc/CMV、pCI或pVAX1等。其中1)pcDNA3.1/mychis为Invitrogen公司开发的商品化载体，含高效转录启动的hCMV启动子、BGH和SV40多聚腺苷酸信号序列、氨苄青霉素与neo抗性基因、方便的多克隆位点等。
2)pCI为Promega公司开发的商品化载体，含hCMV启动子、SV40多聚腺苷酸信号序列、氨苄青霉素抗性基因、常用的多克隆位点以及促使目的蛋白高效表达的嵌合性内含子。
3)pVAX1为Invitrogen公司开发的商品化载体，亦是FDA批准的唯一用于预防性核酸疫苗的载体。pVAX1含pUC骨架、CMV和T7启动子、BGH多聚腺苷酸信号序列、多克隆位点以及Kan抗性基因，分子量较小。
用本发明核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2、pVAX1-S2SS2对BALB/c(H-2d)小鼠细胞及体液免疫应答进行试验一.实验方法1.实验动物及分组健康雌性BALB/c(H-2d)小鼠(上海西浦尔-必凯公司)，6-8周龄，体重18-20g，清洁级，标准化环境饲养。
随机分组如下载 体 pcDNA3.1 pVAX1实验组 ①S2SS2①S2SS2
②S2S ②S2S空白对照 生理盐水 生理盐水阴性对照 pcDNA3.1/mychis/LacZ pVAX12.接种方式双侧胫前肌注射，100μg/只/次；2、4周后各加强接种1次。
空白对照组接种100μl生理盐水/只/次3.免疫应答的检测(1)接种部位的抗原表达乙肝核酸疫苗接种后第10天，处死部分小鼠，取接种部位肌肉组织，中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，制作单个组织蜡块。
将同批组织制成组织芯片，采用常规切片，免疫细胞化学技术检测接种部位肌肉组织的preS2Ag、HBsAg表达。I抗分别采用抗前S2单抗、抗HBs单抗，DAB显色。
(2)小鼠血清特异性抗体初次接种后3周、5周、8周、12周，采集小鼠眶静脉血，检测前S2抗体、抗-HBs。
试剂分别采用乙肝前S2抗体检测试剂盒(北医大肝炎试剂中心)、乙肝表面抗体检测试剂盒(华美)。
(3)体外CTL活性初次接种后5周，每组处死部分小鼠，采用LDH细胞毒性检测试剂盒，进行体外CTL活性测定。基本原理是核酸疫苗接种小鼠后，诱生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CTL体外遇到表达特异性病毒抗原和同源性MHC I类分子的靶细胞，可使之破坏并释放出含有乳酸脱氢酶(LDH)的细胞内容物。通过检测细胞培养上清中LDH酶的活性，了解靶细胞破坏的程度，从而计算出小鼠的体外CTL活性(以百分率表示)。
首先收集处于对数生长期的靶细胞，PBS洗涤2次，用培养基(含1％FBS的RPMI 1640培养基)重悬细胞并计数。放血处死小鼠，无菌取脾置200目不锈钢筛网上，用2mL注射器针芯研磨，制备脾细胞悬液。用PBS洗涤脾细胞2次后，加入5ml LAK红细胞裂解液(0.15mol/L NH4Cl·1mmol/L NaHCO3·0.1mmol/L Na2EDTA，PH7.2)重悬，室温静置5min。10000rpm离心3min；沉淀用PBS洗涤2次后，加入培养基重悬计数，作为效应细胞，其中含有较多的CTL和CTL前体细胞。取3×107效应细胞，加入5×105靶细胞(60Co 10000rad预处理)，37℃，5％CO2共同孵育5天。将靶细胞浓度调整为5×104/ml，强化刺激后的效应细胞用培养基梯度稀释，使效应细胞与靶细胞的浓度比分别为100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1，二者按等体积加入96孔培养板，每种比例3个复孔，同时设置系列对照(表4.1.1)。37℃，5％CO2孵育4h；室温1000g离心10min；取上清100μl/孔，转至96孔酶标板的对应孔，加入LDH底物100μl(临用前新鲜配制)，室温避光显色15～30min，自动酶标仪测双峰OD值(测量波长490nm，参考波长655nm)。
体外CTL活性(％)计算公式 高限对照---靶细胞最大释放值低限对照---靶细胞自然释放值表4.1.1体外CTL活性检测的对照设置内容物 背景对照 低限对照 高限对照 效应细胞自然 效/靶实验(μl) (μl) (μl)释放值(μl)值(μl)培养基 200 100- 100 -靶细胞-100 100 - 1002％TritonX-100- -100 --效应细胞 - - - 100μl 100二.实验结果(一)接种部位的抗原表达常规免疫细胞化学方法检测显示实验组的S基因均得到高效表达，而前S2抗原表达较弱。对照组检测结果均为阴性。
(二)血清特异性抗体1.以pcDNA3.1为载体的乙肝核酸疫苗(1)前S2抗体
