专利名称：一种利用超声波制备脱细胞真皮基质的方法烧伤、创伤、战伤等因素造成的皮肤缺损常遗留瘢痕增生和挛缩畸形，严重影响外观和功能，Loewe最早证实真皮组织能增强移植皮的韧性、抑制肉芽组织的生长和瘢痕形成，降低创面挛缩程度。若将重建真皮结构与其他促进创面愈合的措施结合起来，可有效减轻瘢痕的形成，提高创面愈合质量。皮肤一直的关键问题在于免疫排斥反应，其免疫排斥反应主要源于表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等细胞成分。脱细胞真皮基质(Acellular Dermal Matrix, ADM )是一种可用于全层皮肤缺损的真皮替代物，来源于天然皮肤。它是天然皮肤经过一定的理化方法处理，去除了表皮和真皮中的细胞成分，但保留了真皮细胞外基质成分和其三维空间结构。因去除了皮肤中抗原性较强的细胞成分而保留了抗原性微弱的胶原蛋白等细胞外基质成分，同时又具有天然真皮的三维超微结构，可为皮肤再生提供“真皮模板”，诱导移植后宿主细胞成分如成纤维细胞、内皮细胞等循支架结构生长。真皮基质还可以支持成纤维细胞的浸润、新血管的生成，使成纤维细胞合成和分泌具有正常结构和功能的细胞外基质成分，使肉芽组织快速成熟及真皮深层再生，减少成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，从而减少达到减少疤痕或无疤痕的临床效果。1995 ip Livesey ( Livesey, S. Α. , D. N. Herndon, et al. (1995). "Transplanted acellular allograft dermal matrix. Potential as a template for the reconstruction of viable dermis. 〃 Transplantation 60(1): 1-9.)等首先 艮道了脱细胞真皮基质的制备，同年，Wainwright ( Wainwright DJ. Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns. Burns. 1995;21:243-8.)首先报道了脱细胞真皮基质的临床应用。美国LifeCell公司将这一成果商品化，用新鲜的人尸体皮肤制成脱细胞真皮基质，命名为Alloderm，并通过了美国FDA的批准进入了医用生物材料市场。国内陈壁等人最早开始对异体真皮脱细胞的实验和临床研究，且目前已有Alloderm的类似产品上市，但由于人异体皮的来源有限， 且涉及到伦理道德问题，无法满足临床需求，因此异种脱细胞真皮基质成为解决这一矛盾的有效途径。然而现有的异种脱细胞真皮基质制备虽然已经比较成熟，但在其制备过程中存在较多问题，如制备过程复杂，处理时间过长，所用的方法对天然真皮超微结构破坏性较大， 细胞外基质成分保留较差，残留较多的化学物质等缺点。
本发明的目的是针对现有技术的缺陷而提供的一种异种脱细胞真皮基质的制备3方法，其特点是采用健康哺乳动物皮肤为材料，依次经过真皮的制备、渗透休克处理、去污剂结合超声波处理、环氧乙烷消毒后所得到的产品。具有制备过程简单、所需时间适中、细胞成分去除较彻底、细胞外基质成分保留较好的特点。本发明所提供的上述一种利用超声波制备脱细胞真皮基质的简易方法，包括以下步骤包括以下的步骤(1)、对剥离的哺乳动物皮肤进行剔除毛发的处理；(2)、用0.1%苯扎溴铵溶液清洗浸泡后再用消毒液消毒皮肤，在无菌条件下并用机械法制得网状层真皮；(3)、将真皮置于低渗溶液内震荡处理0.5小时-12小时，再置于高渗溶液内震荡处理0. 5小时-12小时；
(4)、重复步骤(3)1-6次；
(5)、将真皮置于洗涤剂内用超声波清洗器处理12小时-48小时；
(6)、用无菌磷酸盐缓冲液洗涤1-6次，环氧乙烷消毒即得脱细胞真皮基质。在上述制备方法中，步骤(1)中可用于制备脱细胞真皮基质的哺乳动物的选择是多种多样的，包括人、猪、牛、羊、大鼠或者兔等。步骤(1)中的哺乳动物皮肤来源自出生不超过14天的健康哺乳动物的皮肤。步骤(1)中所述的清除毛发是指采用机械方式去除。步骤(2)中所述的消毒液选自碘伏、75%酒精、碘酒等，优先选择碘伏。步骤(2)中所述的网状层真皮的厚度为0. 1 mm -0. 5 mm，优先选择0. 3 mm。步骤(3)中所述的低渗溶液是指蒸馏水或者10 mM Trizma HCl和10 mM EDTA 的混合液，优先选择蒸馏水；高渗溶液是指1 M NaCl或者50 mM Trizma HC1、1 M NaCl 和10 mM EDTA的混合液，优先选择1 M NaCl。步骤(3)中所述的低渗溶液处理时间0. 5小时-12小时，优先选择2小时；高渗溶液处理时间0.5小时-12小时，优先选择2小时。步骤(3)中所述的震荡处理，震荡方式可以为水平，也可以为旋转，震荡频率为50 -200/分。步骤(4)中所述的重复步骤(3) 1 - 6次，优先选择3次。步骤(5)中所述的洗涤剂为Tween-20、Tween-80、SDS、Triton X-100、Triton X-200、CHAPS中的一种或几种组合，优先选择Triton X-100，Triton X-100浓度可以为 0.1%、0.5%、1.0%、2.0%，优先选择 0.5%。步骤(5)中所述的超声波清洗器的频率设定在20 kHz - 80 kHz之间，功率设定在 100 W - 400 W 之间。步骤(6)中所述的磷酸盐缓冲液pH值在7.2 - 7. 4之间，洗涤时间在5 min -30 min之间。本发明提供了一种利用超声波制备脱细胞真皮基质的简易方法。在该脱细胞真皮基质制备方法中采用了渗透压休克法裂解细胞，配合后续的洗涤剂去除细胞成分，超声波的使用提高了洗涤剂的洗涤效力，达到了较为理想的去除细胞的效果。由于没有使用酶类， 比如胰蛋白酶、DNase、RNase等，避免了对细胞外基质成分的较大破坏，进而最大程度上保留了真皮细胞外基质成分，并且不涉及酶类物质残留引起移植后不利的免疫反应。本发明的优点
(1)获得的真皮基质不含细胞成分，抗原性低；
(2)在一种利用超声波制备脱细胞真皮基质的简易方法中，采用了简单的方法组合，所涉及方法对环境友好，制备工艺简单实用，制作周期短，价格较低，适于规模化生产。(3)制备过程中未使用固定剂、交联剂等，因而所制备的异种脱细胞真皮基质保留了真皮的天然三维结构。


