专利名称：包含聚合物基质和油相的免疫调节组合物的制作方法包含聚合物基质和油相的免疫调节组合物本发明涉及免疫调节组合物，例如疫苗接种组合物，以及制备和通过(例如)ロ服给药途径递送或给予这类组合物，特別是给到粘膜表面上的方法，以及其他主题内容。疫苗接种大部分通过注射进行。注射需要复杂和昂贵的物流基础。例如，通过注射对大量动物，例如牛、猪、禽类及鱼类进行疫苗接种或是不可能，或是极度耗费劳动力。如果可以将疫苗与饲料或水同时给予大量动物，特別是作为通常必须以一定间隔给予的重复剂量吋，将在时间和费用方面大有裨益。在エ厂到注射地点过程中，注射疫苗通常必须保持低温(保存和运输)。这种所谓的“冷链”是増加成本的另ー个物流因素。除因使用针头造成的感染和交叉污染风险外，通过注射进行疫苗接种也对接受人或接受动物造成不适或疼痛，优选其它给药途径。存在ロ服或经鼻给予的疫苗，透皮疫苗正在开发过程中。然而，出于各种原因，不是所有疫苗有ロ服给予、鼻内给予等形式，如果更多的疫苗可以通过注射以外的途径给予， 将是显著进步。现有的这些ロ服疫苗通常是活减毒或灭活的全細胞制剂，它们依赖感染物的某些元素通过接触GI道中或真皮下的粘膜或粘膜相关淋巴组织(MALT)的其它组分刺激免疫应答。然而，许多现代疫苗包括感染物的亚单位，即使注射吋，其本身可能也不具有足以引发所需免疫应答的免疫原性作用。将抗原和免疫刺激剂如佐剂配制在一起提高免疫原性作用，这种现象在所有注射疫苗中都出现。本领域熟知提高动物对疫苗抗原的免疫应答的佐剂体系。同样，将疫苗和药物递送至粘膜表面的体系也是本领域已知的。已记载有若干方法保护疫苗抗原和药物免于被胃酸和消化酶降解，并将抗原吸附于粘膜表面。但由于与将疫苗组分有效递送至粘膜表面和下方粘膜淋巴组织有关的遗留问题， 很少使用粘膜递送方式递送疫苗，这些问题与合并各种成分以便在适当部位以活性形式释放的制剂复杂性相关联。鉴于许多病原体通过粘膜表面侵入体内，ロ服递送产生粘膜免疫应答的疫苗仍然是非常想要实现的目标。实现疫苗的有效ロ服吸收的障碍包括它们通过肠道上皮细胞质膜的通透性低、对胃肠道(GIT)中肽酶和蛋白酶降解易感，和通过肝和胆从门循环中清除吸收组分。在蛋白质组分的情况下，在胃部酸性环境下易于变性也是ロ服递送的ー个障碍。ロ服给予疫苗成功引发潜在有益的免疫应答吋，抗原剂量常常非常高。产品成本高对经济性有不利影响。因此需要节约剂量的技木。通过包裹到纳米和微米颗粒剂型，例如聚丙交酯(PLA)，聚乙丙交酯共聚物 (PLGA)或脂质体基体系中和使用肠衣胶囊或片剂以保护大分子疫苗组分免受酸和酶攻击可针对酶降解和酸性攻击提供ー些保护。然而，因为递送系统造成进入和穿越肠道上皮细胞的吸收差，因此将疫苗包裹到颗粒如PLA、PLGA、脂质体或其它颗粒中可能不总是成功。更通常地，即使可将大量抗原和/或佐剂递送至合适靶点(例如M細胞和/或GIT中的派尔斑)，就有效性而言，它们也可能不是合适或优选的物理化学形式(例如适当或充分溶解)。现有技术中包裹和配制ロ服制剂抗原的例子如下。1994年10月4日授权的Bowersock等的美国专利号5，352，448描述了用于反刍动物的ロ服疫苗制剂，其在水凝胶基质中包含抗原，所述水凝胶基质保护抗原免于在瘤胃中降解。该基质由甲基丙烯酸和亚甲基双丙烯酰胺交联产生，交联过程在抗原抗原存在下进行，或交联后经再水化后用抗原浸渍。该基质优选通过下述方式造粒在3-5mm直径的圆柱中进行聚合，然后将所得的固体圆柱体切割成3-5mm厚的圆盘。过硫酸铵和亚硫酸氢钠是聚合引发剂的例子。1997年10月7日授权的Bowersock等的美国专利号5，674，495记载了用于ロ服给药的疫苗组合物，其中通过以下方法制备包含离散1-100 μ m微粒形式的藻酸盐凝胶将抗原和藻酸盐溶液喷洒到氯化钙溶液中以使液滴胶凝，或通过将氯化钙加入藻酸盐/抗原乳液中。具有与藻酸盐表面有反应性或亲和カ的官能团的聚合物可用于包被所述颗粒。聚赖氨酸是这种包衣聚合物的ー个例子。可通过以下方法配制该微粒将其分散到亲水运载体基质，如经典水凝胶或藻酸盐凝胶基质中产生运载体基质团块(藻酸盐运载体基质中的藻酸盐微粒)，尺寸范围是2至8mm。可包被所述团块，就好像包被微粒那样。本专利也记载了ー种变化形式，其中微粒由含疫苗的明胶制备，在这种情况下明胶微粒由具有非确定油的乳液固化(通过降低温度)产生。用聚-L-赖氨酸包衣使这些明胶颗粒稳定化。1996年3月19日授权的Andrianov等的美国专利号5，500, 161记载了通过以下方式制备的微粒将基本不溶于水的聚合物分散到水溶液中，所述水溶液中溶解、分散或悬浮有待递送物质(如抗原)，然后通过冲击力(如剪切凝聚)或化学凝聚方式(例如通过使用电解质、PH改变等)将该聚合物与所述物质凝聚，以形成球状和非球状微粒。虽然本专利所用术语“微粒”指大小范围是1-1000微米的固体颗粒，但最大示范性微粒的直径为20 微米。根据本专利，将1至10微米的微粒用于某些生物应用，如疫苗。2000年1月18日授权的See等的美国专利号6，015，576记载了含有抗原的冻干多层脂质体。该脂质体优选大于20nm且小于20 μ m，以保证被巨噬细胞充分加工。在为ロ 服给药包装成丸剂或胶囊(可具有肠衣)之前，冻干脂质体制剂。1998年9月22日授权的Tice等的美国专利号5，811，128记载用于将生物活性剂(特別是疫苗抗原)递送给动物的組合物，其必然涉及将有效量的药剂包裹在生物相容性赋形剂如聚(DL-乙丙交酯共聚物)中形成小于约10微米的微胶囊的步骤。