用于靶向递送siRNA的组合物制作方法_P·海德威格专利（靶向,siRNA,递送）-早鸽网

用于靶向递送siRNA的组合物制作方法

专利名称

用于靶向递送siRNA的组合物制作方法
发明者

P·海德威格, T·霍夫曼, E·A·基塔斯, D·L·刘易斯, P·莫尔, D·B·罗泽玛, W·瑟尔, L·C·瓦利斯, D·H·维基菲尔德
公开日

2013年1月9日
申请日期

2011年2月18日
优先权日

2010年2月24日
申请人

箭头研究公司
文档编号

C12N15/11GK102869774SQ201180010758
关键字

靶向 siRNA 递送组合用于
权利要求

1.一种用于体内递送寡核苷酸到肝脏细胞的组合物，所述组合物包括 a)共价连接于至少具有20个碳原子的疏水基团的寡核苷酸；和 b)可逆掩蔽和靶向的两亲性聚合物，所述聚合物包括从含胺单体、含低疏水性基团单体和含高疏水性基团单体合成的三元共聚物，其中多种半乳糖衍生物和PEG基团通过pH不稳定的双取代马来酸键与所述聚合物单独连接，且其中所述PH不稳定的双取代马来酸键的切割产生胺基，从而生成膜活化多胺2.一种用于体内递送寡核苷酸到肝脏细胞的组合物，所述组合物包括 a)共价连接于半乳糖三聚体的寡核苷酸；和 b)可逆掩蔽和靶向的两亲性聚合物，所述聚合物包括从含胺单体、含低疏水性基团单体和含高疏水性基团单体合成的三元共聚物，其中多种半乳糖衍生物和PEG基团通过pH不稳定的双取代马来酸键与所述聚合物单独连接，且其中所述PH不稳定的双取代马来酸键的切割产生胺基，从而生成膜活化多胺3.用于体内递送RNA干扰多核苷酸到肝脏细胞的偶联递送系统，所述系统包括4.一种生产RNA寡核苷酸递送组合物的方法，所述方法包括 a)形成膜活化多胺； b)形成包括含半乳糖衍生物的电荷中性双取代马来酸酐的第一掩蔽剂； c)形成包括含聚乙二醇的电荷中性双取代马来酸酐的第二掩蔽剂； d)可逆抑制膜活化多胺的膜活性，其中所述抑制由修饰所述多胺上50%或更多的胺组成，所述修饰通过将所述多胺与所述第一和第二掩蔽剂反应，从而使多种半乳糖衍生物和多种聚乙二醇通过生理pH不稳定的双取代马来酸连接膜活性多胺而实现，和 e)连接RNA干扰多核苷酸与半乳糖三聚体或具有至少20个碳原子的疏水基团； f)在适合体内给予的溶液中提供所述RNA干扰多核苷酸和可逆抑制的膜活化多胺5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA干扰多核苷酸选自下组DNA、RNA、dsRNA、RNA 干扰多核苷酸、siRNA、和 miRNA6.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述肝脏细胞由肝细胞组成7.如权利要求3或4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述膜活化聚合物含两种或更多不同单体8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述膜活化聚合物由含胺单体、低疏水性基团单体和高疏水性基团单体组成9.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述可逆掩蔽的膜活化多胺溶于水10.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述膜活化多胺是随机共聚物11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述随机共聚物选自聚乙烯醚和聚丙稀Ife酷12.如权利要求1、2或8中任一项所述的组合物，其特征在于，所述含胺单体、低烷基单体和高烷基单体以4-8个含胺单体3-5个低疏水性基团单体1个高疏水性基团单体的比例存在13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述低疏水性基团由丁基组成且所述闻疏水性基团由十八烧基或十~■烧基组成14.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述掩蔽剂可逆连接所述多胺上至少70%的胺15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述掩蔽剂可逆连接所述多胺上至少80%的胺16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述可逆修饰聚合物在pH8时具有+30—30mV的ζ电势17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述可逆修饰聚合在物ρΗ8时具有+20—20mV 的 ζ 电势18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述可逆修饰聚合物在ρΗ8时具有+IO-IOmV 的 ζ 电势19.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述可逆修饰聚合物在pH8时具有0—30mV的ζ电势20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述可逆修饰聚合物在ρΗ8时具有O—20mV的ζ电势21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述可逆修饰聚合物在ρΗ8时具有O-IOmV的ζ电势22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物在药学上可接受的载体或稀释剂中提供23.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，L2是马来酸连接24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，L2是双取代马来酸连接25.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，N通过生理不稳定连接L1连接Α26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，L1是垂直于L2的生理不稳定共价连接27.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，A包括具有20或更多碳原子的疏水基团28.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，A包括半乳糖三聚体29.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述连接所述聚合物的半乳糖衍生物与PEG的比例为105. -230.如权利要求1-29中任一项所述的组合物，其特征在于，所述半乳糖衍生物由N-乙酰基半乳糖胺组成31.如权利要求2-30中任一项所述的组合物，其特征在于，所述半乳糖三聚体由N-乙酰基半乳糖胺三聚体组成

