专利名称：关节性疾病治疗剂的制作方法 包括类风湿性关节炎、变形性关节炎、外伤性关节炎等的关节性疾病，是由于关节滑膜等的炎症导致软骨或骨破坏的炎性疾病。在炎症滑膜中确认有血管新生、淋巴细胞浸润、以及滑膜细胞的增殖和活化。据认为活化的滑膜细胞产生细胞因子、前列腺素、组织破坏酶等化学介质，导致软骨或骨的破坏(Harris，E.D.，New England Journalof Medicine，vol.322，p.1277-1289，(1990)；Cash，J.M.，等，New England Journal of Medicine，vol.330，p.1368-1375，(1994))。在治疗关节性疾病的时候，一般已知钠盐形式的透明质酸是有效的(文献山本真他“高分子透明质酸钠(NRD101)对变形性膝关节病的临床评价”，药理和治疗，21卷，No.3，894-970页)。另外，也已知锌对关节炎的治疗有用(A.Frigo等，“Copper and Zinc inInflammation”，Inflammation and drug therapy series，Vol.IV，Kluwer Academic Publishers，p.133-142(1989))。然而，因为透明质酸(一般为钠盐)，其生物相容性以及流动性都不太合适，虽然已知用于若干关节性疾病的治疗，但实际上对滑膜细胞的增殖或活化没有抑制效果。另外，使用锌也得不到满意的疗效。
因此，本发明的目的是提供抑制类风湿性关节炎等关节性疾病的发病机制的滑膜细胞的增殖和活化、特别是提供抑制组织破坏酶而有效治疗关节性疾病的药物组合物及其制造和用途。本发明人等为解决上述课题进行了种种探讨，结果发现虽然透明质酸(钠盐)对滑膜细胞增殖和活化几乎没有抑制效果，而锌对滑膜细胞的增殖和活化的抑制、特别是对组织破坏酶的抑制效果非常低，与此相对，令人惊讶的是，透明质酸与锌的复合体(缔合物)由于有两种构成成分的协同作用、即强化协同效应或相互作用，具有非常强烈的抑制滑膜细胞增殖的作用以及抑制组织破坏酶的作用，由此完成了本发明。因此，本发明提供了含有透明质酸和锌的复合体(缔合物)构成的关节性疾病治疗剂。本发明还涉及透明质酸和锌的复合体(缔合物)在用于制备关节性疾病治疗剂中的应用。
本发明还公开了关节性疾病的治疗方法，其特征在于向患有关节性疾病的患者投以透明质酸和锌的复合体(缔合物)。
本发明还公开了抑制组织破坏酶MMP-9生成亢进的患者组织破坏酶MMP-9生成亢进的方法，其特征在于给以透明质酸和锌的复合体(缔合物)。


图1是表示对于自类风湿性关节炎患者的滑膜细胞(RASC)，HA/Zn、Na-HA和Zn的增殖抑制效果的图。
图2是表示对于自变形性关节炎患者的滑膜细胞(OASC)，HA/Zn、Na-HA和Zn的增殖抑制效果的图。
图3是表示对于自外伤患者的滑膜细胞(TASC)，HA/Zn、Na-HA和Zn的增殖抑制效果的图。

本发明的活性成分是透明质酸和锌的复合体(缔合物)。透明质酸通常以钠盐形式存在，是由Meyer等在J.Biol.Chem.，vol.107，p.629(1934)记载的巨大分子。透明质酸是交替具有β1，3-葡萄糖醛酸成分和β1，4-葡萄糖胺成分的高粘性葡萄糖氨基多糖，其分子量为50kD～数百万D。透明质酸在所有哺乳动物的结缔组织中均可见，在皮肤、眼睛的玻璃体、滑液、脐带和软骨组织中存在水平很高。透明质酸是结缔组织的基础成分，有生物相容性，有生物吸附性，无免疫原性。为此，透明质酸具有关节软骨的润滑性和保护之类的多种生物学功能。
本发明的透明质酸与锌的复合体(缔合物)中透明质酸与锌的比例，在所述物质可以发挥抑制滑膜细胞增殖和组织破坏酶MMP-9的协同效应的范围内，以重量比计，透明质酸∶锌为5∶1～20∶1的范围，优选为约10∶1。本发明中使用的透明质酸和锌的复合体的分子量优选100kD～2000kD，优选约1000kD的分子量。本发明的透明质酸和锌的复合体(缔合物)例如可以通过把透明质酸钠的水溶液和锌盐如氯化锌的水溶液加以混合而制造(欧洲专利说明书No.EP0413016)。
