包含功能性以及非功能性剪接供体位点和剪接受体位点的反转录病毒载体制作方法

功能性 供体 剪接 包含 以及

本发明涉及一种载体具体地说，本发明涉及一种用于包装并表达反转录病毒颗粒中的遗传物质的新型系统更具体地讲，本发明涉及能够表达反转录病毒颗粒的新型系统，它能够将目的核苷酸序列(下文缩写为“NOI”)-甚至多个NOI-传递至一个或多个靶位点另外，本发明特别涉及可用于基因治疗的新型反转录病毒载体基因治疗可以包括以下的任何一种或多种形式例如在一个或多个靶位点诸如靶细胞中对一种或多种核苷酸序列进行添加、取代、缺失、补充、操作等如果所述靶位点为靶细胞，则所述细胞可以为组织或器官的组成部分关于基因治疗的的一般认识可参见MolecularBiology(编辑Robert Meyers，Pub VCH，例如第556-558页)作为再一实例，基因治疗也可以提供用于以下任何一种或多种目的的方法可以应用诸如基因的核苷酸序列取代或补充缺陷基因；可以消除诸如基因的致病核苷酸序列或其表达产物；可以添加或导入核苷酸序列例如基因或其表达产物，以便例如产生更合适的表型；可以添加或导入核苷酸序列例如基因或其表达产物，例如用于选择目的(即相对于非转化细胞选择转化细胞等)；可以在分子水平上操作细胞，以治疗、治愈或预防疾病病症-诸如癌症(Schmidt-Wolf和Schmidt-Wolf，1994，Annals ofHematology 69，273-279)或其它疾病病症，诸如免疫疾病、心血管疾病、神经病、炎症性疾病或传染病；可以操作和/或导入抗原以激发免疫应答，诸如基因疫苗接种近年来，已经提出将反转录病毒用于基因治疗本质上反转录病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒在该方面，反转录病毒是通过DNA中间体复制的感染体当反转录病毒感染细胞时，其基因组由反转录酶转变为DNA形式以所述DNA拷贝作模板产生新的RNA基因组和装配感染性病毒颗粒所必需的病毒编码蛋白有许多反转录病毒，实例包括鼠白血病病毒(MIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉纳米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FRB MSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔逊鼠类白血病病毒(A-MLV)、鸟类髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟类成红细胞增生病毒(AEV)在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress编辑JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758-763页)的著作中，可以找到详细的反转录病毒一览表在本领域中可以找到关于某些反转录病毒基因组结构的详细介绍例如可以从NCBI Genbank中找到关于HIV的详细介绍(即基因组登记号AF033819)所有野生型反转录病毒基本上均含有三种主要的编码域-gag、pol、env，它们编码必需的病毒体蛋白然而，反转录病毒可以大致分为两类即“简单型”和“复杂型”这两类的区别在于其基因组结构简单型反转录病毒通常仅携带基本信息相比之下，复杂型反转录病毒还编码多重剪接信息产生的其它调节蛋白反转录病毒甚至可以进一步分为7组其中5组为具有致癌潜力的反转录病毒其余2组是慢病毒和泡沫病毒关于这些反转录病毒的综述参见“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press编辑JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第1-25页)除人T细胞白血病病毒-牛白血病病毒群(HTLV-BLV)外的所有致癌成员均为简单型反转录病毒HTLV、BLV和慢病毒以及泡沫病毒是复杂型反转录病毒研究得最清楚的一些致癌反转录病毒是劳斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)和鼠类白血病病毒(MLV)和人T细胞白血病病毒(HTLV)慢病毒群甚至可再分为“灵长类”和“非灵长类”慢病毒灵长类慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(即人自身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)非灵长类慢病毒群包括原型“慢病毒”维斯那/梅迪病毒(VMV)以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和新近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒慢病毒科支转录病毒和其它类型反转录病毒之间的不同之处在于慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力(Lewis等1992EMBO.J113053-3058；Lewis和Emerman 