专利名称：口服皮肤保湿剂及功能食品和饮料的制作方法 已知能促进皮肤组织中水分保持的保湿方式表现为通过增加所谓天然保湿因子来实现表皮角质层中的水分保持，天然保湿因子主要由特定的氨基酸组成；通过增加细胞间脂质来实现角化细胞中的水分保持，细胞间脂质可充当角质层中水分保持的屏障；防止天然保湿因子的流失等。作为天然保湿因子基本成分的氨基酸是通过消化纤维聚合蛋白获得的，纤维聚合蛋白是一种由表皮角化细胞产生的蛋白质，因此促进纤维聚合蛋白的产生对保湿效果有着重要作用。另一方面，含有多种脂质的细胞间脂质是通过表皮中一系列酶反应产生的。此外，神经酰胺的产生特别重要，而通过丝氨酸棕榈酰转移酶形成鞘氨醇骨架则在神经酰胺的产生过程中起重要作用。迄今为止，针对具有皮肤保湿效果的成分已经展开了很多研究，尤其是在外用化妆品和备皮领域。例如，很多人建议在化妆品或其类似物中添加发酵乳清或发酵乳清的提纯产品，以期产生保湿效果。专利公开1和2分别明确给出了用外用发酵乳清获得保湿效果的教导；专利公开3揭示了一种外用备皮，其包含蛋白酶和一种具有保湿效果的乳酸菌培养上清液，并以瑞士乳杆菌作为乳酸菌的一个公开实例。然而，包括专利公开3在内的所有参考文献均未能确认用瑞士乳杆菌发酵的乳清实际外用的保湿效果。专利公开4揭示了一种瑞士乳杆菌株MIKI-020(FERM P-13678)的培植物或代谢物，具有抑制黑色素生成和促进胶原质生成的效果，但该参考文献并未论及其保湿效果。专利公开2和3进一步描述说含有发酵乳清的外用备皮还可以用于食品和饮料。但是，专利公开2和3均未说明外用备皮如何用于食品和饮料，以及用于食品和饮料后会产生什么样的效果。除了发酵乳清之外，也有人建议通过口服和外用其他成分来实现保湿效果。然而，人们尚未就“通过一种途径使用有效的成分通过另一种途径使用就一定能获得相似效果”达成共识，许多成分在两种途径中会产生无法比较的效果。专利公开1JP-2001-31557-A专利公开2JP-11-228339-A专利公开3WO-01-019324-A专利公开4JP-2002-80340-A发明内容本发明的一个目的是提供通过口服可产生皮肤保湿效果的功能食品和饮料，以及一种用于该功能食品和饮料的口服皮肤保湿剂。本发明提供了一种口服皮肤保湿剂，该口服皮肤保湿剂以瑞士乳杆菌乳品发酵获得的发酵乳清作为活性成分。本发明还提供了含有上述口服皮肤保湿剂并具有保湿效果的功能食品和饮料。
本发明进一步提供了用瑞士乳杆菌乳品发酵获得的发酵乳清来生产口服皮肤保湿剂、或具有皮肤保湿效果的功能食品和饮料的方法。
本发明提供了一种通过口服由瑞士乳杆菌乳品发酵获得的发酵乳清来实现皮肤保湿的方法。
根据本发明，含有保湿剂的口服皮肤保湿剂和功能食品、饮料中的活性成分为由瑞士乳杆菌乳品发酵获得的发酵乳清，发酵乳清的口服安全性已经得到验证。因此，通过安全的口服可达到良好的保湿效果，连续服用则可抑制因季节、气候变化引起的肌肤干燥，改善皮肤状况。

