专利名称：中药乌发经验方及其制备方法中药乌发经验方及其制备方法技术领域本发明属于化妆品领域，公开了一种中药乌发经验方及其制备方法。随着我国经济的发展，人们消费意识的增强及其消费水平的提高，美发产品渐渐 从奢侈品成为人们日常消费必需品。一方面，21世纪进入老龄化社会，中国老龄人口将达 到1.3亿；同时当今社会年轻人竞争激烈、精神紧张而导致的白发增多。使染发、乌发化妆 品市场需求日趋增大，拥有巨大的发展空间和潜在市场。另一方面，由于美容科学的迅速进 步，人们不再满足染发化妆品对头发的染色，而是追求化妆品中的营养物质直接参与毛发 的新陈代谢、追求科学护理。国内外市场上的染发剂经历了一系列的变化，从临时性染发到半永久性的染发直 到目前的永久性染发，所有这些染发剂中，都添加了头发的漂白剂，即先把头发中的黑色素 氧化分解而使头发脱色后以便再次上色。在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题现有的染发剂 会对头发有不同程度的损害，并且随着人的新陈代谢的不断进行，新生成的头发仍然为原 色，尤其是对于头发中含有白发的人，并未从根本上解决使头发变黑的问题，所以从安全有 效的角度出发，市场需要天然的制品代替现有染发剂，从而达到真正意义上的乌发。发明内容本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够乌黑头发的中 药乌发经验方。本发明实施例的另一个目的是提供含有有效剂量的上述中药组合物和药用载体 组成的药物组合物。本发明实施例的又一个目的是提供这种药物组合物的制备方法。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是
一种中药乌发经验方，包括以下重量份的中药组合物
侧柏叶1 40份、旱莲草1 40份、女贞子1 30份、桑椹1 30份、黄芩1 30份、薄荷1 30份。
本发明提供优选的技术方案是一种中药乌发经验方，包括以下重量份的中药组 合物
侧柏叶10 30份、旱莲草10 30份、女贞子5 20份、桑椹5 20份、黄芩 5 20份、薄荷5 20份。
本发明提供更优选的技术方案是一种中药乌发经验方，包括以下重量份的中药 组合物侧柏叶20份、旱莲草20份、女贞子10份、桑椹10份、黄芩10份、薄荷10份。
本发明还提供一种药物组合物，含有有效剂量的上述中药组合物及药用载体。
本发明的药物组合物的制备方法包括以下步骤
洗剂的制备方法取侧柏叶、旱莲草、女贞子、桑椹、黄芩和薄荷混合，给混合药 材中加入混合药材总重量5-7倍量的蒸馏水冷浸20-40min后，加热，煮沸后保持沸腾 40min-80min,过滤，得滤液，给药渣中加入混合药材总重量3_5倍量的蒸馏水，煮沸后保持 沸腾20-40min，过滤，合并两次滤液，静置36_60h，取上清液，用柠檬酸调pH值6. 0-6. 5，即 得洗剂。
搽剂/酊剂的制备方法取侧柏叶、旱莲草、女贞子、桑椹、黄芩和薄荷混合，给混 合药材中加入药材总重量5-7倍量75%乙醇，室温下密闭浸泡20-40min，85°C加热回流提 取两次，第一次煮沸后，保持沸腾20-60min，过滤后药渣再用混合药材总重量3_5倍量75% 乙醇第二次煮沸，保持沸腾20-40min，过滤，合并两次滤液，静置36_60h，取上清液用柠檬 酸调pH值6. 0-6. 5，即得搽剂/酊剂。
本发明实施例的有益效果是本发明主要针对血热偏盛，毛根失养所致毛发早白 者，其效果主要是通过滋补肝肾、凉血止血，除湿止痒，深入头发的毛囊提高酪氨酸酶的活 性，促进黑素瘤细胞的增殖，产生更多的黑色素，从而达到乌黑头发。本发明采用中药复方， 各味中药协同增效，与单味中药相比较，具有多系统、多靶点和多层次发挥全方位药效作用 的特点，从根本上解决黑发变白的问题。
本发明各药物的药用功能及作用
侧柏叶味苦涩、微辛。凉血止血，生发乌发，用于血热脱发，须发早白。《日华子本 草》载“烧取汁，涂头，黑润鬟发”；《本草纲目》“黑润鬟发”。
