专利名称：一种含氨甲喋呤及其增效剂的缓释注射剂的制作方法作为一种常用的化疗药物，氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)已广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗，而且作用效果较为明显。然而，其出人意料的神经毒性极大地限制了该药的应用。肿瘤间质中的血管、结缔组织、基质蛋白、纤微蛋白及胶原蛋白等不仅为肿瘤细胞的生长提供了支架及必不可少的营养物质，还影响了化疗药物在肿瘤周围及肿瘤组织内的渗透和扩散(参见尼提等“细胞外间质的状况对实体肿瘤内药物运转的影响”《癌症研究》60期2497-503页(2000年)(Netti PA，Cancer Res.2000，60(9)2497-503)。由于实体肿瘤过度膨胀性增生，其间质压力、组织弹性压力、流体压力及间质的粘稠度均较其周围正常组织为高，因此，常规化疗，难于肿瘤局部形成有效药物浓度，参见孔庆忠等“瘤内放置顺铂加系统卡莫司汀治疗大鼠脑肿瘤”《外科肿瘤杂志》69期76-82页(1998年)(Kong Q etal.，J Surg Oncol.1998 Oct；69(2)76-82)，单纯提高给药剂量又受到全身反应的限制。药物局部应用可能在某种程度上解决药物浓度的问题，然而药物植入等手术操作较复杂，创伤性大，除易导致出血、感染、免疫力降低等各种并发症外，还可引起或加速肿瘤的扩散与转移。除此之外，手术前后本身的准备及昂贵的费用常常影响其有效的实施。另外，许多肿瘤细胞内的DNA修复功能在化疗之后明显增加。后者常导致肿瘤细胞对抗癌药物的耐受性的增强，其结果是治疗失败。除此之外，低剂量的抗癌药物治疗不仅能够增加癌细胞的药物耐受性，而且还可促进其浸润性生长”(参见梁等“抗癌药物脉冲筛选后增加了人肺癌细胞的药物耐受性及体外浸润能力并伴有基因表达的改变”《国际癌症杂志》111期484-93页(2004年)(Liang Y，etal.，Int J Cancer.2004；111(4)484-93))。氨甲喋呤作为一种常用的抗癌药物，已广泛用于治疗多种肿瘤，如胃肠等消化系统肿瘤。然而，在应用过程中，其明显的全身毒性极大地限制了该药的应用。为有效提高肿瘤局部的药物浓度、降低药物在循环系统中的药物浓度，人们研究了含氨甲喋呤的药物缓释系统，包括缓释植入剂(见中国专利号ZL96115937.5、ZL97107077.6和美国专利US5,651,986)等。然而，固体缓释植入剂(中国专利号ZL96115937.5；ZL97107077.6)和现有的如用于治疗脑肿瘤(ZL00809160.9)缓释微球或美国专利(US5,651,986)均存在不容易操作、疗效差、并发症多等问题。除此之外，许多实体肿瘤对抗癌药包括氨甲喋呤的敏感性较差，且在治疗过程中容易产生耐药性。因此，便于在肿瘤局部维持高的药物浓度以及增加肿瘤细胞对药物的敏感程度的制剂和方法便成为一个重要研究课题。
本发明发现，本发明中提到的药物与氨甲喋呤合用可使其抗癌作用相互加强(以下将能使氨甲喋呤抗癌作用相互增加的药物称之为氨甲喋呤增效剂)。除此之外，将氨甲喋呤或氨甲喋呤与其增效剂的组合包装于特定的缓释辅料中并配以特殊溶媒制成抗癌药物缓释注射剂不仅能够极大地提高肿瘤局部的药物浓度、降低药物在循环系统中的药物浓度、降低药物对正常组织的毒性，还能够极大方便药物注射、减少手术操作的并发症、降低病人的费用。以上意外发现构成本发明的主要内容。
本发明抗癌药物缓释注射剂由缓释微球和溶媒组成。具体而言，该抗癌缓释注射剂由以下成分组成(A)缓释微球，包括抗癌有效成分 0.5-50％缓释辅料 50-99％助悬剂 0.0-30％以上为重量百分比和(B)溶媒，为普通溶媒或含助悬剂的特殊溶媒。
其中，抗癌有效成分为氨甲喋呤和氨甲喋呤增效剂，而氨甲喋呤增效剂选自铂类化合物、拓扑酶抑制剂和/或四嗪类化合物；助悬剂有利于缓释药物的悬浮进而方便注射给药，选自羧甲基纤维素钠、(碘)甘油、二甲硅油、丙二醇、卡波姆、甘露醇、山梨醇、土温20、土温40和土温80之一或其组合。
氨甲喋呤在组合物中所占的比例因具体情况而定，一般而言，可从0.01％-55％，以1％-50％为佳，以2％-40％为最佳。均为重量百分比。