现对本发明进行详细描述。
本发明口服皮肤保湿剂以瑞士乳杆菌乳品发酵获得的发酵乳清作为活性成分。
优先选用具有高细胞外蛋白酶活性的瑞士乳杆菌种，如依照Yamamoto等人的方法测得的U/OD590值不低于400的菌种(Yamamoto N.et al.J.Biochem.(1993)114，740)Yamamoto等人的检测方法是基于Twining等人的检测方法。(Twining，S.，Anal.Biochem.143 3410(1984))。
特别的，可以使用具有以下细菌学特性的瑞士乳杆菌种。
细菌学特性1.形态特性1)细胞形状杆状2)活动性无3)孢子形成无4)革兰氏染色剂阳性2.生理学特性1)接触酵酶产生阴性2)吲哚产生阴性3)硝酸还原作用阴性4)有氧生长兼无氧生长5)通过单纯乳酸发酵从葡萄糖中产生DL(-)乳酸，无气体生成6)碳水化合物降解葡萄糖+乳糖+甘露糖+果糖+半乳糖+蔗糖-麦芽糖-木糖-鼠李糖-纤维二糖-海藻糖-
蜜二糖-蜜三糖-水苏糖-甘露醇-山梨糖-马栗树糖-水杨苷-上述优选瑞士乳杆菌种的一个样品为瑞士乳杆菌CM-4(保藏于产业技术综合研究所特许生物寄存处，Tsukuba Center 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan，保藏编号FERM BP-6060，保藏日期1997年8月15，以下称为CM-4)，根据布达佩斯条约，CM-4已经按专利程序以前述保藏编号保藏于国际认可的微生物存放处，并已获准专利权。
发酵乳清可以通过在乳品中添加含瑞士乳杆菌的发酵剂、适当选择温度等发酵条件，以及在选定的条件下发酵获得。
作为活性成分，发酵乳清可以通过常规分离方法，如离心法或过滤法，从已经发酵的乳品中获得。未经分离的发酵乳品或者已经分离的乳清可以通过适当的分馏、浓缩、提纯或其他处理即可使用，乳清或其浓缩物可以通过冻干或喷雾干燥制成粉末。
瑞士乳杆菌优选未经培植且具有足够活性的引发剂，起始细胞浓度最好可以为105-109细胞/ml。
当发酵乳清用于功能食品和饮料，如具有特定健康用途的功能食品时，为了增加香味和改进口感，作为活性成分的发酵乳清也可以通过采用瑞士乳杆菌和一种酵母辅酶化获得。酵母的种类没有特别的限制，可以优选巨酵母类酵母，如塞里维辛酵母，酵母的量也可以根据目合理选择。
起始原料乳品可以为牛奶、马奶、绵羊奶、山羊奶等动物乳汁，或豆浆等植物乳汁，或动物乳汁和植物乳汁的加工品，如脱脂乳、复制乳、奶粉和浓缩奶。其中，优选牛奶、豆浆或牛奶和豆浆的加工品，最好选用牛奶及其加工品。
乳品中的固体含量没有特别限制，例如脱脂乳中非脂肪固体的重量百分比通常在3-15％，按照产率还可能达为6-15％。
发酵通常在静态或搅拌状态下进行，例如在25-45℃温度下，最好在30-45℃温度下，经过3至72小时，最好为12至36小时，当乳酸的酸度达到1.5或更高时终止发酵。
除了活性成分发酵乳清外，本发明保湿剂还可以选择性地包含各种其它具有保湿效果的常见成分和添加剂，如赋形剂等，视保湿剂的形式而定。
本发明保湿剂的基本活性成分为发酵乳清，通过考虑服用的持续性、连续性和其他类似因素，可适当选择发酵乳清的口服剂量，以期获得理想的效果。每个人发酵乳清的日剂量通常在1到1000ml，最好为10到200ml。
本发明保湿剂甚至可以在症状，如皮肤水分减少等，出现后服用，或者在特定季节服用以防止这些症状出现，既可以持续每天服用也可以间歇服用。
本发明功能食品和饮料含有保湿剂，可以用作具有特定健康用途的食品，以防止水分流失和促进水分保持。