旱莲草味甘、酸、成，性寒。养肝益肾，凉血止血，乌须黑发。《本草纲目》“乌须发，益肾阴”;《本草经疏》“鳢肠善凉血。须发白者，......则须发变黑，而齿亦因之而固矣。故古今变白之草，当以兹为胜。”
女贞子性甘、苦、平，功能滋补肝肾，明目乌发。《本草纲目》“强阴，健腰膝，变白 发，明目”。能增殖毛囊细胞，促进毛发生长，增强酪氨酸酶活性，增加黑色素的生成，用于治 疗须发早白。
桑椹性味甘寒。补肝益肾，养血生津，用于须发早白。《本草求真》“除热养阴…… 乌须黑发”。
黄芩性苦、寒，功能清热燥湿解毒，抑制细菌生长，去屑止痒，有较强的抗马拉色 菌的作用；实验研究表明，黄芩提取物对酪氨酸酶具有较强的激活作用。
薄荷性味辛，凉，具有宣散风热，清头目，透疹之功效。对头痒、头发干枯，油脂过 多、脂溢性脱发及头癣等具有改善作用。现代研究表明，薄荷提取物具有增强酪氨酸酶活性 的作用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
按照下列重量称取原料(g)
侧柏叶20g、旱莲草20g、女贞子10g、桑椹10g、黄芩10g、薄荷10g。
本发明的中药乌发经验方的洗剂的制备方法
取侧柏叶20g、旱莲草20g、女贞子10g、桑椹10g、黄芩IOg和薄荷IOg混合，给混合药材中加入混合药材总重量6倍量的蒸馏水冷浸30min后，加热，煮沸后保持沸腾lh，过 滤，给药渣中加入混合药材总重量4倍量的蒸馏水，煮沸后保持沸腾30min，过滤，合并两次 滤液，静置48h，取上清液，用柠檬酸调pH值6. 0-6. 5，即得洗剂。
使用方法使用者洗净头发后，用煮好的药汤均勻浇在头上使头发全部浸湿，边浇 边按摩头皮，15分钟后，再用毛巾包裹起来，3小时后用清水洗净。
实施例2
按照下列重量称取原料(g)
侧柏叶10g、旱莲草25g、女贞子15g、桑椹5g、黄芩15g、薄荷5g。
本发明的中药乌发经验方的洗剂的制备方法
取何侧柏叶10g、旱莲草25g、女贞子15g、桑椹5g、黄芩15g和薄荷5g混合，给混 合药材中加入混合药材总重量5倍量的蒸馏水冷浸20min后，加热，煮沸后保持沸腾40min， 过滤，给药渣中加入混合药材总重量3倍量的蒸馏水，煮沸后保持沸腾20min，过滤，合并两 次滤液，静置36h，取上清液，用柠檬酸调pH值6. 0-6. 5，即得洗剂。
使用方法如实施例1。
实施例3
按照下列重量称取原料(g)
侧柏叶35g、旱莲草10g、女贞子lg、桑椹25g、黄芩30g、薄荷lg。
本发明的中药乌发经验方的洗剂的制备方法
取侧柏叶35g、旱莲草10g、女贞子lg、桑椹25g、黄芩30g和薄荷Ig混合，给混合 药材中加入混合药材总重量7倍量的蒸馏水冷浸40min后，加热，煮沸后保持沸腾80min，过 滤，给药渣中加入混合药材总重量5倍量的蒸馏水，煮沸后保持沸腾40min，过滤，合并两次 滤液，静置60h，取上清液，用柠檬酸调pH值6. 0-6. 5，即得洗剂。
使用方法如实施例1。
实施例4
按照下列重量称取原料(g)
侧柏叶30g、旱莲草15g、女贞子20g、桑椹20g、黄芩5g、薄荷15g。
本发明的中药乌发经验方的搽剂/酊剂的制备方法
取侧柏叶30g、旱莲草15g、女贞子20g、桑椹20g、黄芩5g和薄荷15g混合，给混合 药材中加入药材总重量6倍量75%乙醇，室温下密闭浸泡30min，85°C加热回流提取两次， 第一次煮沸后，保持沸腾40min，过滤后药渣再用混合药材总重量4倍量75%乙醇煮沸后， 保持沸腾30min，过滤，合并两次滤液，静置48h，取上清液，用柠檬酸调pH值6. 0-6. 5，即得 搽剂/酊剂。
使用方法将药液喷湿头发，每天1-2次，边喷边揉，再用手指按摩头的各部位3-5 分钟，尔后用梳子反复梳理头发，使头皮下的毛细血管扩张，增加血流量，帮助药液渗透发 根。
实施例5
按照下列重量称取原料(g)
侧柏叶15g、旱莲草10g、女贞子5g、桑椹15g、黄芩20g、薄荷20g。
本发明的中药乌发经验方的搽剂/酊剂的制备方法