它们通过将抗原水溶液分散到聚合物的ニ氯甲烷溶液中制备。然后，将该聚合物溶液加入聚(乙烯醇) 水溶液中形成水包油乳液，通过离心和冻干从其中收集微胶囊。利用插管针给予微胶囊的悬液。壳聚糖微粒也可用于ロ服疫苗。Van de LiAben等，J. Drug Target，2002记载 1. 7 μ m壳聚糖微粒，在离体人細胞模型中由M細胞运输。Li等，BMC Biotechnology (《BMC生物技术》),2008记载了用于递送疫苗的藻酸盐包衣的壳聚糖微粒(初始平均大小为300nm)。通过在白蛋白中孵育所述微粒(所得平均大小为404nm)，将抗原(牛血清白蛋白)加载到壳聚糖微粒上。然后，将若干滴加载抗原的微粒悬液加入藻酸钠溶液中，产生藻酸盐包被(加载抗原)的微粒，将其再次分散到氯化钙中，以便在微粒表面上与藻酸盐层交联(所得的平均尺寸1324nm)。提高药物和颗粒进入和穿越肠道上皮屏障的递送的ー种方式将颗粒制剂靶向肠道的接受部位。例如，Higgins等在Pharmaceutical Research(《药学研究》)第21卷 (2004)中使用糖蛋白UEA-I凝集素的小有机肽模拟物靶向M細胞。利用生物素化肽使这些模拟物吸附于加载有荧光素异硫氰酸酯的链霉亲和素聚苯乙烯颗粒，其直径为0. 289 μ m。 Roth-Walter等在Vaccine (《疫苗》)第23卷Q005)中使用1-3μπι大小的加载疫苗的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球，所述微球用α-L-岩藻糖特异性橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素(AAL)官能化的。这些文献(Higgins等和Roth-Walter等)通过引用全文纳入本文。如上所述的聚乙丙交酯共聚物(PLG)体系经测试有可能用于可注射和ロ服疫苗制剂，如Vajdy等，Immunology and Cell Biology (《免疫学和細胞生物学》)，第82卷 O004)所述，通过引用全文納入本文。该文献也记载将乳液用作注射疫苗佐剂的应用，井指出乳液组分的潜在毒性限制其应用，但佐剂如西龙公司/诺华公司(Chiron/Novartis)的 MF59(角鲨烯水包油乳液)和GSK的AS03(即角鲨烯(10. 68毫克)、DL_ α -生育酚(11.86 毫克)和聚山梨酯80 (4. 85毫克))已被注册为，例如，可注射流感疫苗的组分。參见例如， EMEA网站上有关ft·印randrix 的产品信息。可能需要的是能够使用乳液作为ロ服疫苗制剂的组分(或作为佐剂)。美国专利5961970 (Lowell等)记载了多个亚微米水包油液滴的乳液形式的疫苗佐剂组合物，所述液滴的粒度范围是约30nm至500nm，用于使固有地或附帯地掺入液滴的抗原免疫原性增强。为了实现粘膜免疫，该乳液还可包含粘膜粘附性大分子。选择ロ服给药途径时，为了利于肠道摄取，可将该乳液包裹到明胶胶囊中或包肠衣，以防止其接触胃液。 而且，该乳液可在包裹前冻干，以提高抗原稳定性。所述乳液颗粒具有包含脂质或脂类组合物(如MCT)的疏水芯，并用两亲和/或非离子型表面活性剂稳定化，该表面活性剂可以是天然的生物相容性表面活性剂如磷脂(如卵磷脂)或药学上可接受的非天然表面活性剂如吐温-80。该表面活性剂有利于将颗粒維持在所需的大小范围，并防止其聚集。美国专利申请2001/0043949 (Delgado等)记载了包含生物可降解的合成聚合物颗粒、抗原和在微粒表面上形成包衣的肠溶聚合物的微粒组合物。ロ服疫苗应优选为固体或基本为固体，以利于加工和储存，提高稳定性(特別是抗原稳定性)并避免对冷链操作的需要-液体的稳定性一般低于固体，而且与固体剂疫苗相比液体需要更精细的填装和防泄漏操作(在容器、小瓶、注射器等中)。PCT 申请 W0/2008/122967(希格默德药业有限公司)(Sigmoid Pharma Limited) 描述了ー种口腔組合物，其包含具有液体、半固体或固体芯的微胶囊，并且其中图2为半固体-或固体填充微胶囊/微球的示意图，其中活性成分经增溶或呈混悬液形式，且具有控释聚合物包衣。实施例20描述了将水溶液与由角鲨烯(天然不饱和烃)、吉尔涩 44/14 (Gelucire 44/14)和拉普菲 MS 1944CS (Labrafil MS 1944CS)构成的油剂混合而制成的挤出乳液药物混悬液的小珠。水溶性活性成分胼苯哒嗪在水相中，并且油相为制剂的 1. 12干重％。例如，Garmise等，AAP Pharn^ciTech，第7卷Q006)记载了用于鼻内递送的干粉疫苗。也存在用于ロ服递送的固体剂疫苗，但较为罕见，主要例子是用传统技术以热灭活霍乱弧菌(V. cholera)全細胞制成的霍乱疫苗片剂。如果需要将表面活性剂掺入乳液的微胶囊或微球制剂，会产生特定的挑战。在制造过程中需要表面张カ来形成和保持胶囊会阻碍或限制表面活性剂的使用，因为表面活性剂引起的表面张カ的下降可破坏胶囊的完整性或导致更一体化的剂型，该剂型中需要例如外壳或胶囊层。因此，可能难以用表面活性剂配制液体、乳化或预先溶解的活性物质。可能需要ロ服给予后疫苗组合物在结肠中释放活性物质(如抗原和佐剂)。这种结肠特异性递送系统必须防止在GIT上部释放活性物质，而在到达结肠时释放它们。在药学递送领域，有许多配制方法，包括依赖PH和时间的聚合物介导的技木。