专利名称：一种一菌多酶菌株及其筛选方法和应用的制作方法酶是一种生物催化剂，饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用的环保型“绿色”饲料添加剂广泛应用于在动物生产中，应用饲用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽及水产动物的生产性能，又能减少排泄物中氮、磷含量，保护水体和土壤免受污染， 将有着十分广阔的应用前景。早期的酶制剂以动植物作为原料直接提取，但由于动植物生长周期长，又受地理、 气候和季节等多种因素的影响，不适于大规模的工业生产。目前人们已将目光转向以微生物作为酶制剂的主要来源，如淀粉酶和蛋白酶的微生物制备使用于工业化生产。早期的复合酶制剂是通过单酶复配后再使用，此种方式易造成生产成本过高，质量不稳定，使用不方便。发明内容本发明的目的在于提供一种一菌多酶菌株。同时，本发明的目的还在于提供一种该一菌多酶菌株的筛选方法。进一步地，本发明的目的还在于提供一种该菌多酶菌株的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种一菌多酶菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) I. 1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 CCTCC NO M 2011286。应用经典的细菌鉴定方法及分子生物学方法16S rDNA对其进行鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bac illus subtilis) I. 1111，于2011年8月11日保藏在中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO M 2011286。该枯草芽孢杆菌对对胆酸盐、人工胃液、人工肠液等环境表现出很强的耐受能力， 对实验动物安全无毒无副作用，并能产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶多种酶，这有利于该菌株作为益生菌在饲料添加剂中的进一步开发利用， 为进一步研究各酶的性质、各酶之间的相互关系、实现一菌多酶发酵奠定了良好的基础。
所述的一菌多酶菌株可产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、 脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶。
本发明的技术方案还采用了一种一菌多酶菌株的筛选方法，包括以下步骤以产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶为筛选目标，分别用各酶选择性培养基，根据菌落周围有无透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直径(D)与菌落直径(d)的比值，来初步判断是否为产酶菌株及高产酶活，最终从实验室分离、筛选保存的菌种资源库中筛选到一菌产多酶的菌株。
本发明的技术方案还涉及一种该一菌多酶菌株在制备益生菌剂方面的应用。
斜面和种子培养基以g/L计蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20， ρΗ7· 2 ;发酵培养基以 g/L 计玉米粉 36-44，豆饼粉 36-44，Na2HPO4 8，(NH4) 2SO4 4，NH4Cl 0.75，CaCl2 1.0，pH7. O ;培养条件10L发酵罐中发酵体积为7L，接种量为总体积10%， 温度为35-40°C，通气量为3L/L. min，搅拌速度为200-300r/min，发酵时间30_50h，发酵液中有大量的枯草芽孢杆菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶为主，同时含有木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶等水解酶，将发酵液浓缩加入 30% -60%淀粉干燥即制成益生菌和复合酶制剂。
同时，本发明的技术方案还涉及一种一菌多酶菌株在制备饲料方面的应用。
复合酶制剂在饲料中的添加量为每吨饲料加100_200g。
所述的复合酶制剂组成为蛋白酶5000_10000U/g、甘露葡聚糖酶1000_3000U/g、 糖化酶 700-3000U/g，木聚糖酶 7500-15000U/g、淀粉酶 500_3000U/g、纤维素酶 200-700U/ g、植酸酶 50-80U/g、果胶酶 100-200U/g、脂肪酶 200_500U/g。
本发明的复合酶有不同的作用机制，在饲料中的添加可减少其抗营养作用，提高饲料利用率，提高动物生产效率，充分发挥动物的生产性能。本发明通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液和动物试验证明该菌株对胆盐、人工胃液、人工肠液有很强的耐受能力，对试验动物表现出安全性和促增长能力，这为有效提高该菌株的产酶能力，在发酵过程中能够同时产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，实现一菌多酶发酵奠定了基础。该菌株产生的多种酶之间相互协同作用效果强，可作为饲料添加剂应用于畜、禽、水产动物等农业生产。
产酶菌株的筛选
I.产木聚糖酶菌株的筛选
将已活化的菌株刺种在木聚糖酶筛选培养基上，在37°C恒温培养24h，根据菌落周围是否有透明圈产生，判断其是否产生木聚糖酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，根据两者比值大小确定其分泌木聚糖酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产木聚糖酶活性高的菌株。
2.产蛋白酶菌株的筛选
将已活化的菌株刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37°C温箱中培养24h，根据菌落周围是否有酪素水解圈产生，判断其是否产生蛋白酶。用直尺分别测量水解圈与菌落的直径，根据两者比值大小确定其分泌蛋白酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产蛋白酶活性高的菌株。
3.产植酸酶菌株的筛选
将已活化的菌株刺种在植酸酶初筛培养基上，在30°C温箱中培养48h，根据菌落周围是否产生透明圈来判断其是否产生植酸酶。用直尺分别测量透明圈的直径(D)和菌落直径(d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生植酸酶活性的高低，并以比值大于等于2 时判其为产植酸酶活性高的菌株。
4.产果胶酶菌株的筛选
将已活化的菌株刺种在果胶酶初筛培养基上，在37°C温箱中培养36h，取出后，在菌落周围滴加几滴CTAB溶液，静置IOmin后观察透明圈。根据菌落周围是否产生透明圈来判断其是否产生果胶酶。用直尺分别测量透明圈的直径(D)和菌落直径(d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生果胶酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产果胶酶活性高的菌株。
5.产脂肪酶菌株的筛选
将已活化的菌株刺种在脂肪酶初筛培养基上，在37°C温箱中培养24h，根据菌落周围是否产生水解圈来判断其是否产生脂肪酶。分别测量水解圈的直径(D)和菌落直径 (d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生脂肪酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产脂肪酶活性高的菌株。
6.产甘露聚糖酶菌株的筛选
将已活化的菌株刺种在甘露聚糖酶筛选培养基上，37°C培养24h后，用刚果红水溶液检测菌落周围是否产生透明圈及其大小，作为产甘露聚糖酶筛选的依据。，并以比值大于等于2时判其为产甘露聚糖酶活性高的菌株。
7.产糖化酶菌株的筛选
将活化后的菌株刺种糖苷酶筛选培养基上，37°C培养36h，采用革兰氏碘液染色， 在菌落周围有透明圈产生证明其产糖化酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，并以比值大于等于2时判其为产糖化酶活性高的菌株。
8.高产淀粉酶菌株的筛选
将活化后的菌株刺种可溶性淀粉培养基平皿上，在37°C温箱中培养24h，采用革兰氏碘液染色，根据菌落周围是否有透明圈产生判断其是否产生淀粉酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，并以比值大于等于2时判其为高产淀粉酶的菌株。9.高产纤维素酶菌株的筛选
9.高产纤维素酶菌株的筛选
将活化后的菌株刺种纤维素酶筛选培养基上，在37°C温箱中培养24h，采用Img/ ml刚果红染色lh，然后依次用，lmol/LNaCl溶液彻底洗去染液lh，再用Imol/mlHCl定色， 根据菌落周围是否形成染色圈，判断芽孢杆菌是否产生纤维素酶。分别测量染色圈直径和菌落直径，以比值大于等于2的判其为活性比较高的纤维素酶产酶菌株。
一菌多酶发酵法可以大大提高生产效率、节约成本，而且由于各酶种来源于同一菌株，其安全性与复配性能显得更有优势。
产酶菌株的鉴定
应用普通琼脂培养基对产酶菌株的培养特征进行研究，利用革兰氏染色法对其染色特性进行研究；利用糖发酵试验、IMVIC试验、淀粉水解、明胶液化、硫化氢、赖氨酸脱羧酶试验、精氨酸双水解酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验等生化试验对3其生理生化特性进行分析，并利用分子生物学方法16S rDNA对产酶菌株进行鉴定。
产酶菌株的耐受性及动物试验
通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液环境，分别测定产酶菌株在不同的胆盐含量、不同PH值的人工胃液、不同pH值的人工肠液环境中的耐受能力。并选择健康小白鼠为实验动物，将菌株制成菌悬液(菌悬液活菌数为109CFU/mL)，同时设空白对照，连续灌胃5天，观察小白鼠的健康状况。