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法律状态

专利名称：用于靶向递送siRNA的组合物的制作方法用于靶向递送siRNA的组合物将多核苷酸和其他基本不能穿透细胞膜的化合物递送到活细胞受到细胞复杂膜系统的限制。反义、RNAi和基因治疗中使用的药物是相对高亲水性的聚合物，且通常带较高负电荷。这些物理特征均阻止其直接扩散穿过细胞膜。基于此原因，多核苷酸递送的主要障碍是将多核苷酸递送穿过细胞膜到达细胞质或细胞核。一种已经用于体内递送小核苷酸的方法是将所述核酸与小靶分子或脂质或固醇结合。虽然已在这些偶联物中观察到一些递送和活性，但这些方法需要的核酸剂量非常大。已开发大量转染试剂，其能实现体外将多核苷酸相当有效地递送到细胞。然而，用这些相同转染试剂体内递送多核苷酸很复杂且由于体内毒性、血清相互作用和弱靶向而变得无效。体外作用良好的转染试剂，阳离子聚合物和脂质，通常形成大的静电颗粒并使细胞膜不稳定。体外转染试剂的正电荷有助于通过电荷之间(静电)的相互作用与核酸结合，因此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷还有益于载剂与细胞非特异性结合以及膜融合、去稳定化或破坏。膜的去稳定化有利于充分递送不能渗透细胞膜的多核苷酸穿过细胞膜。虽然这些特性有利于核酸体外转移，但它们会造成体内毒性和靶向失效。阳离子电荷与血清组分相互作用，导致多核苷酸转染试剂相互作用的不稳定和较低的生物利用率和靶向。体外有效的转染试剂膜活性在体内常导致毒性。为了体内递送，载剂(核酸和结合的递送剂)应较小，直径低于lOOnm，优选低于50nm。低于20nm或低于IOnm的更小复合物会更有用。大于IOOnm的递送载剂体内很少能穿过除了血管细胞之外的细胞。静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。此外，体内递送载剂上的阳离子电荷导致不良血清相互作用和因此造成弱生物利用率。有趣的是，高的负电荷还可通过干扰靶向所需的相互作用来抑制体内递送。因此，体内分布和靶向需要接近中性的载剂。不经过仔细的调控，膜的破坏或去稳定活性在体内使用时有毒。用核酸递送平衡载剂毒性体外比体内更容易实现。Rozema等在美国专利公开20040162260中证明了膜活化多胺可逆调控膜破坏活性的方式。所述膜活化多胺提供了破坏细胞膜的方法。PH依赖性可逆调控提供将活性限制在靶细胞内涵体中的方法，以此限制毒性。其方法依赖于含2-丙酸-3-甲基马来酸酐的多胺上的胺修饰。本发明涉及体内靶向递送RNA干扰(RNAi)多核苷酸到肝细胞的组合物。靶向的RNAi多核苷酸与共靶向的递送聚合物一起给予。递送聚合物提供膜渗透功能以将RNAi多核苷酸从细胞外移到细胞内。可逆修饰提供对所述递送聚合物的生理响应。

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