1994 J.Virol.68510-516)相反，诸如MLV的其它反转录病毒不能感染非分裂细胞，诸如构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织的细胞在感染过程中，反转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体在进入易感宿主细胞时，反转录病毒RNA基因组则由亲代病毒内携带的病毒编码的反转录酶拷贝为DNA该DNA被转运到宿主细胞核，随后在核内整合入宿主基因组在此阶段，它通常被称为原病毒在细胞分裂期间，原病毒稳定地存在于宿主染色体上，并同其它细胞蛋白一样被转录原病毒编码制备更多病毒所需的蛋白和包装器，病毒可以通过有时称为“芽生”的过程离开细胞已经表明，每个反转录病毒基因组均包含称为gag、pol和env的基因，它们编码病毒体蛋白和酶在原病毒中，这些基因两端的侧翼为称为长末端重复序列(LTR)的区域LTR负责原病毒的整合和转录它们也起着增强子-启动子序列的作用换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达反转录病毒RNA的包衣壳借助于位于病毒基因组5’端的psi序列LTR本身是相同的序列，它们可以分为三种元件，这些元件称为U3、R和U5U3产生自所述RNA 3’端特有的序列R产生自所述RNA两端重复的序列，而U5产生自所述RNA 5’端特有的序列在不同反转录病毒中，这三种元件的大小可能显著不同为了易于理解，图29图示RNA形式和DNA形式的所述反转录病毒基因组的一般简单结构(未按比例制图)，其中显示了LTR的基本特征和gag、pol和env的相对位置如图29所示，传染性反转录病毒RNA基因组的基本分子结构是(5’)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3’)在缺陷型反转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可能缺乏或没有功能该RNA两端的R区是重复序列U5和U3分别代表RNA基因组5’和3’端特有的序列病毒体RNA反转录为双链DNA发生于细胞质中，涉及反转录酶从模板分子的5’末端至3’末端的两次跳跃两次跳跃的结果是复制位于病毒体RNA 5’和3’端的序列然后这些序列在病毒DNA两端串联融合，形成包含R U5和U3区的长末端重复序列(LTR)反转录完成时，病毒DNA易位到细胞核中，在此称为整合前复合物(PIC)的线性拷贝的反转录病毒基因组，借助病毒体整合酶随机插入染色体DNA中，形成稳定的原病毒整合入宿主细胞基因组中的可能位点数目非常多并且分布非常广原病毒转录的控制主要归于病毒LTR的非编码序列转录起始位点位于左手边LTR(如图29所示)的U3和R之间的边界，poly(A)添加(终止)位点位于右手边LTR(如上图所示)中R和U5之间的边界U3含有所述原病毒的大多数转录控制元件，包括对细胞转录激活蛋白和在某些情况下对病毒的转录激活蛋白应答的启动子和多个增强子序列某些反转录病毒具有以下基因中的任何一种或多种基因诸如tat、rev、tax和rex，它们编码参与基因表达调节的蛋白原病毒DNA的转录再产生全长病毒RNA基因组大小的RNA分子和通过RNA加工产生的亚基因组大小的RNA分子通常，所有的RNA产物均用作产生病毒蛋白的模板通过RNA转录物剪接和翻译期间核糖体移码的联合实现RNA产物的表达RNA剪接是去除间插或“内含子”RNA序列且将其余的“外显子”序列连接以提供用于翻译的连续阅读框的过程反转录病毒DNA的最初转录物以几种方式修饰，而且它们非常类似于细胞mRNA然而，与其中所有内含子被有效剪接的大多数细胞mRNA不同，新合成的反转录病毒RNA必须转变为两类一类保持不剪接，以用作基因组RNA，而另一类进行剪接，以提供亚基因组RNA全长未剪接的反转录病毒RNA转录物有两个功能(i)它们编码gag和pol基因产物，和(ii)它们作为基因组RNA包装入子代病毒体颗粒中亚基因组大小的RNA分子为其余的病毒基因产物提供mRNA所有剪接的反转录病毒转录物均带有第一外显子，它跨越5’LTR的U5区最后一个外显子总是保留3’LTR编码的U3区和R区，尽管其大小不同其余RNA结构的组成取决于剪接次数和可变剪接位