专利名称：大鼠初级听皮层微电极阵列植入固定手术方法多通道在体记录技术能够在动物清醒、自由活动状态下，记录大脑局部区域群体神经元活动，是分析群体神经元在网络水平编码机制的有力工具，并且广泛应用于多种动物实验的多个脑区。而听觉皮层的多通道在体记录研究大多在狨猴等大型实验动物上开展，对于常用实验动物——大鼠等小型啮齿类动物，目前只开展了在麻醉状态下和被动听状态下(unanesthetized passively listening)群体神经元活动的研究,其中“被动听状态”指的是动物处于清醒状态，但被训练坐在固定装置中被动接收听刺激，而不是自由活动的behaving状态。而在研究高级中枢对听感觉信息的认知编码时，常需要考察中枢相关脑·区对声刺激反应的动态变化，在这个意义上，动物behaving状态下感觉相关皮层群体神经元活动的研究对详细了解中枢感觉认知机制非常重要，而目前尚未见behaving状态下大鼠听皮层群体神经元活动的报道。原因在于大鼠等小型实验动物初级听皮层位于大脑颞侦L如果将植入微电极阵列直接固定在听皮层外的颞侧颅骨上，固定后的电极装置将会造成动物头部正常平衡状态的变化，这将影响动物的自由活动。因此，behaving状态下大鼠听皮层植入、稳固携带微电极阵列是开展多通道在体记录研究的技术难题。在体记录群体神经元活动的微电极阵列一般分为电极丝部分和电极连接器(connector，用来实现与记录仪器系统的对接)两部分。目前，新型微电极阵列上出现了电极丝着陆装置(landing),它与电极丝紧密封接,在动物头部固定电极时可先在landing周围封装牙科水泥，待第一次封装的牙科水泥完全凝固后，再在电极connector封装牙科水泥进行固定，这种方法可缓冲并减少connector插拔记录仪器系统前放(headstage)时对电极丝的震动，稳固电极丝。针对behaving状态下大鼠听皮层植入、稳固携带微电极阵列的技术难题，本发明对大鼠听皮层适用的微电极阵列进行了设计改造，再采用把微电极阵列的电极丝与电极connector双重异位固定的方法进行听皮层微电极阵列的植入固定，即将电极丝经电极landing固定在听皮层颞骨处,弯折电极丝阵列后把电极connector固定在顶骨上。该植入方法涉及小型实验动物听皮层适用的微电极阵列的设计、听皮层微电极阵列的固定方法等技术环节。
本发明的目的是针对常用实验动物——大鼠等小型啮齿类动物，在自由活动状态下记录其听皮层群体神经元活动存在的微电极阵列植入固定技术难题，提出一种大鼠初级听皮层微电极阵列植入固定的手术方法。本发明提出的大鼠初级听皮层微电极阵列植入固定的手术方法，是通过把微电极阵列的电极丝部分与电极连接器部分双重异位固定，即将电极丝经电极着陆装置固定在听皮层颞骨处，然后弯折电极丝把电极连接器固定在顶骨上，完成听皮层微电极阵列的植入固定。该植入方法涉及小型实验动物听皮层适用的微电极阵列的设计、听皮层微电极阵列的植入固定方法等技术环节。本发明方法具体是 通过把电极丝阵列与电极connector进行双重异位固定，即第一次固定将电极丝阵列经电极landing固定在听皮层颞骨处,第二次固定将电极丝阵列弯折后把电极connector固定在顶骨上。具体步骤如下 I)大鼠脑外科手术选取适当的大鼠，麻醉后使用立体定位仪固定，通过脑外科手术在大鼠头顶部前后纵向切开头顶部头皮，切口 lcm，在切口后角垂直向左颞侧剪开头皮lcm，沿顶骨隆起和颞骨后缘钝性分离颞肌，结扎颞侧头皮、颞肌，暴露顶骨和左侧颞骨；使用1%双氧水清除顶部颅骨和颞骨外结缔组织，为后续使用牙科水泥固定电极准备骨表面。2)旋入固定螺丝共旋入六颗固定螺丝，其中在颞骨待开脑区的前后两侧各钻入·一颗固定螺丝，顶骨钻入四颗固定螺丝，结合后续牙科水泥包埋电极阵列增加植入的稳固度。3)在初级听皮层植入微电极阵列根据大鼠脑图谱，使用微型牙科钻开颅暴露听皮层，除去硬脑膜，在微推进器推动下把微电极阵列插入听皮层。