取侧柏叶15g、旱莲草10g、女贞子5g、桑椹15g、黄芩20g和薄荷20g混合，给混合 药材中加入药材总重量5倍量75%乙醇，室温下密闭浸泡20min，85°C加热回流提取两次， 第一次煮沸后，保持沸腾20min，过滤后药渣再用混合药材总重量3倍量75%乙醇煮沸后， 保持沸腾20min，过滤，合并两次滤液，静置36h，取上清液，用柠檬酸调pH值6. 0-6. 5，即得 搽剂/酊剂。
使用方法如实施例4。
实施例6
按照下列重量称取原料(g)
侧柏叶lg、旱莲草2g、女贞子30g、桑椹30g、黄芩lg、薄荷30g。
本发明的中药乌发经验方的搽剂/酊剂的制备方法
取侧柏叶lg、旱莲草2g、女贞子30g、桑椹30g、黄芩Ig和薄荷30g混合，给混合药 材中加入药材总重量7倍量75%乙醇，室温下密闭浸泡40min，85°C加热回流提取两次，第 一次煮沸后，保持沸腾lh，过滤后药渣再用混合药材总重量5倍量75%乙醇煮沸后，保持沸 腾40min，过滤，合并两次滤液，静置60h，取上清液用柠檬酸调pH值6. 0-6. 5，即得搽剂/酊 剂。
使用方法如实施例4。
本发明具有以下药理作用中药乌发经验方具有激活酪氨酸酶、促进细胞增殖和 促进黑色素合成的作用，以上药理作用为其临床用于防治白发提供了实验依据。
下面对本发明制备的中药乌发经验方水提取物(以下简称水提物)和乙醇提取物 (以下简称醇提物)进行的药效学研究，其方法和结果如下
一、对酪氨酸酶活性的影响
1材料和方法
1. 1中药乌发经验方的配方
侧柏叶20g、女贞子10g、旱莲草20g、桑葚10g、黄芩10g、薄荷IOg
1. 2中药乌发经验方提取物的制备
1. 2. 1中药乌发经验方水提物的制备
中药乌发经验方用药材总重量6倍量蒸馏水冷浸30min后，加热，煮沸后，保持沸 腾Ih后，过滤，再加入药材总量4倍量的蒸馏水煮沸后，保持沸腾30min，过滤，合并两次滤 液，蒸去溶剂成膏状，溶于pH6. 8,0. 05mol/L磷酸缓冲液中，稀释至浓度为lg/ml，备用。
1. 2. 2中药乌发经验方醇提物的制备
中药乌发经验方用药材总重量6倍量75%乙醇室温下密闭浸泡30min，85°C加热 回流提取两次，第一次煮沸后，保持沸腾40min，过滤后，药渣再用药材总重量4倍量75% 乙醇煮沸后，保持沸腾30min，过滤，合并二次滤液，挥去乙醇成膏状，加5mL 二甲亚砜，再用 pH6.8，0. 05mol/L磷酸缓冲液(PBS)稀释至浓度为lg/ml，备用。
1. 3试剂和仪器
试剂酪氨酸酶、左旋多巴来源于sigma公司；磷酸氢二钠(天津市大茂化学试剂 厂，批号20090721)；磷酸二氢钾(广州市新成化工厂，批号20010526)。
仪器ELX800型酶标仪(美国BIOTEK公司)；SW-CJ-IF型超净工作台(吴江 市汇通净化设备厂)；BT224S型电子分析天平(Sartorius公司)；IlOS电热恒温水浴锅(SHIPING 公司)。
1.4试剂的配置
1. 4. 3PBS溶液的配置
甲液0. 05mol/L Na2HPO4溶液，称取磷酸氢二钠7. 099g，加蒸馏水至1000ml。
乙液0. 05mol/L KH2PO4溶液，称取磷酸二氢钾6. 803g,加蒸馏水至IOOOml。
将甲、乙液分装在棕色瓶内，于4°C冰箱中保存，用时甲、乙两液按相同比例混合， 即可得到PH = 6. 8的PBS液。
1. 4. 1酪氨酸酶溶液的配制
精确称取25ku酪氨酸酶，溶于125ml PBS中，即酶活力单位200u/ml，振摇，溶解备用。
1. 4. 2左旋多巴溶液的配制
实验测定前Ih精密称取左旋多巴20mg，溶于50mlPBS中，即浓度0. %ig/ml，振摇， 充分溶解后备用。
1.4. 4受试药物的配制
将浓度为lg/ml的2个中药乌发经验方浓缩液分别用新鲜配制的PBS溶液稀释为 高、中、低三个剂量浓度，分别为lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml。
2实验方法
