专利名称：一种生物合成乙基香兰素的方法こ基香兰素的化学名称为3-こ氧基-4-羟基苯甲醛，呈甜巧克カ香气，具有強烈的香兰素特有的芳香气，香气比香兰素强3 4倍，且香气更为爽快、幽雅，在调香中具有用量少、香气足、不变色等优点，是重要的光谱型高档香料，广泛应用于食品、烟草、日用品中，也是重要的医药中间体。 目前，こ基香兰素均为化学合成，主要以こ醛酸和邻こ氧基苯酚为起始原料，经缩合、氧化和脱羧反应制得，但其中氧化反应结束时存在催化剂分离困难等问题。随着消费者对化学合成产物的警惕性也日益増加，人们对天然产物兴趣的逐渐增強。生物合成具有清洁性，安全性和天然性等优点。こ基香兰素的天然来源尚无报道。
针对上述情况，本发明的目的是提供ー种生物合成こ基香兰素的方法。本发明提供ー种生物合成こ基香兰素的方法，包括如下步骤将底物3-乙氧基-4-羟基苯こ醇酸经脱氢酶催化合成3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸，再将3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸经脱羧酶催化合成3-こ氧基-4-羟基苯甲醛，即こ基香兰素。ー种生物合成こ基香兰素的方法，以3-こ氧基-4-羟基苯こ醇酸为底物，具体包括如下步骤(I)将含有扁桃酸脱氢酶基因的工程菌pET30a_mdlB的大肠杆菌BL21 (DE3)接种于琼脂斜面培养基，活化，将活化后的菌种转接于含卡那霉素的LB种子培养基培养12h ；(2)以5%的接种量将种子培养液接种于含卡那霉素的LB发酵培养基，发酵，加入IPTG,使其终浓度为O. 2mM, 30°C诱导6h ；(3)离心收集发酵培养液中的菌体，除去上清液，用无菌水洗涤，悬浮于含O. 5%的3-こ氧基-4-羟基苯こ醇酸的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 I. 12%, NaH2PO4 2. 14%, MgSO40.01 %，pH = 7)，发酵，即得含3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸的溶液；将含有3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸的发酵液离心，取上清液，调PH= 7，灭菌，待用；(4)将含有苯こ酮酸脱羧酶的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)ATCC12633菌株，经琼脂斜面培养基活化，转接于pH = 7的含KH2PO4 2. O %、牛肉膏O. 3 %、蛋白胨1.0%,NaCl O. 5%的种子培养基中，在30°C培养8h ；(5)将得到的种子培养液以50%的接种量接种于步骤(3)得到的含有3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸的发酵上清液，发酵，得含こ基香兰素的发酵液。所述的步骤(I)中活化条件为在37°C培养24h。所述的步骤(2)中发酵条件为在37°C培养2h。所述的步骤(3)中离心条件为以5000rpm离心25min ;所述的步骤(3)中发酵条件为30°C，200rpm，发酵40h。所述的步骤(3)中磷酸盐缓冲液含Na2HPO4 I. 12 %, NaH2PO4 2. 14 %,MgSO4O. 01%, pH = 6. 5。所述的步骤(5)中发酵条件为在30°C，200rpm，发酵24h。所述的步骤⑷中含有苯こ酮酸脱羧酶的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonasputida)替换为含有苯こ酮酸脱羧酶基因的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 上述方法制得的こ基香兰素的用途，所述的こ基香兰素用于食品中呈甜巧克カ香气。本发明的有益效果本发明采用含有mdlB基因片段，即可以编码扁桃酸脱氢酶的重组大肠杆菌和含有mdlC基因片段保藏编号为ATCC12633的恶臭假单胞杆菌或铜绿假单胞杆菌，以3-こ氧基-4-羟基苯こ醇酸为底物，利用重组菌体内含有高活性的扁桃酸脱氢酶，将3-こ氧基-4-羟基苯こ醇酸催化脱氢，产生3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸，将恶臭假单胞菌接种于含有3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸的发酵液，利用其体内的苯こ酮酸脱羧酶将3-こ氧基-4-羟基苯こ醇酮酸转化为こ基香兰素。本方法的优点在于反应条件温和，环境污染小，操作简便，并且为こ基香兰素的合成提供了一条全新的道路并提出了生物合成こ基香兰素的概念。
实 施例2本实施例与实施例I的不同仅在于脱羧酶催化过程使用的含有苯こ酮酸脱羧酶菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。具体步骤如下脱氢酶催化过程(I)种子培养将含pET30a_mdlB的大肠杆菌BL21 (DE3)接种于琼脂斜面培养基，在37°C培养24h活化，将活化后的菌种转接于含卡那霉素的LB种子培养基，培养12h后；(2)发酵培养以5%的接种量将种子培养夜接种于含卡那霉素LB的发酵培养基，在37°C发酵培养2h，加入IPTG，使其终浓度为O. 2mM，30°C诱导6h ；(3)发酵反应以5000rpm离心25min收集发酵培养液中的菌体,除去上清液,用无菌水洗涤两次，悬浮于含O. 5%的3-こ氧基-4-羟基苯こ醇酸的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4
I.12%, NaH2PO4 2. 14%, MgSO4 O. 01%, pH = 7)，30°C，200rpm，发酵 40h，即得含 3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸的溶液。将含有3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸的发酵液离心，取上清液，调pH = 7，灭菌，待用。脱羧酶催化过程(I)将含有苯こ酮酸脱羧酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),经琼脂斜面培养基活化后，转接于pH = 7的含KH2P042. 0%、牛肉膏0. 3%、蛋白胨1.0%、NaCl
0.5%的种子培养基中，在30°C培养8h ；(2)将得到的种子培养液以50%的接种量接种于含有3-こ氧基-4-羟基苯こ酮酸的发酵上清液，300C，200rpm,发酵24h，得含こ基香兰素的发酵液。


本发明涉及一种生物合成乙基香兰素的方法。将含扁桃酸脱氢酶基因的菌株，pET30a-mdlB质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接入发酵培养基，加入诱导剂，添加3-乙氧基-4-羟基苯乙醇酸，发酵得含3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的发酵液；将含苯乙酮酸脱羧酶基因的菌株，保藏编号为ATCC12633的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)或者铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)接种于上述发酵上清液，发酵得含有乙基香兰素的发酵液。本发明首次提出了用微生物发酵的方法合成乙基香兰素的途径，具有反应条件温和，环境污染小，操作简便等优点，提供了一种新的合成乙基香兰素的方法。