多种炎性关节疾病被认为病因是由于滑膜细胞的增殖和活化所引起的。活化的滑膜细胞产生细胞因子、前列腺素、组织破坏酶等化学介质，引起软骨或骨的破坏，产生关节的炎症。组织破坏酶(基质金属蛋白酶)(MMP)包括分解I型胶原和II型胶原的MMP-1，除上述胶原外还分解软骨型蛋白多糖的MMP-3，将I型或II型胶原的明胶化物进一步分解为低分子型胶原、分解IV型胶原、V型胶原、XI型胶原和软骨型蛋白多糖的MMP-9(Sapata，I.等，Biochem.Biophys.Acta.vol.370，p.510-523，1974；Murphy，G.等，Biochem.J.vol.203，p.209-221，1982；Morel，F.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.191，p.269-274，1993；Hibbs，M.S.，Matrix Supple.Vol.1，p.51-57，1992；Murphy，G.等，Biochem.J.vol.277，p.277-279，1991；Hibbs，M.S.等，J.Biol.Chem.Vol.260，p.2493-2500，1995)，这些被认为与关节破坏有关。
来自类风湿性关节炎、变形性关节炎以及外伤患者的滑膜细胞在体外增殖，这些细胞的增殖被100～300微克/毫升浓度的本发明的透明质酸/锌复合体浓度依赖性地抑制。因此，本发明的透明质酸/锌复合体对类风湿性关节炎、变形性关节炎、外伤性关节疾病、关节积水、急性破坏型股关节炎等的治疗是有用的。据认为通过抑制滑膜细胞的增殖，有望对类风湿性关节炎进行对症治疗(日本未审专利公开No.7-145062)。
对来自类风湿性关节炎、变形性关节炎以及外伤患者的滑膜细胞体外培养中，来自类风湿性关节炎的滑膜细胞的组织破坏酶MMP-9可以被100微克/毫升以下的本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)抑制。因此，本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)可用作为类风湿性关节炎中来自滑膜细胞的组织破坏酶MMP-9的抑制剂。在此，上述组织破坏酶MMP-9抑制剂是例如胰岛素依赖型增殖糖尿病性视网膜症的治疗剂、或恶性肿瘤浸润或转移的抑制剂。
如实施例所示，透明质酸钠对滑膜细胞的增殖实质上不抑制，对组织破坏酶MMP-9实质上不抑制。另外，锌盐虽然抑制滑膜细胞增殖，而且抑制组织破坏酶MMP-9，不过本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)可以比锌盐更强烈地抑制滑膜细胞的增殖、而且抑制组织破坏酶MMP-9。这一结果意味着有增强协同作用。
作为本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)，可以采用常规医药品所采用的给药方法。即可以口服给药或非口服给药，特别优选注射给药。本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)的有效给药量，1人1次每关节0.01克～1毫克，优选0.03毫克～0.5毫克。本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)以物理最大给药量200毫克/千克对大鼠和小鼠皮下给药，未见全身性毒性症状。
本发明的关节性疾病治疗剂和组织破坏酶MMP-9抑制剂与常用的医药载体合在一起，含有本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)0.001％～1％，优选0.01％～0.5％。作为常用的医药载体，例如壳聚糖、淀粉、果胶、HPMC、藻酸钠等常用药物基质，西黄蓍胶粉末、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶等粘合剂，结晶纤维素、甘露醇等赋形剂，玉米淀粉、α化淀粉、藻酸等崩解剂，硬脂酸镁等润滑剂，蔗糖、乳糖或糖精等甜味剂，薄荷、薄荷油、樱桃之类的香味剂、防腐剂等。
实施例1滑膜细胞增殖抑制作用测试了本发明的透明质酸/锌复合体(缔合物)(HA/Zn)以及作为对照的透明质酸钠盐(Na-HA)和锌(Zn)对来自类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞(RASC)、变形性关节炎患者(0A)的滑膜细胞(OASC)和外伤患者(TA)的滑膜细胞(TASC)增殖的影响。
受试物质HA/Zn(批号A65242，1％溶液，グデオン·リヒク一公司)透明质酸钠(Na-HA，批号KK4001，キユ一ピ一)，氯化锌(Zn，批号ESH1413，和光纯药工业)。预先求出上述HA/Zn溶液(比重d2020＝1.0134)所含的透明质酸和锌的含量的定量值，以上述1％按100计，由透明质酸含量为99％(换算成透明质酸钠为105.0％)、锌含量为1.07毫克/毫升可得，该HA/Zn中的透明质酸钠和锌的重量比为10∶1。使受验物质的浓度HA/Zn为10微克/毫升、30微克/毫升、100微克/毫升、150微克/毫升、200微克/毫升、250微克/毫升和300微克/毫升，Na-HA与HA/Zn浓度相同，Zn为HA/Zn浓度的10分之1浓度，进行测试。