点的选择在简单型反转录病毒中，一类新合成的反转录病毒RNA保持未剪接，以用作基因组RNA以及用作gag和pol的mRNA另一类进行剪接，将基因组RNA的5’部分融合至下游基因，最常见为env用位于gag上游的剪接供体和pol3’末端附近的剪接受体完成剪接在剪接供体和剪接受体之间、通过剪接去除的内含子含有gag和pol基因这一剪接过程产生包膜(Env)蛋白的mRNA所述剪接供体通常位于gag上游，但在诸如ASLV的某些病毒中，剪接供体位于gag基因中的少数密码子，产生第一Env翻译产物，包括与Gag共有的少数氨基末端氨基酸残基Env蛋白在膜结合的多核糖体上合成，并通过细胞的囊泡运输转运至质膜，在此它装入病毒颗粒中复杂型反转录病毒既产生单剪接转录物，又产生多剪接转录物，它们不仅编码env基因产物，而且编码数组这些病毒特有的调节蛋白和辅助蛋白复杂型反转录病毒诸如慢病毒，尤其是HIV，提供了在反转录病毒感染期间可能发生的可变剪接复杂性的突出实例例如，目前已知HIV-1能够通过亚适剪接，由最初的基因组转录物产生30种以上的不同mRNA由于破坏竞争性剪接受体的突变可以引起剪接模式的变化，并且可以影响病毒的感染性，因此看来这种选择过程受到调节(Purcell和Martin 1993 J Vriol 676365-6378)在感染细胞中，全长RNA和亚基因组大小RNA的相对比例是变化的，在反转录病毒基因表达期间，对这些转录物水平的调节是潜在的控制步骤对于反转录病毒基因的表达，未剪接RNA和剪接的RNA均必须转运到胞质，并且必须维持适当的剪接的和未剪接的RNA比例，以有效地进行反转录病毒的基因表达不同类别的反转录病毒已经演变出对该问题的不同解决方法仅使用全长和单剪接RNA的简单型反转录病毒，或者利用可变有效剪接位点，或者通过在其基因组中加入几种仅部分定义的顺式作用元件，来调节剪接与非剪接类型RNA的胞质比率既控制单剪接RNA的合成又控制多剪接RNA合成的复杂型反转录病毒，通过RNA上的序列与辅助基因之一(诸如HIV-1的rev和HTLV-1的rex)的蛋白产物相互作用，来调节不同基因组和亚基因组大小的RNA类型的转运和可能的剪接关于结构基因gag、pol和env本身以及略微更详细的介绍，gag编码病毒的内部结构蛋白gag被蛋白酶水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)pol基因编码反转录酶(RT)，RT既含有DNA聚合酶又具有相关的RNA酶H活性以及整合酶(IN)，逆转录酶介导基因组的复制env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物这种相互作用最终使病毒膜与细胞膜融合Env蛋白是包被病毒颗粒并在病毒进入靶细胞时起主要作用的病毒蛋白反转录病毒的包膜糖蛋白复合物包括两种多肽一种外部的糖基化亲水多肽(SU)和一种跨膜蛋白(TM)这些蛋白一起形成病毒体表面上的寡聚“隆起(knob)”或“隆起的刺突”两种多肽均由env基因编码，并以多肽前体形式合成，多肽前体在其转运至细胞表面期间被蛋白水解切割尽管未切割的Env蛋白能够结合于所述受体，但切割本身对激活该蛋白的融合潜力是必需的，这对于病毒进入宿主细胞是必需的通常，SU和TM蛋白均于多个位点糖基化然而，在某些病毒中，例如MLV，TM不被糖基化尽管SU和TM蛋白本身不一定总是包膜病毒体颗粒装配所需的，但它们在病毒进入过程中起重要作用在该方面，SU域结合于靶细胞上的受体分子，通常是特定的受体分子据信这一结合过程激活TM蛋白的诱导膜融合潜力，然后病毒膜和细胞膜融合在某些病毒中，特别是MLV，人们认为导致去除TM胞质尾的短部分的切割过程在暴露该蛋白完整融合活性中起关键作用(Brody等1994 J Virol684620-4627；Rein等1994 J Virol 681773-1781)TM跨膜区段远侧的该胞质“尾”仍留在病毒膜内侧上，在不同的反转录病毒中其长度显著不同因此，SU/受体相互作用的特异性可以限定反转录病毒的宿主范围和组织嗜性在某些情况下，这种特异性可能限制重组反转录病毒载体的转导潜力这里，转导包括用病毒载体将非病毒基因传递至靶细胞的过程因此，许多基因治疗试验使用MLV具有称为4070A的包膜蛋白的特定MLV被称为兼嗜性病毒，它也可以感染人细胞，因为其包膜蛋白与人和小鼠之间保守的磷酸转运蛋白“对接”这种转运蛋白是普遍存在的，因此这些病毒能够感染许多细胞类型然而，在某些情况下，尤其从安全的角度来看，它可能对特异性靶向限定的细胞有益为此，几个研究小组工程改造了一种与其兼嗜性不同的相对正常地仅感染小鼠细胞的小鼠亲嗜性反转录病毒，使其特异性感染特定的人细胞用红细胞生成素区段取代Env蛋白的片段，产生重组反转录病毒，该反转录病毒则特异性地结合至在其表面表达红细胞生成素受体的人细胞，诸如红细胞前体(Maulik和Patel 1997“MolecularBiotechnologyTherapeutic Applications and Strateges”1997 Wiley-LissInc.