铂类化合物选自下列之一或组合顺铂(顺氯氨铂、DDP)、卡铂(Carboplatin，碳铂)、环铂(Cycloplatin)、庚铂(sunplatinum)、得那铂(氮烯咪胺；氮烯唑胺；甲嗪咪唑胺；达卡巴嗪)、环戊胺铂、铂蓝、环丙胺铂、乙二胺丙二酸铂、僧尼铂、恩洛铂(Enloplatin)、环硫铂(环乙二胺硫酸铂，Sulfatodiaminocy clohexane platinum，SHP)、顺螺铂(螺磺铂胺)、右奥马铂(Dexormaplatin)、异丙铂(Iproplatin)、洛铂(Lobaplatin，乐铂)、米铂(Miboplatin)、皮卡铂(picoplatin)、奈达铂(Nedaplatin)、奥马铂(Ormaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin，Oxaloplatin)、司铂(Sebriplatin，briplatin)、螺铂(Spiroplatin)或折尼铂(Zeniplatin)。
以上铂类化合物以顺铂、卡铂、奥马铂、右奥马铂、庚铂、洛铂、奈达铂或奥沙利铂为优选。
上述铂类化合物在组合物中的重量百分比可为0.1％-50％，以1％-30％为佳，5％-20％为最佳。
拓扑酶抑制剂选自下列之一或组合喜树硷(camptothecin，CPT)、喜树硷的衍生物、勒托替康(Lurtotecan)、拓扑替康(10-hydroxy-9-dimethylaminomethyl-(S)-camptothecin，topotecan)、依力替康(irinotecan，IRT)、9-硝基喜树硷(9-nitrocamptothecin，9NC)、7-乙基-10-羟基-喜树硷(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin，SN-38)、7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羰基喜树硷(7-ethyl-10-[4-(1-pyperidino)-1-piperidino]carbonyloxycamptothecin，CPT-11)、10-羟基-喜树硷(10-Hydroxycamptothecin，HCPT)、同型喜树硷(Homocamptothecins)、亚甲二氧基喜树硷(10，11-methylenedioxy，MD-CPT)、(RS)-亚甲二氧基喜树硷(10，11-MD-20(RS)-CPT)、(S)-亚甲二氧基喜树硷甘氨酸酯(10，11-MD-20(S)-cpT-glycinate ester(Gly).HCl)、9-氨基-(S)-亚甲二氧基喜树硷甘氨酸酯(9-amino-10，11-MD-20(S)-CPT-Gly)、N-[2-(二甲基氨基)乙基]呀啶-4-羧酰胺(N-[2-(dimethylamino)ethyl]acridine-4-carboxamide，DACA)及其5或7位取代的衍生物、鬼臼霉素(podophyllotoxin)、依托泊甙(Etoposide，epipodophyllotoxins，鬼臼乙叉甙、足叶乙甙、VP-16)、替尼泊甙(Teniposide、鬼臼噻吩甙、VM-26)、鬼臼酸、鬼臼毒素、三羟基异黄酮(Genistein)、14-羟柔红霉素、氨柔比星(Amrubicin)、艾柔比星(4’-(acridinylamino)methansulfon-m-anisidide(amsacrine，m-AMSA))、4-去甲氧道诺红菌素(4-demeth oxydaunorubicin)、地托比星、7-O-甲基诺加-4’-表阿霉素(7-o-methylnogallol-4’-epiadriamycin)、依索比星(Esorubicin)、卡柔比星、伊达比星(idarubicin，IDA)、罗多比星、流柔比星(Leurubicin)、美多比星、奈莫柔比星(Nemorubicin)、多柔比星、戊柔比星(N-三氟毒素-14-戊酸盐，N-trifluoroacetyladriamycin-14-valerate，AD 32，valrubicin)、2[4-(7-氯-2-喹喔啉基氧苯氧基]-丙酸((2-[4-(7-chloro-2-quinoxalinyloxyphenoxy]-propionic