然而，虽然小肠与结肠之间的PH变化得到了充分证实，但差异可能很小并且可能在个体之间有所不同。这可使得PH依赖性系统在获取可预测的药物释放分布方面不可靠。时间依赖性系统取决于递送系统在GIT中的通过时间。这些系统的主要限制因素是小肠通过时间的体内变化可导致活性物质在小肠(过早)释放或在结肠的末端部(过迟)释放。此类ロ服药物递送系统的个别接受者的病理生理状态还对这些时间依赖性系统的性能具有显著的影响-患有过敏性肠综合征和炎性肠疾病(包括克隆氏病和溃疡性结肠炎)的患者加速通过结肠。与这些考虑因素无关，进入小肠(幽门)的位点处的剂型尺寸可对GI通过时间和/或反应差异性具有显著的影响。肠粘膜免疫网络已经演化出对来自食物来源和共生菌的大量抗原抗原維持相对无反应性或耐受性(或“ ロ服耐受性”)的能力。根据Friedman等，PNAS USA 1994 ；91 6688-92，ロ服耐受性是通过产生活性細胞抑制或克隆无反应性介导的，决定因素是抗原ロ 服剂量。ロ服耐受性为剂量特异性，提高剂量会导致耐受性消失，參见Nagler-Anderson 等，PNAS USA 1986;83:7443-6。给予低剂量抗原有利于诱导活性細胞调控，參见Chen等，1994Science ;265 :1237-1240。较高剂量有利于诱导克隆无反应性或缺失，參见Chen等，1995Nature ;376 :177-180。在ー项具体研究中，将高剂量的髓磷脂碱性蛋白(MBP)给予其T細胞携帯MBP特异性T细胞受体(TCR)的小鼠导致T细胞活化和受体下调(Benson 等，2000J Clin Invest, 106 :1031-1038) 0此外，可通过给予免疫佐剂如脂多糖或霍乱毒素亚基B提高ロ服耐受性，这似乎能刺激其它细胞群下调免疫应答(Khoury等，J Exp Med 1992 ；176 :1355-64)。已证明，ロ服耐受性能预防或治疗各种T-細胞介导的自身免疫病。例如，在包括 30位多发性硬化症患者的双盲预试验中，ロ服给予牛髓磷脂抗原能降低与髓磷脂碱性蛋白发生翻译的T細胞的数量，且检测不到毒性(Werner等，Science 1993 ；259 :1321-4)。 Trentham等通过向60位严重急性类风湿性关节炎患者给予II型胶原证明ロ服耐受性的临床功效CTrentham等，Science 1993 ；261 :1727-30)。据报道，在三硝基苯磺酸(TNBS) 的Thl介导的结肠炎动物模型中，给予用TNBS半抗原化的结肠提取物能防止发生粘膜炎症 (Neurath等，J Exp Med 1996;183:2605-16)。在评估给予自体结肠蛋白提取物以治疗中度至重度克罗恩氏病的安全性和有效性的I期研究中，Margalit等证明在7/10个对象中显示出安全并诱导缓解(Am J Gastroenterol 2006 ;101)。其它动物疾病模型，包括中风、 阿耳茨海默病和动脉粥样硬化以及1型糖尿病，已对粘膜给予的抗原产生反应。在从抗原首次遇到内脏相关性淋巴组织(GALT)开始的ロ服耐受期间诱导或抑制各种反应，所述内脏相关性淋巴组织是由淋巴结(派尔斑)、上皮绒毛、上皮内淋巴細胞和 GIT固有层中散在的其它淋巴细胞构成的良好发育的免疫网络。更一般地，固有层是内衬于体内各种管道(如呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道)的湿村里(粘膜)的组件。因此，固有层(更正确的说法是固有层粘膜)是ー薄层疏松结缔组织，其位于上皮以下，与上皮一起构成粘膜。小肠和淋巴组织中的固有层含有毛細血管和中央乳糜管(淋巴管)。固有层还含有具有开ロ于粘膜上皮管道的腺体，其分泌粘液和浆液状分泌物。抗原可在GALT水平直接作用，或者可在吸收后发挥作用。ロ服耐受性和粘膜免疫构成涉及GALT中抗原递呈細胞与T細胞的相互作用的免疫连续覆盖(continuum)的一部分。可区別GI道的不同部分。直肠/结肠是免疫诱导(有序淋巴组织)和效应物位点 (弥散固有层)的混合体，而空肠几乎不含免疫诱导位点。这反映在各组织的淋巴組成中 空肠主要含有记忆⑶4+T細胞，而结肠含有较大比例的幼稚⑶4+T細胞(Veazey和Lackner， 2006 ；PLoS Medicine ；3 :12-2188-9)。在急性HIV感染中，在感染数天内发生快速而深入的⑶4+CCR5+T细胞损失，而主要携帯幼稚⑶4+T細胞的外周淋巴组织如血液和淋巴结受到的影响较小(Brenchley等，2004 J Exp Med 200 :749-759)。Mehandru等研究了获自近期感染HIV的患者以及未感染志愿者的肠道和外周血的淋巴細胞群，显示感染HIV后尽早开始高活性抗逆转录病毒治疗(ART) 的大部分患者仍然不能获得完全回复到基线水平的肠道CD4+T細胞，无论该治疗持续多长时间。相反，HIV感染导致肠道免疫系统的连续激活状态，但在外周淋巴组织中未反映这种现象(Mehandru等，2006 ;PLoS Med 3(12) :e484)。Mehandru等的数据提供证据证明接受 ART的患者出现肠道炎症和连续感染、⑶4+T細胞的破坏和周转。这提示，肠道组织分布更好的药物，以及可能降低或防止粘膜组织中免疫激活的机制可能更有效地对抗HIV感染。已经研究了许多结肠靶向递送系统。