专利名称：一种人工假病毒的制备方法
本发明提供一种人工假病毒的制备方法，该方法包括以下步骤步骤1，核酸提取步骤2，PCR扩增步骤3，凝胶回收PCR片段步骤4，限制性酶消化片段、载体步骤5，凝胶回收酶切产物步骤6，连接反应步骤7，转化连接产物步骤8，质粒提取步骤9，酶切筛选连接阳性步骤10，诱导提取人工假病毒其中步骤1核酸提取，步骤如下1)样本裂解及核酸吸附在1. 5ml无核酸酶的离心管中加入10 μ 1助沉剂和400 μ 1裂解液，加入200 μ 1待病毒培养物，剧烈震荡2分钟，室温静置10分钟；加入480 μ 1无水乙醇，颠倒混勻，吸取600 μ 1裂解混合物转移到核酸吸附柱中；3500g离心2分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。将剩余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中的液体；将核酸吸附柱重新装入套管，6000g离心1分钟，倒掉套管中的液体；其中，所述病毒培养物为肠道病毒各亚型病毒培养物；其来源如下病毒培养物由国家CDC病毒病所提供，采用常用的鸡胚培养法。如病毒培养物体积小于或大于200 μ 1，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。体积大于400 μ 1样本应分多次进行处理；有关试剂的准备如下分别在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml无水乙醇，颠倒充分混勻，并在瓶身上加以标识；吸取所需的洗脱液，加至一无核酸酶的印pendorf管中，于70°C预热；冷冻样本应室温融化，轻微震荡混勻后使用；助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混勻即可使用。2)核酸纯化将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入500 μ 1洗液A，6000g离心1分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套管中；在核酸吸附柱中加入500 μ 1洗液B，静置1分钟，6000g离心1分钟；倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管；在核酸吸附柱中加入500 μ 1洗液B，6000g离心1分钟。；将核酸吸附柱换一新套管，13000rpm离心3分钟。3)核酸洗脱将核酸吸附柱装入一无核酸酶1. 5ml离心管，小心在吸附膜中央加入50 μ 1预热洗脱液，室温静置4分钟；IOOOOrpm离心2分钟，离心管中液体即样本RNA。该样本RNA作为下一步扩增的模板。其中步骤2. PCR扩增，步骤如下1)反应体系在0. 2mlPCR管中依次加入2*PCR buffer 12. 5ul，DNA聚合酶lul，逆转录酶 0. 35ul，上游引物0. 2uM，下游引物0. 2uM，模板RNA 5ul，补水至总体积25ul，充分震荡混勻。放入PCR仪中，进行PCR扩增；2)扩增程序500C 30min; 95°C 3min; 95°C IOsec； 58°C 30sec;72°C 30sec。30个循环其中步骤3.凝胶回收PCR片段，步骤如下配置2%琼脂糖凝胶，室温凝固至少30min ；将PCR管中样品加loading buffer后上样，电泳；切胶回收；切胶，尽可能去除多余胶块，称重。按1 3体积加入溶胶液PN，50°C水浴放置 lOmin，其间多次翻转离心管，以确保凝胶彻底溶解；柱平衡吸附柱中加入500uL平衡液BL，12000rpm, lmin,弃废液；将融好的胶液加入吸附柱中，室温静置2分钟，12000rpm,30-60s,弃废液向吸附柱中加入600uL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm, 30_60s，弃废液；向吸附柱中加入600uL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm，30-60s，弃废液；吸附柱再离心2min，12000rpm,彻底去除漂洗液，室温开盖放置几分钟，以利于乙醇挥发；吸附柱重新置入一干净dorf管中，向吸附柱膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温静置2分钟，12000rmp离心2分钟收集DNA溶液，产物保存于_20°C。其中步骤4.限制性酶消化片段、载体，步骤如下酶切位点采用^(bal/Kpnl双酶切；酶切反应体系回收产物30ul，Xbal/Kpnl 各!3ul，BufferM IOul，BSA IOul，补水至总体积IOOul ；酶切反应时间37°C，至少30分钟。其中步骤5.凝胶回收酶切产物，步骤如下配置2%琼脂糖凝胶，室温凝固至少30min ；将PCR管中样品加loading buffer后上样，电泳；切胶回收；切胶，尽可能去除多余胶块，称重。