，第45页)除gag、pol和env外，复杂型反转录病毒还含有“辅助”基因，它们编码辅助蛋白辅助蛋白定义为由通常的复制基因或结构基因gag、pol和env编码的蛋白以外的、由辅助基因编码的蛋白这些辅助蛋白不同于参与基因表达调节的蛋白，如由tat、rev、tax和rex编码的蛋白辅助基因的实例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一个或多个这些辅助基因可以见于例如HIV中(参见例如Coffin等编辑的“Retroviruses”，Pub.CSHL 1997的第802和803页)非必需辅助蛋白可以在特化的细胞类型中起作用，提供与由细胞蛋白提供的功能至少部分重复的功能通常，辅助基因位于pol和env之间，恰好在env下游，包括LTR的U3区或env和每种其它基因的重叠部分复杂型反转录病毒已经进化出调节机制，所述调节机制利用病毒编码的转录激活蛋白以及细胞转录因子这些反式作用的病毒蛋白用作由LTR指导的RNA转录的激活蛋白慢病毒的转录反式激活蛋白由病毒tat基因编码Tat结合于稳定的称为TAR的茎-环RNA二级结构，其一种功能是使Tat明显最佳定位，以反式激活转录如前所述，已经提议将反转录病毒作为传递系统(否则作为传递载体进行表达)，特别是将NOI或多个NOI传递至一个或多个目的位点这种转移可以在体外、活体外或体内或混合情况下进行当以该方式使用时，反转录病毒通常称为反转录病毒载体或重组反转录病毒载体甚至应用反转录病毒载体研究反转录病毒生活周期的各个方面，包括受体利用、反转录和RNA包装(由Miller综述，1992 Curr TopMicrobiol Immunol1581-24)在用于基因治疗的典型重组反转录病毒载体中，可以从病毒除去一个或多个gag、pol和env蛋白编码区中的至少一部分这使得反转录病毒载体为复制缺陷型除去的部分甚至可以用一种NOI取代，以便产生能够将其基因组整合入宿主基因组的病毒，但其中修饰的病毒基因组由于缺乏结构蛋白而不能自我繁殖当整合入宿主基因组中时，所述NOI表达产生例如治疗和/或诊断效应因此，通常如下将所述NOI转移至目的位点将NOI整合入重组病毒载体中；将修饰的病毒载体包装入病毒体外壳中；使其转导目的位点，诸如靶细胞或靶细胞群可以繁殖并分离大量的反转录病毒载体(例如制备适当滴度的反转录病毒载体)，然后例如通过联合采用包装细胞系或辅助细胞系和重组载体而转导目的位点在某些情况下，繁殖和分离可能需要分离反转录病毒的gag、pol和env基因，并将其分别导入宿主细胞中获得“包装细胞系”所述包装细胞系产生包装反转录病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi区而不能包衣壳然而，当将携带NOI和psi区的重组载体导入包装细胞系时，所述辅助蛋白可以包装psi阳性重组载体，产生重组病毒原种这可以用来转导细胞，以将所述NOI导入细胞基因组中其基因组缺乏产生病毒蛋白所需的所有基因的重组病毒，只能转导一次并且不能繁殖已知这些仅能转导一轮靶细胞的病毒载体为复制缺陷型载体因此，将所述NOI导入宿主/靶细胞基因组，而不产生潜在有害的反转录病毒“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress，编辑JM Coffm，SM Hughes，HE Varmus第449页)中概述了可用的包装细胞系反转录病毒包装细胞系的设计已发展到解决特别是早先设计常遇到的自发产生辅助病毒的问题因为同源性非常有助于重组，所以降低或消除该载体基因组和辅助病毒基因组之间的同源性减少了产生辅助病毒的问题新近，已经研制出包装细胞，其中在独立转染入包装细胞系的分离的表达质粒中携带gag、pol和env病毒编码区，使得野生型病毒的产生需要重组三次这降低了产生可复制病毒的可能性该策略有时称为三质粒转染法(Soneoka等1995 Nucl.Acids Res.23628-633)当研制载体时，瞬时转染也可以用来测量载体的产生在该方面，瞬时转染避免了产生稳定的载体产生细胞系所需的较长时间，如果该载体或反转录病毒包装组分对细胞有毒性，则使用瞬时转染通常用来产生反转录病毒载体的组分包括编码Gag/pol蛋白的质粒、编码Env蛋白的质粒和含有NOI的质粒载体的产生包括将这些组分中的一种或多种瞬时转染入含其它所需组分的细胞中如果该载体编码有毒基因或编码干扰宿主细胞复制的基因，诸如细胞周期抑制剂或诱导细胞凋亡的基因，则可能难以产生稳定的载体产生细胞系，但瞬时转染可以用来在细胞死亡之前产生所述载体此外，利用瞬时转染，已经开发出其产生的载体滴度水平与得自稳定的载体产生细胞系的水平相当的细胞系(Pear等1993，Proc