图1为异种脱细胞真皮基质冻干后的照片； 图2为处理之前真皮基质组织学图片；
图3为处理之后真皮基质组织学图片； 图4为处理之前真皮基质DAPI染色； 图5为处理之后真皮基质DAPI染色；
图6为脱细胞前后真皮基质内DNA的电泳图；附图6中MR代表Marker，为 D15000+2000，U代表经本方法处理残留在真皮内的DNA，A代表未经任何处理真皮内的DNA， 由DNA电泳图可看出，经本方法处理后的真皮内DNA含量明显降低。

对本发明进一步说明。实施例1、制备异种脱细胞真皮基质
(1)剥离健康新生牛皮肤，剃除毛发；
(2)用0.1%苯扎溴铵溶液清洗浸泡，碘伏消毒皮肤5min，在无菌条件下用取皮鼓取厚度为0.2 mm的网状层真皮；
(3)将网状真皮置于蒸馏水内震荡处理2小时，再置于1M NaCl内震荡处理2小
时；
(4)重复步骤(3)3次；
(5)再将网状真皮置于0.5%Triton X-100内用超声波清洗器处理M小时，超声波清洗器处理的频率设定为40 kHz，功率为250 W；
(6)用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次15min，环氧乙烷消毒即得脱细胞真皮基质。实施例2、制备异种脱细胞真皮基质
(1)剥离健康清洁级SD大鼠皮肤，剃除毛发；
(2)用0.1%苯扎溴铵溶液清洗浸泡，碘伏消毒皮肤5min，在无菌条件下用取皮鼓取厚度为0.3 mm的网状层真皮；
(3)将网状真皮置于蒸馏水内震荡处理1小时，再置于1M NaCl内震荡处理1小
时；
(4)重复步骤(3)3次；
(5)在将网状真皮置于0.5%Triton X_100内用超声波清洗器处理12小时，频率设
5定为40 kHz，功率为250 W ；
(6)用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次15 min，环氧乙烷消毒即得脱细胞真皮基质。 实施例3、制备异种脱细胞真皮基质
(1)剥离健康兔皮皮肤，剃除毛发；
(2)用0.1%苯扎溴铵溶液清洗浸泡，75%酒精消毒皮肤5min，在无菌条件下用取皮鼓取厚度为0. 3 mm的网状层真皮；
(3)将网状真皮置于10mM Trizma HCl与10 mM EDTA的混合液内震荡处理2小时， 再置于1 M NaCl内震荡处理2小时；
(4)重复步骤(3)3次；
(5)再将网状真皮置于0.5%Tween-20内用超声波清洗器处理20小时，超声波清洗器处理的频率设定为30 kHz，功率为250 W；
(6)用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次15min，环氧乙烷消毒即得脱细胞真皮基质。


本发明公开了一种脱细胞真皮基质的制备方法。方法包括对剥离的哺乳动物皮肤进行剔除毛发的处理；用消毒液消毒皮肤，在无菌条件下并用机械法制得网状层真皮；将真皮置于低渗溶液内震荡处理0.5小时-12小时，再置于高渗溶液内震荡处理0.5小时-12小时；重复前步骤1-6次；将真皮置于洗涤剂内用超声波清洗器处理12小时-48小时；用无菌磷酸盐缓冲液洗涤1-6次，环氧乙烷消毒即得脱细胞真皮基质。本发明制备工艺简单实用，细胞去除较为彻底，制作周期短，对周围环境友好，价格较低，适于规模化操作。