这些系统包括肠压控制型结肠递送胶囊， 其依赖于发生在结肠中而非胃和小肠中的蠕动波；PH敏感聚合物包衣(在上GIT中保持完整)与多糖包衣的組合，其仅可通过存在于结肠中的細菌降解；果胶和半乳甘露聚糖包衣， 其通过结肠細菌降解；以及偶氮水凝胶，其通过结肠细菌产生的偶氮还原酶逐渐降解。前Yang φ, International Journal of Pharmaceutics 235(2002) 1-15, 全文以引用方式并入本文中。基于多糖的递送系统特别值得关注-參见例如Kosaraju， Critical Reviews in Food Science and Nutrition，45 :251-258 (2005)，其全文以引用方式并入本文中。然而，对于仅依赖于结肠中特定酶活性的系统而言，由于结肠菌丛中的病理紊乱(例如由PH变化和细菌酶的量/活性的变化所导致)，病情可再次引起药物释放分布的差异性。许多疫苗的成功常常需要多次免疫。在儿科群体中，可能需要多达五次免疫，对于白喉、破伤风和百日咳(DTP)疫苗也是如此，在出生后前六个月期间给予三次，然后在两岁时给予第四剂，在四岁和六岁之间给予最后一次加强剂量。然而，某些疫苗需要额外的加强免疫，即使在已经接受过完整免疫方案的成年人中，例如，破伤风-白喉(Td)疫苗推荐人终生每10年加强免疫一次。“初免-加強”原则适用于活减毒疫苗(如ロ服脊髄灰质炎疫苗)、灭活疫苗(如甲型肝炎疫苗)、重组蛋白质亚基疫苗(如乙型肝炎疫苗)和多糖疫苗 (如乙型流感嗜血杆菌疫苗)。在这些疫苗中，初免-加强是‘均质的’，因为后续加强免疫中使用的疫苗与早先初免中给予的相同。更详细的讨论參见Curr Opin Immunol. 2009年 6月；21 (3) :346-51. 2009年6月6日电子公开，通过引用全文納入本文。在过去十年中，研究显示初免-加强免疫可通过不匹配的疫苗递送方法而使用相同抗原给予，形成‘异质’初免-加强形式。最有趣和出乎意料的发现是，在许多情况下，异质初免-加强方法比‘均质’初免-加强方法更有效。新型疫苗接种方法，如DNA疫苗和病毒载体基疫苗的快速进展明确地进一步扩展了异质初免-加强免疫接种方法的范围，常用的异质初免-加强免疫接种方法包括DNA初免，后接重组蛋白、灭活疫苗、病毒载体和BCG 的加强免疫；病毒载体初免，后接重组蛋白的加强免疫；和BCG初免，后接病毒载体的加强免疫。已知有效的B細胞介导的免疫和抗体应答常常需要来自CD4+T細胞的帮助。人们认为，独特的称为T滤泡辅助(Tfh)細胞的⑶4+效应物T细胞亚组能够提供这种帮助。根据Johnston等在2009年7月16日于Science在线公开的工作(DOI :10. 1126/ science. 1175870)(通过引用全文纳入本文)，在⑶4+T细胞中表达转录因子Bcl6是小鼠体内 Η分化和T细胞帮助B細胞的充分必要条件。这些研究也说明，相对而言，作为Bcl6 拮抗剂的转录因子Blimp-I抑制Tfh分化和帮助，从而防止B細胞生发中心和抗体应答。因此，体内需要Tfh細胞进行适当的B细胞应答，并且在Tfh分化中Bcl6和Blimp-I起到核心而相反的作用。
本发明提供ー种包含小油滴分散在其中的水溶性聚合物基质的组合物，所述组合物包含用于免疫调节，如疫苗接种的活性成分。所述活性成分是免疫调节剂，在许多实施方式中包含或者是佐剂和/或抗原。该组合物可包含多种活性成分。本发明包括其中活性成分包含在至少ー些小油滴中的实施例以及其中小油滴不含活性成分的实施例。小油滴随着包含其的基质溶解于水性介质中而释放。在一个实施例中，小油滴基本上固定在基质中或通过基质固定，并且该固定结构随着基质溶解于水性介质中而丧失。在某些实施例中，油滴可统称为本发明組合物的油相。例如，该组合物可用于ロ服给予。如本说明书下文所述，所述油滴(油相)可由単一液体油相构成或者是油包水乳液。在任ー情况下，认为(不受理论限制)油滴的外部油性介质与组合物的水相(基质相) 形成界面；外部油性介质任选含有内部水相以至于所述油滴包含油包水乳液，或不存在这种内部水相以至于所述油滴具有単一液体油相。该组合物可以是微珠形式。所述微珠的直径可以是0. 5mm至5mm，例如0. 5mm至 2.5mm。本发明包括微珠群(例如10个或更多个微珠，任选至少100个或更多个微珠)，其主要由本发明微珠构成或包含本发明微珠。本发明包括含有多个微珠的产品，例如，所含微珠都是本发明微珠；这种产品可能是剂量产品，例如是胶囊、栓剂、阴道栓剂、药囊或片剂。在优选实施方式中，本发明组合物包含至少ー种抗原和至少ー种佐剂，见下文详3dio在另ー实施方式中，本发明提供递送免疫接种所用活性物质的载体，该活性物质可以是任何类型，具体是抗原、抗原性物质或佐剂，或其組合。具体说，本发明提供肠/结肠粘膜疫苗组合物和/或免疫治疗剂。因此，本发明组合物也包括，例如疫苗组合物或免疫治疗剂，以便将免疫调节剂递送至肠道粘膜和/或结肠粘膜。本发明还提供用于产生和/或诱导ロ服耐受性的本文所述组合物。本发明还提供多种免疫介导的方法，包括预防疾病、延缓疾病进展和/或治疗疾病的方法。这种方式和方法也允许与非免疫介导方法联合使用，例如与非免疫介导治疗剂， 如药物小分子或药物大分子的释放(特別是控释)联用，任选用于沿整个肠道和结肠/直肠或其中预定部位递送。因此，所述非免疫介导药物可以是“小分子”或“生物剤”。在中，所述疾病是HIV/AIDS，但本发明不限于此，也考虑到许多其它疾病，例如本文其它地方所述。例如，在HIV/AIDS的情况下，本发明允许将这类免疫介导的方式和方法与ART (杭-逆转录病毒治疗剂)沿整个肠道和结肠/直肠或其中预定部位的释放(尤其是控释)联合使用。