Natl Acad Sci 908392-8396)某些HIV蛋白的毒性可能使得难以产生稳定的基于HIV的包装细胞，由于这种毒性，通常通过载体和辅助病毒的瞬时转染制备HIV载体某些工作者甚至用水泡性口膜炎病毒(VSV)的Env蛋白取代HIV的Env蛋白VSVEnv蛋白的插入促进载体的浓缩，因为通过瞬时转染，已经产生滴度为5×105(浓缩后为108)的HIV/VSV-G载体(Naldini等1996 Science 272263-267)因此，HIV载体的瞬时转染可以提供有用的策略，以产生高滴度的载体(Yee等1994 PNAS.919564-9568)关于载体的滴度，反转录病毒载体的实际使用主要受以下因素的限制在体外培养中能够获得的转导颗粒滴度(通常不超过108颗粒/ml)和许多包膜病毒对浓缩和纯化病毒的常规生化和物化技术的敏感性例如开发了几种浓缩反转录病毒载体的方法，包括使用离心(Fekete和Cepko 1993 MolCell Biol132604-2613)、中空纤维过滤(Paul等1993 Hum Gene Ther 4609-615)和切向流过滤(Kotani等1994 HunGene Ther 519-28)尽管可以使病毒滴度提高20倍，但反转录病毒的Env蛋白的相对脆性限制了浓缩反转录病毒载体的能力，且浓缩该病毒通常导致感染性病毒体的回收差尽管如上所述，通过用更稳定的VSV-G蛋白取代反转录病毒的EnV蛋白可以克服该问题，使得可以更高产率更有效地浓缩载体，但其缺点是VSV-G蛋白对细胞的毒性相当大尽管用目前可利用的载体可获得107cfu/ml的无辅助病毒的载体滴度，但通常可以用滴度低得多的载体贮液进行试验然而，由于实用原因，高滴度的病毒最好，尤其是当必须感染大量的细胞时另外，转导高百分率的某些细胞类型需要高滴度例如，人造血祖细胞感染率主要取决于载体的滴度，只有用滴度非常高的贮液才能获得有效感染率(Hock和Miller 1986 Nature 320275-277；Hogge和Humphries 1987Blood 69611-617)在这些情况下，仅仅将所述细胞暴露于更大量的病毒以补偿低病毒滴度是不够的相反，在某些情况下，感染性载体病毒体的浓度对于促进有效的转导可能是关键的研究人员正在尝试产生高滴度的载体以用于基因传递例如已证明不同载体设计的比较，可用来帮助确定产生高滴度病毒所需的必需元件关于不同反转录病毒载体设计的早期工作表明，几乎所有的MLV内部蛋白编码区均可以缺失，而不消除该载体的感染性(Miller等1983 Proc Natl Acad Sci 804709-4713)这些早期载体仅保留env编码区3’端的小部分后续工作表明，所有的env基因编码序列均可以去除，而不会进一步降低载体的滴度(Miller和Rosman 1989Biotechnique 7980-990；Morgenstern和Land 1990 Nucleic Acids Res 183587-3596)仅病毒LTR和连接所述LTR、包括正链和负链DNA引发所需区段和将病毒RNA选择性包装入病毒体所需区域(psi位点；Mann等1983 Cell 33153-159)在内的短区域，被认为是载体传递必需的尽管如此，用这些早期载体获得的病毒滴度仍比亲代辅助病毒滴度低约10倍其它试验表明，gag基因5’端序列的保留显著提高病毒载体的滴度，这是因为将病毒RNA包装入病毒体中的包装效率的提高(Armentano等1987 J Virol 611647-1650；Bender等1987 J Virol611639-1646；Adam和Miller1988 J Virol 623802-3806)这种效应不是因为由该载体的gag区合成病毒蛋白，而是因为gag读框破坏或gag的密码子突变为终止密码子已经对载体的滴度无影响(Bender等1987出处同上)这些试验证明，将基因组RNA有效包装入MLV所需的序列比以前通过缺失分析限定的psi信号大(Mann等1983出处同上)为了获得高滴度(106至＞107)，证明反转录病毒载体包括这种称为psi+(psi