S2SS2组的抗体阳转率上升快，5周时已达到87.5％并保持到12周以上；S2S组抗体阳转率最高62.5％。对照组血清前S2抗体检测全部阴性。见图9S2SS2组的前S2抗体最高滴度1∶2000；S2S组最高值1∶500。见图10(2)抗-HBsS2SS2组和S2S组的抗体阳转率分别达到62.5％和75％。对照组血清抗HBs检测全部阴性。见图7S2S组抗体最高滴度1∶1000，而S2SS2抗体滴度低于1∶100。见图82.以pVAX1为载体的乙肝核酸疫苗(1)前S2抗体S2SS2的抗体阳转率达到85.7％，高于S2S组的66.7％。对照组血清前S2抗体检测全部阴性。见图13S2SS2组的前S2抗体最高滴度1∶100以上；S2S组仅为1∶10。见图14(2)抗-HBsS2SS2和S2S组的抗体阳转率分别达到85.7和50％；见图11抗体最高滴度分别为1∶100和1∶50。对照组血清抗HBs检测全部阴性。见图12(三)体外CTL活性S2SS2和S2S的体外CTL活性分别达到36.9％和19.14％左右。对照组数值较低，可能是NK细胞等作用的结果。见图15三.结论小鼠接种乙肝核酸疫苗后10天，接种部位出现目的抗原的表达。
无论使用何种载体，S2SS2和S2S组疫苗免疫后均诱生出前S2抗体。S2SS2组的抗体阳转率上升最快，5周时达到80％以上并可保持到12周，大大高于S2S组；S2SS2组的抗体水平亦大大高于S2S组。显示含S2多拷贝基因的S2SS2核酸疫苗突出优势在于诱生较强的前S2抗体水平，这对于乙肝的预防和治疗具有重要意义。
此外，S2SS2和S2S核酸疫苗都能诱生一定水平的体外CTL活性。
用本发明核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2对HBV DNA转基因C57BL/6(H-2b)小鼠的治疗作用进行研究一.实验方法1.实验动物HBV DNA转基因C57BL/6(H-2b)小鼠，雌雄各半，3-5月龄，体重25-30g，SPF级，SPF标准环境下饲养。
2.动物分组实验组①S2SS2②S2S对照组pcDNA3.1/mychis/LacZ3.接种方式与BALB/c小鼠相同4.免疫效应的检测(1)血清特异性抗体接种前1周和接种后3周、5周、8周，分期眶静脉采血，检测血清抗-HBs和前S2抗体。
(2)血清HBV DNA水平采用HBV DNA定量PCR检测试剂盒，按说明书操作。
(3)肝组织中的抗原表达接种前3天和接种后3周、5周、8周，分别用1％戊巴比妥钠50mg/Kg体重腹腔内麻醉C57BL/6小鼠，无菌手术剖腹，切取0.5×0.5CM2大小的肝组织，中性福尔马林固定。手术后关闭腹腔继续观察饲养。同批小鼠肝组织制成组织芯片，常规切片及免疫细胞化学技术检测前S2抗原、HBsAg。
二.实验结果1.肝组织中的抗原表达乙肝核酸疫苗接种前，小鼠肝组织均存在HBsAg及preS2Ag的表达并主要分布于细胞浆内。见图16、图17，阳性对照见图18、19，阴性对照见图20。接种后第5～8周时，抗原表达呈减弱趋势，部分小鼠抗原表达甚至完全消失，但各组之间差异不明显。
与此同时，对照组小鼠肝组织中的上述抗原表达在接种前和接种后第5、8周比较无明显变化。
2.外周血特异性抗体①抗-HBs
接种乙肝核酸疫苗后，S2SS2和S2S组小鼠的抗-HBs阳转率分别达到100％和40％。见图21抗-HBs最高滴度均为1∶50。见图22对照组血清抗-HBs检测全部阴性。
②前S2抗体S2SS2和S2S组小鼠前S2抗体检出率低，＜25％。
对照组前S2抗体检测全部阴性。
③血清HBV DNA定量接种乙肝核酸疫苗后，小鼠血清HBV DNA水平似呈逐次降低的趋向。见图23与此同时，阴性对照组的血清HBV DNA水平无明显变化。
三.结论转基因小鼠接种乙肝核酸疫苗后，HBV DNA水平有逐次降低的趋向，肝组织中HBsAg和preS2Ag表达呈减弱趋势甚至完全消失；S2SS2组小鼠的抗-HBs阳转率达100％，高于S2S组。表明核酸疫苗S2SS2能全部或部分终止转基因小鼠对HBV DNA的免疫耐受状态，从而为HBV慢性感染者的治疗提供强有力的理论依据。


图1 HBV S2S、S2片断及其PCR连接产物电泳图其中1为S2S(890bp)；2为S2(220bp)；3为PCR连接产物(S2SS2、S2)；M为DNAmarker DL-2000图2重组质粒pcDNA3.1-S2SS2的构建示意3以pcDNA3.1为载体的重组质粒的酶切图谱其中1为pcDNA3.1-S2S；2为pcDNA3.1-S2SS2；M为DNAmarker DL-15000图4以pVAX1为载体的重组质粒的酶切图谱其中1为pVAX1；2为pVAX1-S2SS2；4为pVAX1-S2S；M为DNA markerλ/EcoR T14图51-2pVAX1/S2SS2测序图谱图6 SP2/0-S2SS2细胞裂解物的western blot电泳图其中1-4为SP2/0-S2SS2细胞裂解物，N为SP2/0-CMV，P为阳性对照图7 pcDNA3.1载体核酸疫苗诱导小鼠HBs抗体阳转率图8 pcDNA3.1载体核酸疫苗诱导小鼠HBs抗体产生水平图9 