将以上配置的不同浓度的中药乌发经验方稀释液IOOul与酪氨酸酶50ul混合，于 36. 8°C恒温水浴锅温育5min后，加入50ul L-dopa继续温育2min，立即于酶标仪490nm处 测光密度OD值。每个样品重复测量6次，求平均值，再计算酪氨酸酶的激活率。
酪氨酸酶活性激活率按下公式计算激活率％= [(C-D)-(A-B)]/(A-B) XlOO
式中A= A475-药 + 酶
B = A475-药-酶
C = A475+ 药 + 酶
D = A475+ 药-酶
其中，
A 值为 IOOul 药液 +50ul 500u/ml 的酪氨酸溶液 +50ul 0. 4% L-dopa 溶液的 OD值。
B 值为 IOOul 药液 +50ulPBS 溶液 +50ul 0. 4% L-dopa 溶液的 OD 值。
C 值为 IOOul PBS+50ul 500u/ml 的酪氨酸溶液+50ul 0. 4% L-dopa 溶液的 OD 值。
D 值为 IOOul PBS+50ul PBS 溶液 +50ul 0. 4% L-dopa 溶液的 OD 值。
3实验结果
表1结果显示，中药乌发经验方水提物和醇提物均具有激活酪氨酸酶的作用，并 且各中药组方随着浓度的增加，酪氨酸酶活性逐渐增加，呈现剂量依赖关系。其中，激活率 最高的是水提物在lmg/ml水平时，对酪氨酸酶的激活率达32. 43%。
表1中药乌发经验方水提物和醇提物对酪氨酸酶的影响组别剂量C值D值■ 酶激活率/%/mg. ml"1A4;A4; 5+药+酶 5+药-酶水提物高10.2980.07832..43中0. 50.2790.07622..39低0. 250.2600.07213..35醇提物高10.0580.25511..83中0. 50.0560.2545.71低0. 250.0540.2450.31
二、对B16黑素瘤细胞增殖和黑素生成的影响
1材料和方法
1. 1主要试剂与仪器
细胞株的来源来自中国科学院上海细胞研究所。
试剂DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)； 胰蛋白酶(美国Sigma公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT，Amersco公司)；二甲基亚砜(广 东光华化学厂有限公司)。
仪器ELX800型酶标仪(美国BIOTEK公司)；BH2-RFL-T2型倒置显微镜(OLYMPUS 公司)；311型(X)2孵育箱(Thermo公司)；SW-CJ-IF型超净工作台(吴江市汇通净化设备 厂)；3K18型高速台式离心机(美国Sigma公司)；BT224S型电子分析天平(Sartorius公 司)；110S型电热恒温水浴锅(SHIPING公司)。
1. 2中药乌发经验方的处方
侧柏叶20g、女贞子10g、旱莲草20g、桑葚10g、黄芩10g、薄荷IOgo
1. 3中药乌发经验方提取物的制备
1.3. 1水提取物的制备
中药乌发经验方加入药材总重量6倍量的蒸馏水冷浸30min后，加热煮沸后，保持 沸腾Ih后，过滤，再加入药材总量4倍量的蒸馏水煮沸后，保持沸腾30min，过滤，合并两次 滤液，浓缩成浸膏，用PH6. 8,0. 05mol/L磷酸缓冲液溶解并稀释至浓度为lg/ml，4°C保存备用。
1.3. 2醇提取物的制备
中药乌发经验方用药材总重量6倍量75 %乙醇室温下密闭浸泡30min，85 V加 热回流提取两次，第一次煮沸煮沸后，保持沸腾40min，过滤后，药渣再用药材总量4倍量 75 %乙醇二次煮沸后，保持沸腾30min，过滤，合并两次滤液，挥去乙醇成膏状，再用pH6. 8， 0. 05mol/L磷酸缓冲液(PBS)溶解稀释至浓度为lg/ml，4°C保存备用。
2实验方法
2. 1小鼠B16黑色瘤细胞的培养
小鼠黑素瘤细胞B16细胞株，用含10% PBS的高糖DMEM培养基(含100U/ml青霉 素，100g/ml链霉素)培养至近融合状态时，以0. 25%胰蛋白酶及0. 02% EDTA消化，离心， 以上述培养基重悬细胞，调整细胞密度为lX105/ml，分别种96孔板(用于细胞增殖试验) 与6孔板(用于黑素含量测定)。细胞接种24h后，以添加药物的新鲜培养基换液，继续孵育48h(细胞增殖试验)及72h(黑素含量测定)后进行测定。