因此，在一个实施方式中，本发明提供ART/免疫系统调节方法的联用。本发明还涉及治疗病症、预防病症或延缓病症进展，所述病症是感染物直接或间接加重或引起的，特別是胃肠道病症，例如本文其它地方所述的ー种或多种病症，其包括将本发明组合物，特别是疫苗组合物给予动物，例如通过ロ服途径。本发明还提供防止或减少产生针对其它免疫原性药物例如生物剂，如肽或蛋白质治疗剂和抗体的抗体的方式，例如，使患者在接受治疗剂量的相关药物之前耐受该药物。溶出度可影响组合物的物理形式和特征的程度取决于该組合物的初始形状、大小和构成。该组合物具有包衣吋，可调整溶出的速率和方式(见下)和/或可通过相对于HPMC 衍生物包含下文所述的延缓剂/保护剂进行调整。在一方面，可将本发明描述为干燥水包油(o/w)乳液，该乳液的一个实施方式是非粉末状的。另ー种实施方式是例如以珠形式，特別是微珠形式模制和/或成形和/或挤出。本发明的組合物在模制或成形形式(如微珠)中通常包含多个油滴或小油滴。在另ー实施方式中，该组合物包含包被有聚合物以改变其释放特性的珠，例如微珠。因此，本发明组合物可以是无包衣珠或包衣珠，例如包有聚合物的珠的形式；该珠可以是微珠。在相关实施方式中，本发明提供一种疫苗組合物或免疫治疗组合物，其包含多种任选包衣的水溶性聚合物基质的微珠。在ー个
中，本发明提供一种组合物，其包含多个干燥的水包油乳液的微珠。在本文所述的所有微珠组合物中，本发明包括单个珠，另一方面也包括一群珠。在包含一群珠的疫苗組合物和包含一群珠的免疫治疗组合物的情况下，所述微珠中至少一部分可包含免疫调节活性成分，即免疫调节剂；所述微珠可包含単一活性成分或活性成分的組合，前提是它们包含免疫调节剂，特别是抗原或半抗原。因此，本发明包括组合物，其中第一群微珠包含免疫调节剂，或作为所述第一群中所含的単独活性成分或作为所述第一群中所含的活性成分組合，和不同于第一群的第二群微珠包含可能与所述第一群的活性成分或活性成分組合相同或不同的活性成分(単独活性成分或活性成分的組合)； 所述第二群可包含作为免疫调节剂或可不含免疫调节剂的活性成分。在一些实施方式中， 存在包含活性成分的至少一群微珠(例如包含活性成分的一群、两群或三群，前提是所述組合物中存在至少ー种免疫调节剂)和不含活性成分的至少一群微珠。在相关实施方式中，本发明的組合物可包含多个微球或微珠群体。在不同群体之间，活性成分可能相同或不同，存在超过ー种活性成分或超过ー类活性成分吋，不同群体之间的每种活性成分或每种类型可能相同或不同。在ー个特定实施方式中，将ー种或多种免疫调节活性成分掺入组合物的油相或干燥乳液中。在另ー实施方式中，将ー种或多种免疫调节活性成分掺入组合物的水相或干燥乳液中。在相关实施方式中，将所述ー种或多种活性成分掺入油相和水相中。这些段落提及的实施方式的一些亚类还掺有非免疫调节活性成分。本发明组合物中特別吸引人的是低水溶性免疫调节活性成分，具体是疫苗活性成分和/或脂溶性化合物(活性成分)，其掺入油相带来特定的优点。因此在一方面，本发明涉及将免疫调节活性成分，具体是疫苗活性成分调配成干燥水包油乳液微珠以供ロ服施用，在所述微珠中，活性成分可掺入乳液的油相中并且珠子可任选地用聚合物包衣。水溶性固定聚合物基质(或在一方面，干燥乳液的水相)在一个实施方式中包含交联水溶性聚合物(例如源自流体水性连续相的化学或物理化学(例如干燥)固化)，使得在基质或干燥乳液中，水基本上不存在并且使小油滴固定。在此实施方式中，干燥水相可因此称为固定基质。存在或不存在聚合物包衣吋，本发明组合物可包含在接触胃液时保护免疫调节活性成分，具体是疫苗活性成分的组分。例如，这类组分可以防止该组合物在胃中崩解或溶出，并且只有在到达小肠时才发生这种崩解或溶出。该实施方式中的优选组分是只有在某 PH以上才是水溶性或基本可溶于水的聚合物，如下文中详述的羟丙基甲基纤维素(HPMC) 衍生物。与该实施方式相关的任选额外组分是組合物中包含某化合物以将PH維持在所述阈值以上。例如，这种包含可能因本发明组合物在生产过程中包含碱性或碱化合物以及具有PH依赖性溶解度的聚合物所致。在其它实施方式中，例如，在低于溶出阈值的pH下充分分散。在相关实施方式中，可包含某些物质将PH維持在溶出阈值以下，以便减缓溶出。因此，在一个实施方式中，本发明提供保护ー种或多种活性成分，如蛋白质或肽免遭降解，或使其稳定和/或将这类活性成分递送至结肠的組合物。术语“干燥乳液”通常指内部(不连续)相固定于基本呈固态或固化的外部相形成的乳液。固体外相与水性介质接触时溶解。术语“基质”是本领域中熟知的术语，并且根据上下文通常是指固体、半固体、不溶解的或未溶解的材料，该材料可对组合物提供结构和空间。在一些语境中，术语“基质”可指支架。可通过包括化学方式(例如通过交联)或物理方式(例如通过冷却或加热)在内的各种方式使外相固化。使用术语“干燥”，并非旨在暗示干燥步骤对于产生干燥乳液必不可少(但不排除这种情況)，而是指固体或固化水性外相基本上不含水或不含可用水。在这方面，即使在某些实施方式中水基本上不存在于本发明的組合物中(或截留在組合物的基质内)，特别是其呈微珠形式吋，本文中仍然采用术语“水相”来表示本发明组合物的外(连续)相。然而，本发明组合物的外相是水溶性的并且溶于水性介质。在一个实施方式中，小油滴在水相溶解或接触水性介质时释放。与小油滴有关的术语“释放”是指可自由移动、流出、接合、溶解、(再)乳化等，但实际的移动、流出、接合、溶解、(再)乳化并非所需，即，可能不会出现并且实际上受到以下因素的约束例如存在包衣。