pcDNA3.1载体核酸疫苗诱导小鼠前S2抗体阳转率图10 pcDNA3.1载体核酸疫苗诱导小鼠前S2抗体水平图11 pVAX1载体核酸疫苗诱导小鼠HBs抗体阳转率图12 pVAX1载体核酸疫苗诱导小鼠HBs抗体水平图13 pVAX1载体核酸疫苗诱导小鼠前S2抗体阳转率图14 pVAX1载体核酸疫苗诱导小鼠前S2抗体水平图15 体外CTL活性检测图16 HBsAg在C57BL/6小鼠肝组织中的表达40×10，DAB显色，细胞浆内可见棕黄色弱阳性信号，提示HBsAg表达为胞浆型图17 preS2Ag在C57BL/6小鼠肝组织中的表达40×10，DAB显色，细胞浆内可见棕黄色阳性信号，提示HBsAg表达为胞浆型图18 HBsAg阳性对照(人肝组织)40×10，DAB显色，细胞浆内、膜上可见棕黄色强阳性信号，提示HBsAg表达为胞浆型、膜型图19 preS2Ag阳性对照(人肝组织)40×10，DAB显色，细胞浆内可见棕黄色阳性信号，提示preS2Ag表达为胞浆型图20 C57BL/6小鼠阴性对照(肝组织)40×10，DAB显色，细胞浆、核内及膜上均未见棕黄色阳性表达信号图21 转基因小鼠外周血抗-HBs阳转率图22 转基因小鼠外周血抗-HBs水平图23 转基因小鼠接种后的血清HBV DNA变化

(2)制备方法取上述血清200μl，加入含200μg/mL蛋白酶K的(临用时加)TNES(10mmol/L Tris.Cl PH8.0，150mmol/L NaCl，25mmol/L EDTAPH8.0，1％SDS(W/V))混匀，孵育4小时；再加入等体积酚充分混匀，10000r/min离心10分钟；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇混匀，10000r/min离心10分钟；弃上清，沉淀中加入200μl 70％醇洗涤，12000r/min离心5分钟；去上清，沉淀晾干，溶于30ul TE中。
2.preS2S、preS2基因的扩增(1)引物合成根据GenBank中已经报道的中国患者HBV感染主要型别(基因型B、C)基因序列设计通用引物，委托宝生物工程(大连)有限公司合成(PAGE纯化)，用纯水溶解稀释为10μmol/L浓度，分装贮存于-20℃。preS2S、preS2基因引物、带linker片断引物、片断连接引物序列见下表。
表4 PCR扩增及连接引物PCR productsForward Backward LengthpreS2SPF1(KpnI) PB1(NotI) 866bppreS2S_ PF1(KpnI) PL1(融合负链) 891bp_preS2PL2(融合正链) PB2(NotI) 225bppreS2S-preS2PF1(KpnI) PB2(NotI) 1070bp
①preS2S的基因扩增取HBV模板5μl、dNTPmix200μmol/L、pyrobest polymerase0.5U/50μl及引物PF1、PB1进行PCR扩增。循环参数设置为预变性94℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec，循环35次；72℃延伸10min。反应结束后，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，切胶回收分子量约为870bp的目的条带(preS2S)，按Qiagen胶回收试剂盒说明书操作。最后用50μl纯水洗脱备用。
②preS2S的基因扩增引物使用PF1、PL1，循环参数同上。PCR反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化约890bp的目的条带。见图1。
③preS2的基因扩增引物使用PL2、PB2，循环参数采用预变性94℃3min；94℃15sec，58℃15sec，72℃20sec，循环35次；72℃延伸5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化约220bp的目的条带。见图1。
3.preS2S与preS2基因的连接、扩增引物使用PF1、PB2，DNA模板使用“preS2S_”、“_preS2”，循环参数设置为94℃ 5min，55℃2min，72℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃60sec，循环35次；72℃延伸10min。PCR反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶分离回收分子量约1070bp的大分子目标条带(preS2SpreS2，简称S2SS2)。见图1。