plus)的较大的信号是重要的现在已经证明，该信号从所述剪接供体上游跨越至gag起始密码子下游(Bender等1987，出处同上)因为该信号的位置而使得在剪接的env表达转录物时缺失该信号这确保只有含病毒生活周期的所有三种必需基因的全长转录物被包装一些研制用于基因传递的高滴度载体的替代方法包括使用(i)缺陷型病毒载体，诸如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒和(ii)修饰的反转录病毒载体设计腺病毒是一种双链线性DNA病毒，它不经过RNA中间体根据基因序列的同源性，将超过50种的不同人血清型腺病毒分为6个亚群腺病毒的天然靶是呼吸道上皮和胃肠道上皮，一般仅产生轻度症状血清型2和5(具有95％序列同源性)最常用于腺病毒载体系统中，通常与年轻人的上呼吸道感染有关腺病毒是无包膜的规则二十面体典型的腺病毒包括140nm壳内DNA病毒二十面体对称的该病毒由152个壳粒组成240个六邻体和12个五邻体腺病毒颗粒核心含有36 kb线性双链体DNA，它于5’端与用作DNA复制引物的末端蛋白(TP)共价连接所述DNA具有反向末端重复序列(ITR)，且其长度随血清型而变化腺病毒进入细胞涉及一系列不同的过程病毒通过病毒纤丝(37nm)和细胞上的纤丝受体的相互作用而附着于细胞Ad2/5血清型的该受体最近已经鉴定出，命名为CAR(Coxsackie和Adeno受体，Tomko等(1997 Proc Natl Acad Sci 943352-3358)所述病毒通过细胞αvβ3和avβ5整联蛋白内化入内体，是由五邻体-基衣壳蛋白(base capsid protein)中的病毒RGD序列介导的(Wickham等，1993 Cell 73309-319)内化后，内体通过称为内体裂解(endosomolysis)的过程破裂，据信这是由细胞αvβ5整联蛋白优先促进的过程(Wickham等1994 J Cell Biol 127257-264)另外，最近有证据表明，Ad5的纤丝隆起以高亲和性结合于某些细胞类型表面上的1类MHCα2结构域，所述细胞类型包括人上皮细胞和B原淋巴细胞(Hong等1997 EMBO 162294-2306)随后，病毒易位至细胞核，在此激活早期区，并且不久后DNA进行复制和激活晚期区腺病毒DNA的转录、复制和包装需要宿主和病毒两者的功能性蛋白器病毒基因的表达可以分为早期(E)和晚期(L)晚期定义为开始病毒DNA复制腺病毒结构蛋白一般在晚期合成在腺病毒感染后，在大多数血清型病毒感染的细胞中，宿主细胞mRNA和蛋白的合成被抑制腺病毒2和腺病毒5的腺病毒裂解循环非常有效，每个感染细胞产生约10,000病毒体，并且合成过量的病毒蛋白和不掺入病毒体的DNA腺病毒早期转录是一连串复杂的相关互连的生化过程，但它主要需要在DNA复制开始之前合成病毒RNA图30是腺病毒基因组的示意图，显示早期和晚期基因转录的相对方向和位置腺病毒基因组的结构在所有腺病毒群中是相似的，特定的功能一般位于所研究的每种血清型的相同位置早期胞质信使RNA与病毒DNA上的四个明确的非连续区互补这些区命名为E1-E4早期转录物已经分类为一系列的立即早期区(E1a)、延迟早期区(E1b、E2a、E2b、E3和E4)以及中间区(intermediate region)早期基因在感染后约6-8小时表达，由基因区段E1-4中的7个启动子驱动E1a区参与病毒基因和细胞基因的转录反式激活以及其它序列的转录阻抑E1a基因对所有其它早期腺病毒信使RNA发挥重要的控制作用在正常组织中，为了有效地转录E1b、E2a、E2b、E3或E4区，需要活性E1a产物然而，可以绕过E1a功能可以操作细胞产生E1a样功能，或可以天然具有这类功能也可以操作病毒以绕过E1a功能病毒包装信号与E1a增强子(194-358 nt)重叠E1b区影响病毒和细胞的代谢以及宿主蛋白的关闭它还包括编码pIX蛋白的基因(3525-4088 nt)，包装全长病毒DNA需要此蛋白，它对于病毒的热稳定性是重要的感染晚期病毒过程的正常进程需要病毒E1b区E1b产物在宿主细胞核中起作用E1b序列产生突变的突变体的晚期病毒mRNA积累减少以及对腺病毒感染晚期正常观察到的宿主细胞转运的抑制削弱改变宿主细胞功能需要E1b，以使得加工和转运的改变有利于病毒晚期基因产物这些产物则导致病毒包装并释放病毒体E1b产生防止细胞凋亡的19 kD蛋白E1b也产生结合于p53的55 kD蛋白关于腺病毒及其复制的综述参见WO96/17053E2区是必需的，因为它编码72 kDa DNA结合蛋白、DNA聚合酶和55 kDa末端蛋白(TP)的80 kDa前体，TP是蛋白激发始动DNA合成所需的19kDa蛋白(gp 19K)在E3区中编码，它与调节宿主对病毒的免疫应答有关感染的第一阶段在TNFα作用下上调该蛋白的表达，该蛋白然后结合I类MHC抗原并防止该抗原迁移至上皮细胞表面，由此减弱细胞毒T淋巴细胞对腺病毒感染细胞的识别在体外研究中E3区是不必要的，并且可以通过缺失1.9 kb XbaI片段而被去除E4区与减少宿主蛋白的合成有关并增加病毒的DNA复制有5个家族的晚期基因，所有这些晚期基因均从主要晚期启动子起动晚期基因的表达包括涉及RNA剪接的非常复杂的转录后控制机制纤丝蛋白在L5区中编码腺病毒基因组邻接反向末端重复序列，所述序列在Ad5中为103 