专利名称：提取乙肝病毒核酸的方法乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)简称乙肝病毒(HBV)。是一种DNA病毒,属于嗜肝DNA病毒科(116口3(1的￥；^丨(^6)。根据目前所知,HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。到目前为止，根据 一些比较权威的统计结果来看，我国应该有乙型肝炎病毒(HBV)感染者I. 2亿，基本上占我国总人口的9. 09%，其中有1/4是慢性乙肝患者，大约是3000万。现有技术中针对乙肝核酸检测的试剂盒非常多，其中核酸的提取方法也非常多，例如煮沸法、柱提取法、磁珠法等。在上述这些提取方法中均存在问题，其中煮沸法较简便但引入的杂质过多，而且不能实现自动化；柱提取法提取步骤较多，虽然纯度很高，但自动化实现有困难；磁珠法实现自动化很简单，但所用试剂昂贵。
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种提取乙肝病毒核酸的方法，以使提取方法既可以实现自动化，又简便可行。基于上述目的，本发明提供的提取乙肝病毒核酸的方法包括以下步骤(I)活化磁珠采用活化剂活化磁珠，并用缓冲液洗涤活化后的磁珠；(2)抗体偶联将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，并用缓冲液洗涤偶联后的磁珠；加入淬灭液，与偶联后的磁珠混匀，并用缓冲液洗涤；在最后一次洗涤后，将磁珠重悬于缓冲液中，置于2 8°C下保存；(3)特异性结合将偶联后的磁珠与血清混合并震荡混匀，使得所述磁珠与血清中的乙肝病毒颗粒进行特异性结合；作用一段时间后，用磷酸盐缓冲液对所述磁珠进行洗涤，富集和除杂质；加入裂解液裂解病毒细胞，使得乙肝病毒核酸释放到溶液中；将所述溶液煮沸，取上清液。可选地，所述活化剂为I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺。可选地，所述裂解液为含表面活性剂的溶液。可选地，所述步骤(I)和(2)中洗涤时所用的缓冲液为2-(N_吗啉)乙磺酸缓冲液。可选地，所述方法应用于临床样品的直接检测。从上面所述可以看出，本发明提供的提取乙肝病毒核酸的方法通过将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，使得偶联后的磁珠在存在乙型肝炎病毒颗粒的血清中可以特异性地吸附病毒颗粒，用简单的缓冲液即可将多余的杂质去除，之后加入病毒裂解液将病毒细胞裂解，从而得到病毒核酸。由于磁珠的引入，可以使自动化变得简单，抗原抗体的高特异性反应使得提取时间变得更短，特异性强；所用的试剂比较简单易得。一、磁珠与抗体的偶联(一)、活化I、移取O. 5mL(IOmg)的Bi0MagPlus羧基磁珠至15mL尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液完全变清彻后，用吸管小心移弃上清液。2、加5mL MES缓冲液充分混匀洗涤，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。3、重复步骤2三次；最后一次洗涤后，将磁珠重悬于5mL MES缓冲液中。 4、将EDAC从冷藏处取出置于室温30分钟，准确称取所需的EDAC(例如，约I. 6mgEDAC/mg磁珠)加入装有磁珠的离心管内。5、剧烈振荡摇匀。6、室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应30分钟，反应过程中，注意不让磁珠沉淀聚集在一起。7、将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。8、重复步骤2四次，得到活化磁珠。(二 )、活化后的磁珠与抗体偶联I、计算需要偶联的乙肝病毒的特异性抗体量，每mg活化的羧基磁珠可以偶联20 500ug抗体。2、将抗体加至5mL MES缓冲液中配制成抗体储液。3、吸取50 μ L抗体储液于950 μ L MES缓冲液中，配成1:20的抗体液。4、将抗体液加入到装有活化磁珠的离心管内，剧烈振荡混匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上进行偶联反应，所述偶联反应的时间约16 24小时。5、将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。6、磁珠于重悬5mL MES缓冲液中，振荡摇匀，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。7、重复步骤6 —次。8、加入5mL淬灭液，振荡摇匀，室温下将离心管置于旋转混匀仪上30分钟。9、将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。(三)、洗涤和贮存偶联后的磁珠I、在步骤(二)所得的溶液中加入5ml缓冲液，并剧烈振荡摇匀进行洗涤，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。2、重复步骤I三次。3、最后一次洗漆后,将磁珠重悬于2ml洗漆缓冲液内，此时磁珠的浓度约为5mg/mLo4、置于2 8°C下保存。其中，必须注意的是I、偶联时不能使用含有氨基(例如，三氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris))或是羧基(例如乙酸盐、柠檬酸盐等)的缓冲液。2、可以通过偶联后的洗涤来去除偶联时产生的非偶联吸附物。3、延长振荡的时间有利于重悬磁珠。
二、偶联后的磁珠与血清中的乙肝病毒颗粒特异性结合并制备核酸。I、将磁珠悬起，混合均匀，吸取50 μ L磁珠与100 μ L待测血清混合。2、震荡混匀30s，放置5min，反复2次。3、放置在磁分离架上，磁珠吸附Imin。4、小心将上清吸走,尽量洗干净。5、用200 μ L的PBS缓冲液将磁珠重悬，混均匀。
6、重复步骤3、步骤4。7、重复步骤5、步骤6两次。8、加入50 μ L裂解液，将磁珠混匀。9、100。0煮51^11。10、至于磁分离架上，上清即可作为模板扩增；如不用，-20°C下保存。三、实验设计挑取20份含不同浓度的乙型肝炎病毒的血清样本进行提取，之后用商品化试剂盒对提取前后的血清进行检测，比较提取前后的病毒核酸数量变化。20份血清来自于临床，用上海科华的试剂盒进行提取，扩增定量，测试结果见表
Io表I科华试剂盒测定临床血清HBVDNA拷贝数


本发明公开了一种提取乙肝病毒核酸的方法，所述方法通过将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，使得偶联后的磁珠在存在乙型肝炎病毒颗粒的血清中可以特异性地吸附病毒颗粒，用简单的缓冲液即可将多余的杂质去除，之后加入病毒裂解液将病毒细胞裂解，从而得到病毒核酸。由于磁珠的引入，可以使自动化变得简单，抗原抗体的高特异性反应使得提取时间变得更短，特异性强；所用的试剂比较简单易得。