在一个实施方式中，该组合物包含ー种或多种表面活性剤，其优选包含或选自下文详述的非离子型表面活性剤。本发明的另一方面是任选聚合物包衣的組成。例如，添加在结肠中出现的细菌酶存在下降解的聚合物(和/或促进包衣中形成孔的聚合物-“成孔剂”)与非PH依赖性聚合物会导致活性形式的疫苗组分在结肠或GI道的其他预定部位基本上可被利用。在ー个
中，可通过细菌酶降解的上述聚合物为水溶性聚合物。在本发明的一个实施方式中，干燥的乳液形成有效俘获或包裹疫苗抗原的基质或网状结构。在一个实施方式中，本发明提供一种组合物，所述组合物包含具有水溶性聚合物基质材料的固相和分散于该固相中的油相。在一个实施方式中，本发明组合物还包含一种或多种药剂，以促进疫苗抗原吸附于粘膜表面和/或下方的粘膜淋巴组织、M細胞、派尔斑或其他免疫相关细胞或細胞系统， 或被它们吸收。吸收增强剂可能如现有技术中所述，例如Swenson，ES和Curatolo，WJ Means to Enhance Penetration(2)Intestinal permeability enhancement for proteins, peptides and other polar drugs-mechanisms and potential toxicity (1 .透白勺方式⑵蛋白质、肽和其它极性药物的肠道渗透增强机制和潜在毒性).Advanced Drug Delivery Reviews. 1992. 8 :39_92，通过引用将其全文纳入本文。这类物质的ー个例子是卵磷脂。这类物质的其它例子是凝集素Opson MA等，Advanced Drug Delivery Reviews, 劣 5り卷 http://www. sciencedirect. com/science : op = PublicationURL& tockey =% 23T0C% 234953% 232004% 23999439995% 23480534% 23FLA % 23& cdi = 4953& pubType = J&view = c& auth = y& acct = C000050221& version = 1& urlVersion = 0& userid = 10&md5 = 7e6841a71af41249f786a92670a86233,第 4 期，2004 年 3 月 3 日， 第 511-525 页)。也參见 Davis IC 等，The immunopathology of M cells(M 细胞的免疫病理学)，Springer Seminars in Immunopathologバ施普林格免疫病理学研讨会)第 18 ぜ http//www, sciencedirect. com/science ？ ob = PublicationURL& tockey = % 23T0C% 234953% 232004% 23999439995% 23480534% 23FLA% 23& cdi = 4953& pubType =J&view = c& auth = y& acct = C000050221& version = 1& urlVersion = 0& userid =10&md5 = 7e6841a71af41249f786a92670a86233，第 4 期，421-448。本发明的疫苗组合物使得可能通过粘膜表面进行免疫接种，例如口腔、内脏、鼻腔、直肠或阴道表面。在直肠给药中，所述疫苗組合物可以是栓剂形式。在阴道给药中，所述疫苗組合物可以是阴道栓剂形式，例如是生物可降解的环形式。在ロ服给药中，所述疫苗組合物可以是药丸或药片的形式(如模制或包含多个微珠)。该组合物也可以是糊剂形式或是流体形式，可采用滴药器或无针注射器给予。本发明疫苗組合物也可以是通过食品和 /或水(或饮料)以及给予固体剂的方式进行免疫接种的方法。 本发明組合物可用于给予人对象。 在某些实施方式中，本发明组合物适合将疫苗给予动物，例如人或选自下组的动物牛、猪、禽类和鱼类。疫苗可作为饲料或饮料的一部分给予这些动物，或引入鱼类繁殖、 进食或居住的水域。可将本发明組合物制成动物、禽类或鱼类饲料的形状，和/或使其含有引诱物，如闪光、气味和/或口味。
本发明还提供在患有本文其它地方所述的ー种或多种疾病的动物，如鱼类或人或其它哺乳动物中进行免疫接种或诱导免疫应答的方法，包括给予所述动物本发明组合物。 给予人时可由患者自己进行、由健康护理工作人员进行给予，或间接地，给予动物吋，通过加入食物或饮用水中进行给予。本发明也考虑非哺乳动物包括鱼类或其它水生生命形式的疫苗或免疫接种。本发明的組合物可调配成胶囊、栓剂、阴道栓剂或可用于体外设备或其他健康相关的例如医疗设备或其他设备。本发明还提供制备免疫调节(如疫苗)組合物的方法，包括混合水溶性聚合物基质的水溶液与油基液体以形成油包水乳液，然后使所得悬液固化成ー个或多个成形元件， 例如珠。活性成分可能最初以油相或液体相或两者兼有的形式存在。在此实施方式中，所述方法优选包括在乳液形成之前向油相中加入ー种或多种免疫调节剂，特别是抗原和/或佐剂。在相关实施方式中，所述方法优选包括在乳液形成之前向水相中加入ー种或多种免疫调节剂，特别是抗原和/或佐剂。在另ー相关实施方式中，可在乳液形成之前将相同或不同的免疫调节剂，具体是抗原和/或佐剂添加到油相或水相或二者中。