实施例2、哺乳动物细胞表达载体核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2的构建1.目的基因片段S2SS2与载体pcDNA3.1/mychis/lacZ的双酶切及连接KpnI、NotI双酶切载体和DNA插入片段，37℃4h。将酶切产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察载体是否酶切完全。分离纯化酶切后的载体和DNA插入片段，取插入片段4μl、载体(1∶5～20稀释)1μl混匀，加入等体积的sol I(Takara)，16℃保温1h或连接过夜。
2.连接产物转化感受态JM109及重组子筛选在连接反应的产物中，加入5mol/L NaCl至终浓度150mmol/L，再与新鲜制备的感受态菌JM109 60～80μl混匀，冰浴30min；37℃2min；立即冰浴2min。加入SOC培养基500μl混匀，37℃250rpm震摇1h。取200μl转化菌液，涂布于LB/Amp抗性平板上(预先涂布X-gal/IPTG)，37℃培养过夜。
3.重组质粒的筛选从LB/Amp抗性平板中央挑取15个白色菌落，分别置于5mlLB(含Amp100μg/mL)液体培养基中，37℃250rpm震摇8～16h。小样提取质粒，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，以空载质粒为对照。如重组质粒分子量大于空载质粒，继续用KpnI和NotI双酶切鉴定。当酶切后的载体和插入片段分子量大小与预期值相符时，继续测序分析。
经多克隆测序证实，得到了核酸疫苗哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-S2SS2质粒。重组质粒pcDNA3.1-S2SS2的构建示意图见图2。以pcDNA3.1为载体的重组质粒的酶切图谱见图3。
实施例3、哺乳动物细胞表达载体核酸疫苗pCI-S2SS2的构建1.目的基因片段S2SS2与载体pCI的双酶切及连接KpnI、NotI双酶切pCI质粒载体和DNA插入片段，37℃4h。分离纯化酶切后的载体和DNA插入片段，取插入片段4μl、载体(1∶5～20稀释)1μl混匀，加入等体积的sol I(Takara)，16℃保温1h或连接过夜。
2.连接产物转化感受态JM109及重组子筛选在连接反应的产物中，加入5mol/L NaCl至终浓度150mmol/L，再与新鲜制备的感受态菌JM109 60～80μl混匀，冰浴30min；37℃2min；立即冰浴2min。加入SOC培养基500μl混匀，37℃250rpm震摇1h。取200μl转化菌液，涂布于LB/Amp抗性平板上(预先涂布X-gal/IPTG)，37℃培养过夜。
3.重组质粒的筛选从LB/Amp抗性平板中央挑取15个白色菌落，分别置于5mlLB(含Amp100μg/mL)液体培养基中，37℃250rpm震摇8～16h。小样提取质粒，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，以空载质粒为对照。如重组质粒分子量大于空载质粒，继续用KpnI和NotI双酶切鉴定。当酶切后的载体和插入片段分子量大小与预期值相符时，继续测序分析。
经多克隆测序证实，得到了核酸疫苗哺乳动物细胞表达载体pCI-S2SS2质粒。
实施例4、哺乳动物表达载体核酸疫苗pVAX1-S2SS2的构建1.目的基因片段S2SS2与载体pVAX1的双酶切及连接Kpn I、Not I双酶切pVAX1质粒载体和DNA插入片段，37℃4h。分离纯化酶切后的载体和DNA插入片段，取插入片段4μl、载体(1∶5～20稀释)1μl混匀，加入等体积的sol I(Takara)，16℃保温1h或连接过夜。
2.连接产物转化感受态JM109及重组子筛选在连接反应的产物中，加入5mol/L NaCl至终浓度150mmol/L，再与新鲜制备的感受态菌JM109 60～80μl混匀，冰浴30min；37℃2min；立即冰浴2min。加入SOC培养基500μl混匀，37℃250rpm震摇1h。取200μl转化菌液，涂布于LB/Amp抗性平板上(预先涂布X-gal/IPTG)，37℃培养过夜。
3.重组质粒的筛选从LB/Amp抗性平板中央挑取15个白色菌落，分别置于5mlLB(含Amp100μg/mL)液体培养基中，37℃250rpm震摇8～16h。小样提取质粒，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，以空载质粒为对照。如重组质粒分子量大于空载质粒，继续用Kpn I和Not I双酶切鉴定。当酶切后的载体和插入片段分子量大小与预期值相符时，继续测序分析。
经多克隆测序证实，得到了核酸疫苗哺乳动物细胞表达载体pVAX1-S2SS2质粒。
序列分析证实，pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2三种表达载体的S2SS2序列完全一致。其片段长度为1053bp，根据S基因序列确定为基因型C、血清亚型adrq+。其中preS2S基因843bp，无终止密码子；下游preS2基因165bp，无起始密码子ATG引入终止密码子TAA；中间linker为[(GGT)4(TCT)1]3组成，编码的preS2抗原133-141aa均为DPRVRGLYL，S抗原28-39aa为IPQSLDSWWTSL(见图4-5)。