acid，XK469)、佐柔比星(Zorubicin)、N-(2-氯乙烷)-N-亚硝基脲基柔红霉素(N-(2-Chloroethyl)-N-nitrosoureidodaunorubicin，AD 312)、吡唑[1，5-a]吲哚衍生物，如，但不限于，GS-2，-3，-4，GS-5；二氧代哌嗪衍生物，如，但不限于，(+)-1，2-双(3，5-二氧代哌嗪基)丙烷((+)-1，2-bis(3，5-dioxopiperazinyl-1-yl)propane，ICRF-187)、间-2，3-双(3，5-二氧代哌嗪-1-基)丁烷(meso-2，3-bis(3，5-dioxopiperazine-1-yl)butane，ICRF-193)、双二氧代哌嗪(bisdioxopiperazine)；苏拉明(Suramin)，脱氧鸟苷(Deoxyguanosine)，石胆酸(lithocholic acid，LCA)或叠氮化钠(sodium azide)。
在上述拓扑酶抑制剂中，以喜树硷、羟基喜树硷、勒托替康、拓扑替康、依力替康、依托泊甙、替尼泊甙、氨柔比星、艾柔比星、罗多比星、流柔比星、佐柔比星、戊柔比星或伊达比星为优选。
拓扑酶抑制剂在组合物中所占的比例因具体情况而定，一般而言，可从0.01％-50％，以1％-40％为佳，以5％-30％为最佳。均为重量百分比。
四嗪类化合物选自下列之一或组合咪唑并四嗪(imidazotetrazine)、咪唑并哌嗪(imidazopyrazine)、1H-咪唑并[b]哌嗪(1H-imidazo[b]pyrazine)、咪唑并吡啶(imidazopyridine)、1H-咪唑并[1，2-a]吡啶(1H-imidazo[1，2-a]pyridinum)、甲基苄肼(procarbazine，PCB)、米托唑胺(mitozolomide，MTZ)、氮烯唑胺(dacarbazine，DCB)、替莫唑胺(Temozolomide or 8-Carbamoyl-3-methylimidazo[5，1-d]-1，2，3，5-tetrazin-4(3H)-one or NSC 362856))、4-羧基替莫唑胺[4--carbonyl]temozolomide]、3-N-甲基替莫唑胺[3-N-methyl]temozolomide)、吡咯[2，1-d][1，2，3，5]四嗪-4(3H)-替莫唑胺(Pyrrolo[2，1-d][1，2，3，5]tetrazine-4(3H)-ones)、吡咯[2，1-d][1，2，3，5]四嗪10a-o(Pyrrolo[2，1-d][1，2，3，5]tetrazinones 10a-o)、5-(3-N-甲基三氮-1-基)-咪唑并-4-羧酰胺(MTIC，5-(3-N-methyltriazen-1-yl)-imidazole-4-carboxamide)、8-硝基-3-甲基-苯并-1，2，3，5-四氮杂卓-4-替莫唑胺(8-nitro-3-methyl-benzo-1，2，3，5-tetrazepin-4(3H)-one，NIME)、3，5-二甲基-吡啶并-1，2，3，5-四氮杂卓-4-替莫唑胺(3，5-dimethyl-pyrido-1，2，3，5-tetrazepin-4-one，PYRZ)或3-(2-氯乙烷)-N，N二甲基-4-氧-3，4-二氢咪唑[5，1-d]-1，2，3，5-四嗪-8-羧酰胺(3-(2-chloroethyl)-N，N-dimethyl-4-oxo-3，4-dihydroimidazo[5，1-d]-1，2，3，5-tetrazine-8-carboxamide，CDODTC)。
上述四嗪类化合物中以咪唑并四嗪、咪唑并哌嗪、1H-咪唑并[b]哌嗪、咪唑并吡啶、1H-咪唑并[1，2-a]吡啶、甲基苄肼、米托唑胺、氮烯唑胺或替莫唑胺为优选。
四嗪类化合物在缓释剂中所占的比例因具体情况而定，一般而言，可从0.01％-55％，以1％-40％为佳，以5％-30％为最佳。均为重量百分比。
抗癌有效成分为氨甲喋呤增效剂或氨甲喋呤与其增效剂的组合。当药物缓释微球中的抗癌药物仅为氨甲喋呤增效剂时，抗癌缓释注射剂主要用于增加其他途径应用的氨甲喋呤的作用效果或用于对放疗或其它疗法的增效。当用于增加其他途径应用的氨甲喋呤的作用效果时，氨甲喋呤可经动脉、静脉或局部注射、放置给药。