本发明功能食品和饮料可以选择性地含有添加剂，如糖、蛋白质、脂质、维生素、矿物质、调味剂或前述添加剂的混合物。此外，也可以含有分离出发酵乳清之后的乳品成分。
在本发明功能食品和饮料中，可以根据食品和饮料的形式或种类合理确定保湿剂的含量，也可以根据服用功能食品和饮料的连续性或其它因素合理确定保湿剂的含量，并没有特别的限制。活性成分发酵乳清的合理含量通常为0.1-100wt％，最好为10-90wt％。
功能食品和饮料的形式可以为发酵乳产品，如酵母乳或乳酸菌饮料、各种含有发酵乳清或发酵乳清浓缩物的加工食品和饮料、干粉、片剂、胶囊和颗粒等等。
本发明功能食品和饮料服用的剂量和时间没有特别限定，功能食品和饮料的服用量最好能大致确保前述活性成分的剂量。例如，在暴露于需要使用皮肤保湿的环境之前或之后，可以连续或间断地服用本发明功能食品和饮料。
样品现参照样品详细说明本发明，各样品只是为了对本发明进行示例性说明，并不对本发明构成任何限制。
样品1和对比样品1、2(发酵乳清和乳酸水溶液的制备)
在一种脱脂乳固体含量为9wt％的乳质培养液中加入3％的CM-4发酵剂(细胞浓度5×108细胞/ml)，在37℃下静态发酵24小时获得发酵乳，将所得发酵乳在12000G力下离心分离20分钟，去除沉淀物后即得发酵乳清(以下称为发酵乳清(A))。
为了对比，制备一种2.67w/w％的乳酸水溶液(下称为乳酸水溶液(a)，对比样品1)。
(促进SPT和纤维聚合蛋白合成能力的评价)(1)将表皮细胞(正常人的角化细胞，由KURABO INDUSTRIES有限公司制造)培植于HuMedia-KG2(商品名，由KURABO INDUSTRIES有限公司制造)中，以用来测试在一个35mm的培养皿上将细胞浓度为5×105细胞/片的表皮细胞培植24小时，再将培养介质换为含发酵乳清(A)或乳酸水溶液(a)的相同培养介质继续发酵24小时，发酵乳清(A)或乳酸水溶液(a)的浓度如表1所示。
(2)培植后，将细胞用PBS(-)冲洗后再用500μL/片的TRIzol试剂(商品名，由Gibco BRL制造)进行细胞溶解，加入100μL/片的氯仿并充分混合，所得上清液用离心法回收，所得RNAs用2-丙醇沉淀以获得全部的RNAs。所得的全部RNAs用75％的冷酒精清洗，并溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)-纯净水溶液。
(3)根据表2所示的各种条件和引物方案，将溶于DEPC-纯净水溶液的1μgRNAs用RT-PCR成套工具(商品名，Qiagen制造)进行RT-PCR处理，以反转录、放大和丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)mRNA、纤维聚合蛋白mRNA、或者cyclophilinRNA相应的cDNA。
(4)反应后，反应产物用1％琼脂凝胶电泳法进行分馏。电泳凝胶采用溴乙非啶着色，并在透照灯的紫外辐射下进行拍照，以确定谱带强度。
(5)通过减去由cyclophilin mRNA所衍生的谱带强度(在任一细胞中都具有相同值)，对由SPT mRNA或纤维聚合蛋白mRNA所衍生的谱带强度进行标准化处理，所得值以相对于当上述段(1)培养介质中发酵乳清浓度为0％时所得值(记为100)的相对值表示。测试进行两次，每次测试的结果如表1所示。
(6)分别将表皮细胞培植于含不同稀释浓度的发酵乳清(A)或乳酸水溶液(a)的HuMedia-KG2介质中，同时确定未显示细胞毒性时介质中发酵乳清(A)或乳酸水溶液(a)的最大浓度均为1.25％。
表1