bp，并且是DNA复制所必需的感染后30-40小时，完成病毒的产生通过缺失对E2、E3和E4启动子的诱导重要的E1基因，可以转变腺病毒，以用作基因转移的载体E1复制缺陷型病毒可以在反式提供E1多肽的细胞系中繁殖，所述细胞系诸如人胚肾细胞系293可以通过重组，插入一种或多种治疗基因来取代E1基因由或者E1启动子或者异源启动子驱动该基因的表达通过缺失某些或所有E4可读框(ORF)，已经研制出毒性甚至更小的腺病毒载体然而，某些第二代载体看来不产生长期的基因表达，即使似乎保留所述DNA因此，看来一种或多种E4 ORF的功能可以增强病毒携带的至少某些病毒启动子的基因表达制备缺陷更多的病毒的替代方法是将所述病毒完全“去内脏”，仅保留病毒复制所需的末端重复序列可以用第一代辅助病毒，在293细胞系中使“去内脏的”或“无内脏的”病毒生长至高滴度，但难以分离“去内脏的”载体与辅助病毒有复制能力的腺病毒也可以用于基因治疗例如，可以将E1A基因插入第一代病毒中，使其处于肿瘤特异性启动子的调节之下理论上，在将病毒注射入肿瘤后，病毒可以在肿瘤中特异性地复制，而在周围正常细胞中不复制该类型的载体可以或者用来通过裂解直接杀伤肿瘤细胞，或者用来传递“自杀基因”，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV tk)，它可以在用丙氧鸟苷处理后杀伤受感染细胞和旁观者细胞或者，仅E1b缺陷的腺病毒已经特别在1期临床试验中用于抗肿瘤治疗由E1b编码的多肽能够阻断p53介导的细胞凋亡，防止细胞在病毒感染时自杀因此，在正常的非肿瘤细胞中，在缺乏E1b时，病毒不能阻断细胞凋亡，并因此不能产生感染性病毒并传播在p53缺陷型肿瘤细胞中，E1b缺陷型病毒可以生长并传播至相邻的p53缺陷型肿瘤细胞，而不传播至正常的细胞再者，该类型的载体也可以用来传递诸如HSV tk的治疗基因作为用于基因传递的载体，腺病毒优于其它基因治疗载体系统，其原因如下它是双链DNA无包膜病毒，能够在体内和体外转导范围广泛的人类和非人类来源的细胞类型包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞、初级乳房上皮细胞和有丝分裂后终末分化的细胞，诸如神经元(也许重要的例外为某些淋巴样细胞，包括单核细胞)腺病毒载体也能够转导非分裂细胞对于其中肺上皮中的受累细胞更新率慢的诸如囊性纤维化的疾病而言，这是非常重要的事实上，正在进行的几个试验利用腺病毒介导将囊性纤维化转运蛋白(CFTR)转移入罹患囊性纤维化成年患者的肺脏中腺病毒已经用作基因治疗的载体，并用于表达异源基因大(36千碱基)基因组可以容纳高达8kb的外源插入DNA，并且能够在互补细胞系中有效复制，产生高达1012的非常高的滴度因此，腺病毒是研究基因在初级非复制型细胞中表达的最佳系统之一表达腺病毒基因组的病毒基因或外源基因不需要复制型细胞腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞一旦在细胞内，腺病毒载体极少整合入宿主染色体中，而是在染色体外(独立于宿主基因组)作为线性基因组在宿主细胞核中发挥作用因此，使用重组腺病毒缓解了与随机整合入宿主基因组有关的问题人类恶性肿瘤与腺病毒感染无关已经研制出减毒的腺病毒株，并已经作为活疫苗用于人类然而，目前的腺病毒载体在体内治疗应用方面存在某些重要的限制这些限制包括(i)瞬时基因表达-腺病毒载体一般保持为附加体并且不复制，使得它不能传递到以后的子代，(ii)因为它不能复制，所以靶细胞增殖能稀释该载体，(iii)产生针对腺病毒蛋白的免疫应答，使得甚至低水平表达腺病毒蛋白的细胞被破坏，以及(iv)不能得到有效的治疗指数，因为体内的传递导致仅一部分靶细胞摄入该载体以及表达所传递的基因如果将腺病毒的特征与反转录病毒/慢病毒的遗传稳定性结合，则所述腺病毒基本上可以用来转导靶细胞，以成为可以稳定感染相邻细胞的瞬时反转录病毒产生细胞除在提高载体滴度方面操作所述反转录病毒和腺病毒载体外，还对反转录病毒载体进行操作使其自我失活例如通过缺失所述转录增强子或3’LTR的U3区中的转录增强子和启动子构建第一个自我失活的反转录病毒载体在病毒复制一轮后，这些变化拷贝到5’LTRS和3’LTRS，产生失活原病毒(Yu等1986Proc Natl Acad Sci 833194-3198；Dougherty和Temin 1987 Proc NatlAcad Sci 841197-1201；Hawley等1987 Proc Natl Acad Sci 842406-2410；Yee等1987 Proc Natl Acad Sci 919564-9568)但是，这类载体中的LTR内部的任何启动子仍然具有活性已经利用这种策略消除病毒LTR中的增强子和启动子对位于内部的基因的转录的作用这类作用包括增强转录(Jolley等1983 