2. 2受试物溶液配制及实验分组
水提液和醇提液分别用无血清DMEM培养基稀释100mg/ml，过滤除菌，再以倍比稀 释法稀释为 10mg/ml，5mg/ml，2. 5mg/ml, 1. 25mg/ml，0. 625mg/ml，0. 3125mg/ml，0. 15625mg/ ml,0. 078125mg/ml，空白对照组为含受试物相应溶剂的培养基(纯水或乙醇)。
2. 3MTT法检测细胞增殖
取处对数生长期的B16细胞接种于96孔板，每孔1001 (接种密度为1 X IO4/孔)。 24h后，吸去培养基，以含不同浓度处理因素的新鲜培养基(10mg/ml，5mg/ml，2. 5mg/ml, 1. 25mg/ml，0. 625mg/ml，0. 1325mg/ml，0. 0613mg/ml,0. 0306mg/ml)换液，设不加药空白对 照，继续培养4 后，吸去培养基，用PBS洗涤，加入新鲜培养基，每孔加5g/LMTT溶液101， 置培养箱培养4h，吸去培养基，每孔加入1501DMS0，充分振摇，以酶标仪测定每孔490nm吸 光值。每一实验重复4次。
2. 4黑素含量的测定
将对数生长期的B16细胞接种于6孔板，每孔10001(接种密度为lX105/ml)。 24h后，吸去培养基，以含不同浓度处理因素的新鲜培养基(5mg/ml，2. 5mg/ml, 1. 25mg/ml, 0. 625mg/ml,0. 3125mg/ml)换液，每孔20001，设不加药空白对照，继续培养7 后，吸去培 养基，用PBS洗涤，胰酶消化，终止消化，收集消化液。各孔中消化液分别转入1.5mlEP管， 离心，去上清，加入10%三氯乙酸，离心，去上清，加入INNaOH溶液，水浴80°C至完全溶解， 转入酶标板，立即以酶标仪测定每孔490nm吸光值。每一实验重复4次。黑素增值率(A药 物组-A空白对照组)/A空白对照组X 100 %。
2. 5统计学方法
所测数据用均已用了 ± s表示，采用单向方差分析检验，统计过程使用SPSS13. O统计软件完成。
3实验结果
3. 1小鼠B16黑素瘤细胞增殖活性的测定
表2结果显示，与空白组比较，中药乌发经验方水提物在浓度(0. 15625、0. 3125、 0. 625、1. 25mg/ml)时具有明显促进黑素细胞增殖的作用(P < 0. 05)，浓度0. 625mg/ml增 值率最高；浓度在(5、10mg/ml)时对细胞增殖有明显的抑制作用；浓度2. 5mg/ml与空白对 照组相比无统计学差异(P > 0. 05)；中药乌发经验方醇提物在浓度(0. 15625,0. 3125mg/ ml)时对黑素细胞增殖有明显促进作用(P < 0. 05)，浓度0. 3125mg/ml时增值率较高；浓 度在(0. 625,1. 25、5、10mg/ml)时表现为明显抑制细胞增殖的作用，浓度10mg/ml抑制率最 高；浓度0. 078125mg/ml与空白对照组无统计学差异(P > 0. 05)。
表2中药乌发经验方水提物和醇提物对B16黑素瘤细胞增殖活性的影响(了士 s )


本发明公开了一种中药乌发经验方，包括以下重量份的中药组合物何首乌1～40份、黑芝麻1～40份、骨碎补1～40份、旱莲草1～40份、女贞子1～30份、菟丝子1～30份、夏枯草1～30份、泽兰1～30份、薄荷1～30份、川芎1～30份、干姜1～30份。将上述中药乌发经验方加入一定量的水或者乙醇提取可以制成洗剂和搽剂/酊剂两种外用剂型。本发明主要是通过滋补肝肾、凉血止血，除湿止痒，深入头发的毛囊提高酪氨酸酶的活性，促进黑素瘤细胞的增殖，产生更多的黑色素，从而达到乌黑头发。本发明采用中药复方，各味中药协同增效，与单味中药相比较，具有多系统、多靶点和多层次发挥全方位药效作用的特点，从根本上解决黑发变白的问题。