4)微电极阵列植入后的第一次固定微电极阵列植入后先滴加琼脂溶液覆盖听皮层表面，再分别使用医用胶(主要成分是α-氰基丙烯酸正丁酯)和较稀的牙科水泥(见图2, dental acrylic layer I )把电极landing和周围颞骨紧密固定在一起,完成微电极阵列植入后的第一次固定。5)微电极阵列植入后的第二次固定待第一次固定的牙科水泥完全凝固后，滴加生理盐水溶去电极丝阵列外包的水溶性蜡,弯折电极阵列，使电极connector置于动物颅顶，然后使用较粘稠的牙科水泥，把听皮层电极connector固定在动物颉顶,完成微电极阵列植入后的第二次固定。6)术中术后护理术中注意保持动物体温和麻醉稳定，术后对伤口进行消毒并缝合，给予肌注青霉素注射液。其中的小型实验动物听皮层适用的微电极阵列的设计如下 I)不设电极驱动装置，通过微推进器可测量到电极植入深度，并可减轻电极装置的重量，便于动物头部的活动。2)在电极阵列前端增加电极丝着陆装置landing, landing距离电极connector约10 mm左右。3)选择刚性较小的、柔软的镍铬丝作为电极材料，外包以可溶性蜡增加电极阵列硬度。根据上述实验步骤，对成年大鼠初级听皮层进行微电极阵列植入并固定，实际试验结果证明，电极丝-电极connector双重异位固定的方法能够使微电极阵列长期稳固地在大鼠听皮层记录信号，满足在动物自由活动状态下采集其听皮层群体神经元信号的要求，从而说明本发明设计的听皮层微电极阵列和使用的手术方法是可行的。本发明设计实现了在自由活动的大鼠上进行听皮层群体神经元的信号采集，拓展了多通道在体记录技术在听觉认知研究中的应用，具有方便易行、采集信号可靠及降低相关研究实验动物成本的优点。
图I是小型实验动物听皮层适用微电极阵列设计示意 图2是微电极阵列植入固定方法示意图。

I)不设电极驱动装置这种设计可减轻电极装置的重量，便于动物头部的活动；此外，·通过电极微推进器植入电极，可测量到植入深度，同时在植入过程中检测听皮层神经元的反应以提示电极是否接触到听反应神经元。2)在电极阵列前端增加电极丝着陆装置landing :以往常见的微电极阵列上的landing着陆装置位于电极丝中部,仅起到缓冲并减少电极connector插拔headstage时对电极丝的震动，稳固电极丝的作用。本发明中使用的听皮层微电极阵列landing装置，位于电极尖端约3 mm处，landing距离电极connector约10 mm左右,满足电极丝阵列从听皮层弯折至顶骨的长度要求。根据大鼠听皮层的特殊在体位置，这种landing的位置设计除了起到稳固电极丝的目的，也是本发明手术方法中通过进行电极丝-connector异位双重固定实现微电极阵列在听皮层植入固定的必备结构。3)选择刚性较小的、柔软的镍铬丝作为电极材料，易于后续手术操作从听皮层处弯折电极丝阵列至顶骨；外包以可溶性蜡增加电极阵列硬度，以方便电极阵列穿过软脑膜。图I中该微电极阵列分为电极接口 I (microelectrode array connector)和电极丝阵列2 (microelectrode array)两部分,其中在距电极丝尖端3 mm (L2)处设置电极着陆装置3 (microelectrode array landing),电极丝landing距离电极接口下边10 mm(LI),电极丝阵列总长度(L1+L2) 13 mm。大鼠听皮层微电极阵列的植入固定
选择成年SD大鼠，雌雄不限，购自浙江省医学科学院动物中心。动物购回后，随机分笼饲养。饲养期间保持安静舒适的环境，让其自由饮水和进食。手术前进行听觉检测，听反应正常者进行听皮层微电极阵列植入手术。使用大鼠听皮层适用的微电极阵列，按下述依次的步骤进行麻醉、脑外科手术暴露初级听皮层、植入微电极阵列后进行电极丝-电极connector双重异位固定,其具体步骤过程为