本发明提供一种疫苗递送组合物，其将疫苗吸附于哺乳动物的粘膜表面，和任选地，疫苗组合物的ー些或全部组分吸收后，使疫苗与粘膜相关淋巴组织(MALT)相接触。本发明还提供在给予后导致或实现将疫苗活性成分递呈于哺乳动物的粘膜表面，如MALT的疫苗组合物。本发明的一个实施方式涉及ロ服给予对抗内脏病原体的疫苗，包括将疫苗递呈或递送到内脏相关淋巴组织(GALT)。本发明的一个实施方式涉及ロ服给予对抗上呼吸道病原体的疫苗，包括将疫苗递呈或递送到口腔或鼻腔中的粘膜相关淋巴组织。在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和“含有”及其变型是指“包括但不限干”，并且其并不旨在(以及不)排除其他部分、添加剤、组分、整数或步骤。在本申请的说明书和权利要求书中，除非另有说明，単数形式也包括复数含义。具体说，使用不定冠词时， 应理解为考虑到复数和単数含义，除非另有说明。应理解，除出现不相容的情况以外，在本发明的特定方面、实施方式或实施例中描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团也可应用于本文所述的任何其它方面、实施方式或实施例。本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征和/或如此公开的任何方法或エ艺步骤可以任何方式組合，除了其中至少ー些此类特征和/或步骤相互排斥的組合。本发明不限于任何上述实施方式的细节。本发明延伸至本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任一新型組合或任何新型組合，或者延伸至如此公开的任何方法或エ艺的步骤的任一新型組合或任何新型組合。读者应注意，与本申请相关的与本说明书同时或之前提交的并且与本说明书一起向公众查阅开放的所有论文和文献，以及所有这些论文和文献的内容均以引用的方式并入本文。至少在多个实施方式中，本发明改善或解决了现有技术中的ー个或多个缺点。具体而言，本发明包括能解决现有技术中的多个问题的制剂或组合物。在本发明的各个实施方式中，在回顾现有技术时述及的某些组分或特征也可包含在本发明组合物中。附图简要说明下面參照附图进一歩描述本发明的实施方式，其中

图1是用图例中标为“LEDDS”的本发明微珠组合物和对比溶液ロ服免疫的BALB/ c小鼠的单独终点IgG效价图，如实施例7所述；图2是用图例中标为“LEDDS”的本发明微珠组合物和对比溶液ロ服免疫的BALB/ c小鼠的平均终点IgG效价图，如实施例8所述；图3是用本发明微珠组合物和对比溶液ロ服免疫的BALB/c小鼠的平均终点IgG 效价图，如实施例8所述；图4是用本发明微珠组合物和对比溶液ロ服免疫的BALB/c小鼠的单独终点IgG 效价图，如实施例8所述；图5是进行肠袢实验的小鼠的消化道照片；图6是进行肠袢实验的小鼠的大肠照片；和图7是包衣微珠的X射线断层分析图，该微珠是通过包括通过任选振动喷嘴喷射乳液的方法制备的。发明详述本发明一方面涉及包含免疫调节剂，具体是免疫刺激剤，例如抗原或半抗原的组合物。该组合物适合通过注射以外的途径给予，至少在通过这种非注射途径给予人体或动物体吋，通常诱导针对免疫调节剂的免疫应答强于单独给予该免疫调节剂(如抗原或半抗原)吋。本发明还涉及包含抗原或抗原群体或抗原组合以及一种或多种下述佐剂的疫苗。 马上可以看出，本发明还涉及制备和使用上述免疫调节组合物的方法。本发明范围内包括ー种包含小油滴分散在其中的水溶性聚合物基质的药物組合物，所述组合物包含活性成分。该组合物可记载为包含水溶性聚合物基质和油相，其形式为油滴分散于基质中，所述组合物包含活性成分。该活性成分是免疫调节剂，可以是抗原或佐剂。所述组合物中包含ー种以上的活性成分。在本发明的一个实施方式中，该组合物中同时包含抗原和佐剂，任选包含ー种以上抗原和/或ー种以上佐剂。因此，本发明范围内包括 (i)含有其中分散有油滴的水溶性聚合物基质的药物組合物，该组合物包含至少ー种免疫调节活性成分，该活性成分选自佐剂、抗原或其組合，和(ii)含有水溶性聚合物基质和油相的药物组合物，其形式是油滴分散于基质中，所述组合物包含至少ー种免疫调节活性成分，所述活性成分选自佐剂、抗原或其組合。所述油相(即至少一部分油滴)可包含活性成分。活性成分和其它组分在基质和油相之间的分配未知。虽然已知在制备组合物的过程中将组分掺入哪ー相(油相或将来的基质相)，但不知道在最终组合物中该组分会以何种程度改变该相(如果改变的话)。然而，由于在制备过程中将亲油物质添加到油相中，将亲水物质添加到水相(将来的基质)中，认为在固化組合物中各组分的至少一部分，有可能全部保持在其初始相中。本发明包括包含ー种或多种表面活性剂的组合物，所述表面活性剂任选选自非离子型表面活性剤。在某些实施方式中，考虑到ー种或多种表面活性剂的至少一部分，任选该組合物的全部表面活性剂含量都在油滴中。(本领域技术人员应理解，当組合物的全部表面活性剂含量在油滴中时，痕量的表面活性剂可进入基质，阅读该说明书应结合实际，应理解痕量的任何组分可能从组合物的某相进入另一相中)。在整个公开范围中，本发明包括在基质上具有一种或多种包衣的組合物；在某些实施方式周国年，该组合物具有聚合物包衣(例如単一包衣或两种包衣)。聚合物包衣可用于调节，例如控制活性成分的释放，并且在(例如)结肠细菌酶存在下可降解，或可具有肠衣(这两种类型的包衣可能同时存在)。