所有插入片段的起始密码子ATG上游均为ACC，符合哺乳动物细胞表达载体Kozak序列的要求，插入片段末端均加有终止密码子。实施例5、pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2细胞转染及表达检测1.SP2/0细胞的传代培养及G418最低完全致死量测定SP2/0细胞来源于BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系，培养液为RPMI1640完全培养基。临用前加入20％FBS、L-谷氨酰胺2mmol/L、青霉素200u/mL、链霉素200u/mL、HEPES 25mmol/L、0.15％NaHCO3，调节pH至7.4。培养条件为37℃，5％CO2，95％相对湿度。每3-5d传代1次。
经采用MTT分析法，得出SP2/0细胞的G418最低完全致死量为400μg/mL。
2.重组质粒转染SP2/0细胞采用磷酸钙法，将重组质粒pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2及空载体稳定转染SP2/0细胞。pCI和pVAX1载体需和pSV2-neo质粒共转染。
转染细胞经含G418抗性培养基持续作用约2周后，存活细胞采用有限稀释法，分离出单克隆细胞并继续培养并鉴定。
3.RT-PCR检测目的基因转录的mRNA转染细胞用PBS洗涤后，加入1ml Trizol混匀并静置5min。加入等体积氯仿混匀，室温放置2～3min；4℃12000g离心15min后取上清，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10min；4℃12000g离心10min，沉淀用75％乙醇洗涤后晾干，加入DEPC处理水20μl溶解。此为转染细胞的总RNA，采用特异性的引物，通过RT-PCR扩增目的基因片段S2SS2，PCR产物电泳观察有无目的条带出现。
结果3种不同载体重组质粒转染SP2/0细胞，得到的克隆细胞株提取总RNA，RT-PCR分别扩增出与S2SS2分子量相符的DNA条带，而空载质粒转染细胞则为阴性。
4.ELISA检测HBsAg表达经RT-PCR证实存在目的基因转录的细胞株，收集细胞并加入适量的细胞裂解液，用20gauge注射器针头反复抽打至无粘液丝出现，冰上放置10min；4℃12000g离心10min。取上清，采用HBsAg的ELISA检测试剂盒，检测单克隆细胞株是否表达目的抗原蛋白。
结果提示3种不同载体重组质粒转染SP2/0细胞均获得了S2SS2检测阳性细胞株。
5.Western blot检测取ELISA检测结果阳性的细胞株裂解蛋白，进行SDS-PAGE电泳，以空载质粒转染细胞为阴性对照，以乙肝携带者血清(HBsAg阳性)为阳性对照。电泳结束后，将凝胶蛋白质电转移至PVDF膜，室温封闭1h。加入相应的I抗(HBs单抗1∶200；前S2单抗1∶100)，4℃过夜。经洗膜后再加入II抗(羊抗鼠IgG-AP，1∶1000)，室温3h；最后用NBT/BCIP显色。
结果ELISA检测HBsAg阳性株，经Western blot鉴定，表达的S2SS2蛋白呈约43KD大小条带，分子量与预期相符(S2SS2连接部分约3KD，见图6)实施例6、核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2的大量制备方法将重组质粒及空载质粒转化感受态JM109，涂布LB平板(Amp或Kan抗性)孵育过夜；挑取单一菌落大量扩增，应用Qiagen MegaEndofree纯化系统，按说明书操作获得高纯度的质粒超螺旋部分不少于2/3，无RNA及蛋白质残留，无内毒素污染。经双酶切鉴定、紫外分光光度计定量后，无菌生理盐水稀释成1ug/ul，即为乙肝核酸疫苗。分装后置-80℃冰箱保存。
序列表<110>成都地奥 集团药物研究所<120>一种新型预防和治疗乙肝病毒感染的核酸疫备及制备方法<130>说明书、权利要求书<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>36<212>DNA<213>引物PF1<400>1gcgggtacca tgcagtggaa ctccacaaca ttccac 36<210>2<211>57<212>DNA<213>引物PL1<400>2accagaacca ccaccaccag aaccaccacc accaatgtat acccaaagac aaaagaa 57<210>3<211>60<212>DNA<213>引物PL2<400>3ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctcagt ggaactccac aacattccac60<210>4<211>39