I)大鼠脑外科手术大鼠称重后，经腹腔注射戍巴比妥钠(sodium pentobarbital, 40mg/kg体重)麻醉,之后给予皮下注射阿托品(atropine sulfate, 0. 07mg/kg体重)防止气管、支气管产生分泌物。使用45°耳杆立体定位仪固定大鼠，剪去大鼠头顶部被毛和左颞侧被毛，前后纵向切开头顶部头皮，切口 lcm,暴露顶部卢页骨；在顶部切口后角垂直向左颞侧剪开头皮lcm，沿顶骨隆起和颞骨后缘钝性分离颞肌，结扎颞侧头皮、颞肌，牵拉结扎线扩张颞侧手术野，暴露听皮层外侧颞骨；使用1%双氧水清除顶部颅骨和颞骨外结缔组织，为后续使用牙科水泥固定电极准备骨表面。
2)旋入固定螺丝首先根据大鼠脑图谱，立体定位初级听皮层，并用铅笔标记出听皮层的位置。使用微型牙科钻和直径O. 5 mm圆柱形钻头分别在待开脑区的前后两侧分别钻一个小孔，用于旋入固定螺丝；再在暴露的顶骨四周均匀分布钻五个小孔，其中周围四个小孔用于上固定螺丝，共计旋入六颗固定螺丝，结合后续牙科水泥包埋固定螺丝，可以增加电极植入的稳固度。此外，顶骨上靠近听皮层待开脑区的一个小孔用于插入参考电极。3)在初级听皮层植入微电极阵列根据立体定位标记点，在听皮层外侧颞骨用微型牙科钻轻轻钻开一个小孔(直径约2. 5 mm),除去硬脑膜，用生理盐水清理干净脑表面后，在微推进器推动下把准备好的8道电极阵列的8根电极小心插入听皮层并在体记录神经元反应，根据微推进器的植入深度和听皮层神经元的放电特点判断电极尖端是否到达听皮层，至听皮层第IV层时停止推进。4)微电极阵列植入后的第一次固定用20 μ I移液枪取琼脂溶液(浓度2%)覆盖在听皮层表面，待琼脂凝固后形成一层凝胶膜，以保护皮层的生理状态，然后用医用胶(主要成分是α-氰基丙烯酸正丁酯)涂在电极landing和颞骨上，待医用胶干燥后再调制浓度较稀的牙科水泥(dental acrylic layer I ),用20 μ I移液枪取牙科水泥液滴在电极丝·landing及周围颉骨,把电极丝landing与周围颉骨紧密固定在一起,完成微电极阵列植入后的第一次固定。5)微电极阵列植入后的第二次固定待第一次固定的牙科水泥完全凝固后，滴加生理盐水溶去可溶性蜡。弯折电极阵列，使电极connector置于动物颅顶，然后调制较粘稠的牙科水泥(dental acrylic layer II ),把听皮层电极connector固定在动物颉顶,完成微电极阵列植入后的第二次固定。6)术中术后护理最后对伤口进行消毒并缝合，给予肌注青霉素注射液。术中注意保持动物体温和麻醉稳定。7)记录电极负载时间，并在不同时间点(植入手术时在线采集、术后3天、术后I周、术后两2周、术后I月、术后2月)使用Plexon多通道神经信号分析处理系统(Multichannel Acquisition Processor System, MAP System)进行在体信号米集。检查本发明手术方法的稳定性和信号采集的可靠性。8)术后两月处死动物并进行福尔马林灌流，脑冰冻切片显示微电极阵列的在体位
置是否正常。图2中，微电极阵列11在大鼠初级听皮层植入后经电极着陆装置9在听皮层颞骨处使用牙科水泥7进行第一次固定后，弯折电极丝阵列至顶骨，使用牙科水泥6经电极接口5进行第二次固定。其中，10为封闭听皮层表面的琼脂凝胶膜，12为大鼠颅骨。电极植入固定后通过信号线4可接入多通道神经信号分析处理系统8 (Multichannel AcquisitionProcessor System, MAP System)进行在体信号米集。


本发明属于神经电生理学研究领域，具体涉及一种用于听觉认知研究的大鼠初级听皮层微电极阵列植入固定的手术方法。本发明通过把微电极阵列的电极丝部分与电极连接器部分双重异位固定，即将电极丝经电极着陆装置固定在听皮层颞骨处，然后弯折电极丝把电极连接器固定在顶骨上，完成听皮层微电极阵列的植入固定。本发明操作简单、电极携带稳固、信号采集可靠性高，满足了在大鼠自由活动状态下进行听觉认知研究的需要，降低了相关研究的实验动物成本。