Nucleic Acids Res 111855-1872)或抑制转录(Emerman和Temin 1984 Cell 39499-467)还可应用这种策略消除3’LTR向下游转录为基因组DNA(Herman和Coffin 1987 Science 236845-848)这种作用特别涉及人类基因治疗，其中特别重要的是防止偶发性激活内源性癌基因这种策略的缺点包括与具有完整LTR的载体相比，自我失活载体的滴度低(至少低10倍)以及推测现存载体自我重组或与用于产生载体贮液的反转录病毒包装细胞中的病毒序列重组而倾向于重排产生具有完整LTR的病毒除在提高载体滴度方面操作所述反转录病毒载体外，还设计了反转录病毒载体，以在转导细胞中诱导产生特定的NOI(通常为标记蛋白)如前所述，最常用的反转录病毒载体设计包括用一种或多种NOI取代反转录病毒序列，以产生复制缺陷型载体最简单型方法是使用所述反转录病毒5’LTR中的启动子，来控制编码NOI的cDNA的表达，或改变所述LTR的增强子/启动子，以提供组织特异性表达或诱导性或者，通过用在启动子选择中提供更大灵活性的内部启动子表达单一的编码区当所述NOI为选择标记时，如在次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)的情况下，最容易实现表达目的基因的这些策略(Miller等1983Proc Natl Acad Sci 804709-4713)，这有助于载体转导细胞的选择如果该载体含有不是选择标记的NOI，则可以通过与存在于独立质粒上的选择标记共转染，将该载体导入包装细胞该策略对于基因治疗的突出优点是在最终的靶细胞中表达单一的蛋白，并且避免选择标记的可能毒性和抗原性然而，当所插入的基因不可选择时，该方法的缺点是更难以产生产生高滴度载体贮液的细胞另外，通常更难以测定该载体的滴度目前用来设计表达两种或两种以上蛋白的反转录病毒载体的方法，依赖于三种通用的策略这三种策略包括(i)由一种启动子转录的可变剪接的mRNA表达不同的蛋白；(ii)使用5’LTR中的启动子和内部启动子，驱动不同cDNA的转录，和(iii)使用内部核糖体进入位点(IRES)元件，以允许由或者单一mRNA或者由可以从一个可读框表达的融合蛋白翻译多个编码区含内部启动子的载体已经广泛用来表达多个基因一个内部启动子使得可利用非病毒LTR的启动子/增强子组合来驱动基因表达多个内部启动子可以包括在反转录病毒载体中，且已经证明可以分别由其自身的启动子表达至少三种不同的cDNA(Overell等1988 Mol CellBiol81803-1808)尽管现在有许多这类修饰的反转录病毒载体可以用于在多种哺乳动物细胞中表达NOI，但其中大多数反转录病毒载体衍生自不能转导非分裂细胞的简单型反转录病毒，诸如鼠类致癌反转录病毒例如广泛使用的利用可变剪接表达病毒LTR SV(X)的基因(Cepko等1984 Cell 371053-1062)的载体，含有新霉素磷酸转移酶基因作为选择标记这类类型载体的代表是亲代病毒MO-MLV，在该病毒中Gag和Gag-Pol蛋白由全长病毒mRNA翻译，而Env蛋白由剪接的mRNA产生由该载体编码的其中一种蛋白由全长RNA翻译，而将5’LTR附近的剪接供体连接于恰好在第二基因上游的剪接受体的剪接作用产生一种RNA，由该RNA可以翻译第二基因产物该策略的一个缺点是将外源序列插入剪接基因的内含子中这可以影响剪接RNA与未剪接RNA之比，或提供干扰编码第二基因产物的剪接RNA产生的可变剪接受体(Korman等1987 Proc Natl Acad Sci 842150-2154)因为这些效应是不可预测的，所以它们可能影响所述编码基因的产生其它修饰的反转录病毒载体可以根据剪接能力分为两类第一类修饰的反转录病毒载体在剪接供体内含有抑制病毒转录物剪接的突变(GT至GC)，其典型代表为pBABE载体(Morgenstem等1990 Nucleic Acid Reseasrch 183587-3596)这种剪接抑制是有益的，原因有两个首先，它确保所有的病毒转录物均含有包装信号，并因此所有的病毒转录物均可以包装入所述产生细胞其次，它防止病毒剪接供体和所插入基因的可能的隐蔽剪接受体之间的潜在的异常剪接第二类修饰的反转录病毒载体含有功能性内含子，其典型代表为N2(Miller等1989 Biotechniques 7980-990)和新近的MFG(Dranoff等1993 Proc Natl Acad Sci193979-3986)这两种载体均利用存在于包装信号内的正常剪接供体然而，它们各自的剪接受体(SA)不同对于N2，SA存在于“延伸的”包装信号内(Bender等1987，出处同上)对于MFG，使用天然的SA(存在于pol内，参见