<212>DNA<213>引物PB2<400>4atagcggccg cttagttcgg tgcagggtcc ccagtcctc39<210>5<211>38<212>DNA<213>引物PB1<400>5ggggcggccg cttaaatgta tacccaaaga caaaagaa 38<210>6<211>1053<212>DNA<213>S2SS2碱基序列<400>6atgcagtgga actccacaac attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60tatcttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctct120cccatatcat caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaacatgga gaacacaaca180tcaggattcc taggacccct gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc240ctcacaatac cacagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca300cccacgtgtc ctggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt360cctccaactt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc420atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc480gtttgtcctc tacttccaga aacttcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg540attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga600
aactgcactt gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg caagattcct atgggagtgg 660gcctcagtcc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg 720ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 780tacaacatct tgagtccctt tttaccgcta ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 840attggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctca gtggaactcc 900acaacattcc accaagctct gctagatccc agagtgaggg gcctatatct tcctgctggt 960ggctccagtt ccggaacagt aaaccctgtt ccgactactg cctctcccat atcatcaatc 1020ttctcgagga ctggggaccc tgcaccgaac taa 1053<210>7<211>350<212>PRT<213>S2SS2编码氨基酸序列<400>7Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu50 55 60
Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Leu Pro Glu Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly
225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly275 280 285Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His290 295 300Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly305 310 315 320Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro325 330 335Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn340 345 350


本发明涉及一种新型乙肝病毒基因片段组合核酸疫苗。该疫苗是一种乙型肝炎病毒非天然新型基因片段组合pre S