滑膜组织，在类风湿性关节炎(RA)患者(5例，65.6±10.6岁)和变形性关节炎(OA)患者(6例，73.4±8.9岁)的膝关节滑膜组织施行人工关节置换术时采取，外伤(TA)患者(6例25.6±6.7岁)是在关节镜施工时采取。采取后，直接放入加有DMEM(Dulbecco改良Eagle氏培养基)的试管(50毫升容量离心管，IWAKI)，4℃保存。之后，在清洁台内清洗滑膜组织，除去滑膜以外的组织，将滑膜切碎，然后通过酶处理(胶原酶，胰蛋白酶，和光纯药工业)分离滑膜细胞(SC)，用于测试。
SC的培养全部采用含10％热灭活(56℃，30分钟)的胎牛血清(FCS，大日本制药)和抗生素混液(青霉素100单位/毫升，链霉素100微克/毫升，两性霉素B 25纳克/毫升)的DMEM。
滑膜细胞(SC)接种在微量培养板(96孔，IWAKI)，3.5×103细胞/0.1毫升/孔(1×104细胞/厘米2)。其后，在5％CO2-95％空气的气相中37℃预培养2日。然后更换为含有各种浓度的上述药物的培养基，再在5％CO2-95％空气的气相中37℃培养12日。培养中的培养基更换方式是每4天更换含有药物的培养基。增殖能力的测定是在药物添加后第4、8和12日以MTT法(新生化学实验讲座12，分子免疫学1-免疫细胞细胞因子，358，1989)进行。结果用与细胞数成正相关的吸光度表示。
统计解析按Bartlett法进行5％显著意义的分散的一致性检定。分散一致的时候，进行一元配置的分散分析(lway ANOVA)，显示显著性差异的时候，以Dunnett法或Tukey法进行平均值的多重比较检定。分散不一致的时候，进行Kruskal-Wallis检定，顺序是以非参数(non-parametric)Dunnett法或Tukey法进行多重比较检定。
RASC、OASC和TASC所得的结果分别如图1、图2和图3所示。所述图中，相对与无药物添加组有p＜0.05显著性差异的时候用“*”表示，有p＜0.01显著性差异的时候用“**”表示。
由所示图可见，Na-HA添加后各滑膜细胞的增殖均无显著抑制，添加HA/Zn后发生添加量依赖性的滑膜细胞的显著抑制。另外添加Zn后发生添加量依赖性的滑膜细胞增殖抑制。不过，与Zn相比，HA/Zn对滑膜相比的抑制更大。考虑到Na-HA未发生显著抑制，确认与Na-HA和Zn单独使用时，HA/Zn有协同作用。
实施例2对滑膜细胞培养上清中的组织破坏酶MMP-9的抑制效果滑膜细胞接种于培养皿(?35毫米，IWAKI)中，10×104细胞/2毫升/皿(1×104细胞/厘米2)，在5％CO2-95％空气的气相中37℃预培养2日。然后更换为含有药物的培养基，再在相同条件下培养8天，采取培养上清，-80℃保存至测定。HA/Zn和Na-HA的添加浓度为100微克/毫升(终浓度)，Zn的浓度是10微克/毫升(终浓度)。
上清中的组织破坏酶基质蛋白酶MMP-9以EIA(酶免疫分析)法测定。为将结果按培养上清中的浓度计算所得值以细胞进行讨论，换算为该时刻以MTT法所得的培养细胞的吸光度值。该值再以将对照(未添药物组)为100％时药物添加组各相对值表示。
其结果，以对照(药物未添加)为100％时，MMP-9的生成HA/Zn添加时为0％，Na-HA添加时为100％，Zn添加时为50％。由此结果可见，确认相对于组成成分Na-HA和Zn单独使用，HA/Zn有协同作用。
如上，本发明的透明质酸和锌的复合体(缔合物)，与其组成成分透明质酸和Zn相比，具有协同性的对滑膜细胞的增殖和滑膜细胞生成的组织破坏酶MMP-9的抑制作用，可用作为类风湿性关节炎的治疗剂。
实施例3处方透明质酸锌0.2克甘露醇5.0克注射用水 适量总量 100毫升调制法在注射用水80毫升中加入甘露醇或葡萄糖5克，溶解后，再以少量逐步加入透明质酸锌，搅拌溶解。过滤溶液，填充入安瓿。安瓿以喷淋灭菌器(约105℃)灭菌30分钟，即为注射剂。
同样对于实施例4的处方也按本方法操作调制。
实施例4处方处方透明质酸锌0.2克葡萄糖5.0克注射用水 适量总量 100毫升


提供了以透明质酸和锌的复合体(缔合物)作为活性成分的关节性疾病如类风湿性关节炎的治疗剂。该复合体与其组成成分透明质酸和锌单独相比,可以协同性抑制滑膜细胞的增殖,抑制滑膜细胞产生的组织破坏酶MMP－9。