图I为产酶菌株16S rDNA PCR扩增鉴定图谱；泳道M为DL2000Marker ;泳道1、2 均为产酶菌株16S rDNA PCR扩增产物；泳道3阴性对照。
图2产酶菌株的系统发育树；▲为目的菌株。

下面结合附图对本发明的
作进一步详细的描述
产酶菌株筛选实施例
I、产木聚糖酶菌株的筛选
将活化的产酶菌株刺种在木聚糖酶筛选培养基上，在37°C温箱中培养24h，根据菌落周围是否有透明圈产生，经过观察，发现有该菌株产生透明圈，测量菌株的透明圈直径 (D)、菌落直径(d)及透明圈直径与菌落直径之比(D/d)，试验结果见表I。
表I木聚糖酶分解菌酶活筛选结果
菌株D (mm)d (mm)D,/d 比值产酶菌株13.07.01.857
2.产蛋白酶菌株的筛选
将活化的产酶菌株刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37°C温箱中培养24h，观察发现有该菌株株产生酪蛋白水 解圈。测量菌株的水解圈直径(D)、菌落直径(d)及水解圈直径与菌落直径之比(D/d)，试验结果见表2。
表2蛋白酶分解菌酶活初筛
菌株D (mm)d (mm)D/d产酶菌株24.05. O4.80
3.产植酸酶菌株筛选结果
将活化的产酶菌株刺种在植酸酶初筛培养基平皿上，在30°C温箱中培养48h后， 观察发现菌株产生有透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表3。
表3产值酸酶菌株筛选结果
菌株P (mm)d (mm)D./d产酶菌株179I. 889
由表3可知，该菌株的D/d值为2. 125，可初步确定这些菌株产植酸酶的活性较高。
4.产果胶酶菌株筛选结果
将活化的产酶菌株刺种在果胶酶初筛培养基平皿上，在37°C温箱中培养36h后， 观察发现该菌株产生透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表4。
表4产果胶酶菌株筛选结果


本发明涉及一种一菌多酶菌株及其制备方法和应用，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NOM 2011286。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111可产木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9种酶的菌株，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶产量特别高。同时通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液和动物试验证明该菌株对胆盐、人工胃液、人工肠液有很强的耐受能力，对试验动物表现出安全性和促增长能力，这为有效提高该菌株的产酶能力，在发酵过程中能够同时产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，实现一菌多酶发酵奠定了基础。该菌株产生的多种酶之间相互协同作用效果强，可作为饲料添加剂应用于畜、禽、水产动物等农业生产。