表2

(含发酵乳清(A)的饮料和含未发酵乳清的饮料的制备)为了使上述制备的发酵乳清(A)适于饮用，将90重量份的发酵乳清(A)、0.25重量份的芳香剂、0.05重量份的冬氨酰苯丙氨酸甲酯和9.70重量份的水混合，以制备含发酵乳清(A)的饮料(样品1)。
为了对比，在上述用于制备发酵乳清(A)、固形物含量为9wt％的脱脂奶中加入乳酸，直至酸度为2.2％。混合物在12000G力下离心分离20分钟，以去除固形物，制取未发酵乳清。随后，将90重量份的所得未发酵乳清、0.25重量份的芳香剂、0.05重量份的冬氨酰苯丙氨酸甲酯和9.70重量份的水混合，以制备含未发酵乳清的饮料(样品2)。
(口服评价)测定了32名(年龄24至43岁、平均年龄为29.4岁)男性实验者右颊的表皮水分含量，根据测定结果将实验者分为两组各16人，以保证两组实验者测定值的平均值大致相同。
让其中一组实验者服用含发酵乳清(A)的饮料，让另一组服用含未发酵乳清的饮料，两组实验者均按150g/天的服用量持续服用3周，作出如下评价(表皮水分含量评价)在服用各自的饮料前和服用三周后，用SKICON 200(商品名，I.B.S.Co.，Ltd制造)测试实验者右颊的表皮水分含量，测试进行三次，取测试结果的平均值作为该处的表皮水分含量，测试结果如表3所示。
表3

单位μS每组实验者均按干燥皮肤和正常皮肤进行分组，服用各自饮料前和服用各自饮料三周后的结果分别列于表4。
表4

单位μS
从表3可以看出，相较于样品1和对比样品2服用前，皮肤水分含量均随着时间的延长而降低，这可能是由于季节的变化所引起。尽管如此，仍可看出样品1中皮肤水分含量的下降率小于对比样品2中水分含量的下降率。这表明在该测试中，口服含发酵乳清(A)的饮料抑制了表皮水分含量的降低，即起到了皮肤保湿的效果。
从表4中可见，对于干燥皮肤的实验者和正常皮肤的实验者均能产生相似的皮肤保湿效果。
参考样品(乳霜的制备)将3.00重量份的1，3-丁二醇，0.10重量份的对羟基苯甲酸酯、40.00重量份的羧基乙烯聚合物(商品名Carbopol 980，由NIKKO CHEMICALS CO.，LTD.生产)、5.00重量份的发酵乳清(A)和25.90重量份的水搅拌混合，接着加入12.00重量份的10wt％的L-精氨酸水溶液和14.00重量份的水，进行同质混合以制备含发酵乳清(A)的乳霜(下称为含发酵乳清(A)的乳霜)。
另一方面，将3.00重量份的1，3-丁二醇、0.10重量份的对羟基苯甲酸酯、40.00重量份的羧基乙烯聚合物(商品名Carbopol 980，由NIKKO CHEMICALSCO.，LTD.生产)，30.90重量份的水搅拌混合，接着加入12.00重量份的10wt％的L-精氨酸水溶液和14.00重量份的水，进行同质混合以制备不含发酵乳清的乳霜。(以下称为对比乳霜)(通过应用进行评价)测定了15名男性实验者(年龄24至43岁，平均年龄31.4岁)右颊的表皮水分含量，根据测试结果将实验者分为8人和7人两组，以保证这两组人的平均测试值大致相同。
让其中一组实验者使用含乳清(A)的乳霜，让另一组实验者使用对比乳霜，均使用在右颊上。一天两次，上午和下午各一次，持续使用三周，作出如下评价。
(表皮水分含量评价)在使用各自的乳霜前和服用三周后，用SKICON 200(商品名，I.B.S.Co.，Ltd制造)测试实验者右颊的表皮水分含量，测试进行三次，取测试结果的平均值作为该处的表皮水分含量，测试结果如表5所示。
表5

从表5可以看出，较之不含发酵乳清(A)的乳霜，含乳清(A)的乳霜对表皮水分含量的降低没有抑制效果，这说明在皮肤上使用发酵乳清(A)并不能产生保湿效果。


本发明提供了通过口服可产生保湿效果的功能食品和饮料，其非常安全，并可以定期服用。本发明还提供了一种可用于功能食品和饮料的口服皮肤保湿剂，以及该口服皮肤保湿剂的应用。本口服皮肤保湿剂以瑞士乳杆菌乳品发酵获得的发酵乳清作为活性成分，本功能食品和饮料含有皮肤保湿剂，具有皮肤保湿效果。