組合物可包括含有成孔剂的包衣。如本领域所知，成孔剂促进在所需释放部位包衣上形成孔洞。接触释放部位的GI道流体吋，成孔剂通常可溶。在某些实施方式中，組合物具有包含不依赖PH的聚合物和成孔剂的包衣；例如，所述成孔剂可促进在结肠中形成孔洞。組合物可具有包含在结肠中有效的成孔剂的包衣和可在结肠中降解的包衣。本发明组合物可包含ー种或多种药剂，以促进疫苗抗原吸附于粘膜表面和/或下方的粘膜淋巴组织、M細胞、派尔斑或其他免疫相关细胞或細胞系统，或被它们吸收。所用物质是本领域技术人员已知的。这类物质的例子是卵磷脂和凝集素。本发明組合物可能适合ロ服给予。可调整本发明組合物，使其适合口服给予，任选排除任何其它给药途径。在一个实施方式中，调整该組合物，使其适合口服给予并在肠道中释放油滴。例如，这种组合物的基质中可包含肠溶性聚合物。本发明包括本文所述的组合物，其具有包衣(如単一包衣或两种包衣)以便控释或靶向释放油滴。在一类实施方式中，所述组合物包含肠溶性聚合物例如HPMCjn HPMCP。一类组合物包含水溶性基质和油相，其形式是油滴分散在基质中，所述油相包含抗原和佐剂，且所述组合物包含肠溶物质以保护所述抗原和佐剂免遭胃肠道的蛋白质水解作用。肠溶材料可形成外包衣或包含在外包衣中，或者可包含在基质中或油相中，或者可以位于这些位置中两种或三种的组合中(例如，形成外包衣或包含在外包衣中并且包含在油相中)。在一些实施方式中，所述肠溶材料形成外包衣或包含在外包衣中，并且不出现在基质和油相中。如前所述，本发明组合物，包括前两段提及的組合物，可以采取微珠形式，该微珠的直径可以是，例如，0. 5mm至5mm，例如0. 5mm至2. 5mm。因此，本发明包括微珠形式的组合物，其中所述油滴构成油相且所述油相包含抗原和佐剂，所述微珠任选还包含肠溶材料以保护所述抗原和佐剂免遭胃肠道蛋白质水解作用，这种肠溶性微珠适合口服给予。在ー些实施方式中，肠溶材料形成外包衣或包含在外包衣中，或者包含在基质和/或油相中。在其它实施方式中，所述肠溶材料形成外包衣或包含在外包衣中，且所述組合物不含碱；本说明书包括基质中不含碱的组合物。本发明也包括不含碱，例如基质(水相)中不含碱的組合物。本发明的全部范围包括油相包含ー种或多种表面活性剂的实施方式，所述表面活性剂任选选自或包含非离子型表面活性剤。如实施例所述，本发明包括具有免疫原性且在ロ服给予时能有效提供对抗毒性抗原刺激的保护作用的組合物。尚不了解本发明组合物的哪些特征导致实现这种免疫原性作用，但不受理论限制地认为，以液滴形式表现油相可能是ー个因素。在这个方面，数据提示液滴较小和免疫刺激作用提高之间可能有联系。也已观察到，将抗原(卵清蛋白)掺入不含油或佐剂的水溶性基质珠中无效，即仅仅保护抗原不足以获得免疫刺激效果。
可获得的数据提示，在油相包含抗原和佐剂的组合物中，以液滴形式表现油相和油相中包含抗原可促进免疫刺激效果，据推测是将抗原以小油滴形式递呈给躯体。在该实施方式中佐剂也包含在油滴中，可用于将免疫原性提高到更好水平，因而优选。关于该段提出的理论，提醒读者对本发明的解释不受理论限制。在本发明的另一方面，提供包含第一群微珠和第二群微珠的产品，所述第一群微珠包含其中分散有油滴的水溶性聚合物基质，所述第二群微珠包含其中分散有油滴的水溶性聚合物基质，所述第一和第二群微珠不同，且至少第一群微珠是本发明微珠。这两群微珠可能由本发明微珠组成，且活性成分和/或赋形剂不同(例如，释放调节聚合物的存在、不存在、含量、位置和/或种类)。该产品可以是药物制剂，例如是胶囊、片剂、栓剂或阴道栓剂，或者是糊剂或流体。本发明一方面涉及包含分散有油滴的水溶性聚合物的液体水性外相在通过(例如)交联、冷却或加热引起或允许所述水相发生固化，从而制备本发明組合物中的应用。本发明还提供一种制备免疫调节(如疫苗)組合物的方法，所述方法包括将水溶性聚合物的水溶液与油基液体混合形成油包水乳液，所述水溶液和油基液体的至少ー种中包含抗原或佐剂或其組合，然后引起或允许所得悬液固化成一个或多个珠或其他成形元件。所述制备方法所用的油基液体可包含抗原或佐剂或其組合；在一个实施方式中其包含其組合。在该方法的某些实施方式中，所述水性溶液不含抗原或佐剂或其組合。在所述方法的其它实施方式中，所述水性溶液包含佐剂(在这种情况下油基液体可能不含佐剂或者可能含有佐剂)。本发明包括水性溶液包含抗原的方法的实施方式(在这种情况下所述油基液体可能不含抗原或者可能含有抗原)。所述方法还可包括包被珠或其它成形元件，例如用本文所述包衣材料，例如用肠溶衣和/或其它聚合物包衣包被。在ー类方法中，所述成形元件是具有本文所述直径，例如 0. 5mm至2. 5mm的珠。在一个实施方式中，所述方法还包括将成形元件加工成胶囊、片剂、栓剂、阴道栓剂或其它给药剂型。本文其它地方所述的本发明组合物的所有实施方式和特征可适用于上述制备过程及其产物。一个实施方式排除申请人的申请号PCT/EP2010/056838的实施例51-53的主题内容。因此，在本发明的任选实施方式中，所述组合物不是从PCT/EP2010/056838实施例 51-53中复制的下表的内容


一种药物组合物，其包含其中分散着油滴的水溶性聚合物基质，该组合物包含至少一种选自下组的免疫调节剂佐剂、抗原或其组合。一种制备成型组合物的方法，所述方法包括将水溶性聚合物的水溶液与油基液体混合形成油包水乳液，所述水溶液和油基液体的至少一种中包含抗原或佐剂或其组合，然后引起或允许所得悬液固化成一个或多个珠或其他成形元件。