按1 3体积加入溶胶液PN，50°C水浴放置 lOmin，其间多次翻转离心管，以确保凝胶彻底溶解；柱平衡吸附柱中加入500uL平衡液BL，12000rpm, lmin,弃废液；将融好的胶液加入吸附柱中，室温静置2分钟，12000rpm, 30_60s，弃废液；向吸附柱中加入600uL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm，30-60s，弃废液；向吸附柱中加入600uL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm，30-60s，弃废液；吸附柱再离心2min，12000rpm，彻底去除漂洗液，室温开盖放置几分钟，以利于乙醇挥发；3吸附柱重新置入一干净dorf管中，向吸附柱膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温静置2分钟，12000rmp离心2分钟收集DNA溶液，产物保存于_20°C。其中步骤6.连接反应，步骤如下连接体系使用T4DNAligaSe体系进行连接反应，载体与片段的浓度比1 50; T4DNAligaselul，bufferlul，补水至总体积 IOul ；连接时间16°C，过夜或室温1小时。其中步骤7.转化连接产物，步骤如下使用CaC12法转化感受态大肠杆菌Dhfe细胞；连接产物加入感受态细胞(IOOuL)中，轻轻混勻，冰上放置30分钟；42 °C，孵育 90 秒4 0C (冰上)放置5分钟；加入ImlLB培养基，37°C，200rpm预培养1小时；
6000rpm离心1分钟，弃掉多余培养基，重悬沉淀，涂布Amp抗性平板，倒置，37°C过夜培养。其中步骤8.质粒提取，步骤如下挑取平板上长出的阳性克隆菌，接种Amp抗性液体LB培养基；质粒DNA提取；柱平衡吸附柱中加入500uL平衡液BL，12000rpm, lmin,弃废液；收集菌体，1. 5ml dorf管，12000rpm Imin，尽量吸除上清；向菌体沉淀中加入250ul溶液Pl (用前需加入RNaseA)；离心管中加入250ul溶液P2，混合翻转6_8次使菌体充分裂解；离心管中加入350ul溶液P3，立即温和地上下翻转6_8次，出现白色絮状沉淀。 12000rpm, lOmin，底部形成沉淀；将上一步收集的上清液转移至平衡过的吸附柱中，12000rpm，30-60SeC，弃废液；向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm，30_60sec，弃废液；向吸附柱中加入600ul漂洗液PW(使用前加入乙醇)，12000rpm,30-60sec,弃废液。向吸附柱中加入600ul漂洗液PW(使用前加入乙醇)，12000rpm,30-60sec,弃废液。将吸附柱12000rpm离心2分钟，去除残余的漂洗液；吸附柱CP3置于一个干净的dorf管中，向吸附柱中膜中间部位滴加50_100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpml分钟，收集质粒溶液，_20°C保存。其中步骤9.酶切筛选连接阳性，步骤如下采用连接时所用的两种限制性内切酶进行酶切验证，37°C，至少30分钟；酶切体系质粒DNA5ul，Xbal/Kpnl 各 0. 3ul, bufferMlul, BSAlul，补水至 IOul ；酶切时间37 °C，至少30分钟；配置2%琼脂糖凝胶，电泳，紫外凝胶扫描仪分析是否有特异性条带；质粒经验证连接成功，进行测序，确定连入片段的准确性。其中
步骤10.诱导提取人工假病毒，步骤如下挑取阳性克隆，接种^iilAmp抗性LB培养基。37°C，200rpm过夜培养；400ul过夜培养菌液接种3600ulAmp抗性LB培养基(1 10稀释菌液)，37°C， 200rpm, 1. 5-3小时，至OD值达到0. 5-0. 8之间;ImMIPTG 诱导蛋白表达。37°C，200rpm，3 小时；收集菌液于1. 5ml dorf管中，离心6000rpm，lmin，弃上清；Iml STE洗液重悬菌体沉淀，6000rpm，lmin，弃上清；ImlSTE洗液重悬菌体沉淀，6000rpm，lmin，弃上清；加入400ul超声缓冲液，重悬沉淀；超声波破碎细胞，30%功率，超声5秒，间歇9秒，总共超声时间5分钟。至菌液透明；4°C,12000rpm, 10分钟，收集上清液，得到本发明的人工假病毒。本发明制备方法中所用到的所有材料都可以在市场上购买到，或者通过常规方法制备得到，属于现有产品。本发明得到的假病毒结构验证人工假病毒由于RNA被噬菌体衣壳蛋白包被，因此耐受DNA酶和RNA酶的消化。取上步中获得的人工假病毒液20ul，进行酶切验证。样本1为不加酶的阴性对照，样本2. 3. 4为分别加酶的不同组合


本发明涉及一种核酸制备技术，特别涉及一种人工假病毒的制备方法，本发明的人工假病毒的制备方法，包括以下步骤步骤1，核酸提取，步骤2，PCR扩增，步骤3，凝胶回收PCR片段，步骤4，限制性酶消化片段、载体，步骤5，凝胶回收酶切产物，步骤6，连接反应，步骤7，转化连接产物，步骤8，质粒提取，步骤9，酶切筛选连接阳性，步骤10，诱导提取人工假病毒。