抗肿瘤药物在药物缓释微球中的重量百分比为0.5％-60％，以2％-40％为佳，以5％-30％为最佳。当联合应用时，氨甲喋呤与氨甲喋呤增效剂的重量比为1-9∶1到1∶1-9，以1-2∶1和2-1∶1为优选，1∶1为最优选。
本发明抗癌缓释注射剂微球中的抗癌有效成分优选如下，均为重量百分比1-40％的氨甲喋呤与1-40％的顺铂、卡铂、庚铂、右奥马铂、洛铂、奈达铂、奥马铂、奥沙利铂或折尼铂的组合；或1-40％的氨甲喋呤与1-40％的喜树硷、羟基喜树硷、勒托替康、拓扑替康、依力替康、依托泊甙、替尼泊甙、氨柔比星、艾柔比星、罗多比星、流柔比星、佐柔比星、戊柔比星或伊达比星的组合；或1-40％的氨甲喋呤与1-40％的甲基苄肼、米托唑胺、氮烯唑胺或替莫唑胺。
缓释辅料缓释辅料选自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物(PLGA)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)、聚苯丙生、FAD与癸二酸共聚物、木糖醇、低聚糖、软骨素、甲壳素、透明质酸、胶原蛋白、明胶和白蛋胶之一或其组合，其中优选聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物(PLGA)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)、FAD与癸二酸共聚物、聚苯丙生之一或其组合。
当选用聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)与聚乙醇酸的混合物、乙醇酸和羟基羧酸的共聚物(PLGA)时，PLA和PLGA含量重量百分比分别为0.1-99.9％和99.9-0.1％。聚乳酸的分子量峰值可为，但不限于，5000-200,000，但以20,000-80,000为优选，以30,000-50,000为最优选；聚乙醇酸的分子量可为，但不限于，5000-200,000，但以20,000-100,000为优选，以30,000-50,000为最优选；以上聚羟基酸可单选或多选。当单选时，以聚乳酸(PLA)或羟基羧酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)为优选，共聚物的分子量可为，但不限于，5000-200,000，但以20,000-60,000为优选，以30,000-50,000为最优选；乙醇酸和羟基羧酸的共混比例是10/90-90/10(重量)，优选25/75-75/25(重量)，最优选75∶25。共混的方法是任意的。乙醇酸和羟基羧酸共聚时的含量分别为重量百分比10-90％和90-10％。当多选时，以高分子多聚物或不同高分子多聚物组成的复合多聚物或共聚物为优选，以含不同分子量聚乳酸或癸二酸的复合多聚物或共聚物为最优选，如，但不限于，分子量为1000到30000的聚乳酸与分子量为20000到50000的聚乳酸混合、分子量为10000到30000的聚乳酸与分子量为30000到80000的PLGA混合、分子量为20000到30000的聚乳酸与癸二酸混合、分子量为30000到80000的PLGA与癸二酸混合。在各种高分子聚合物中，以聚乳酸、癸二酸、含聚乳酸或葵二酸的高分子多聚物的混合物或共聚物为首选，混合物和共聚物可选自，但不限于，PLA、PLGA、乙醇酸和羟基羧酸的混合物、葵二酸与芳香聚酐或脂肪族聚酐的混合物或共聚物。芳香聚酐的代表物是聚苯丙生[聚(1，3-二(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)(p(CPP-SA))、双脂肪酸一癸二酸共聚物(PFAD-SA)]、聚(芥酸二聚体一癸二酸)[P(EAD-SA)]和聚(富马酸一癸二酸)[P(FA-SA)]等。对羧苯氧基丙烷(p-CPP)与癸二酸共聚时的含量分别为重量百分比10-60％和20-90％，共混重量比是10-40∶50-90，最好是重量比15-30∶65-85。
为调节药物释放速度或改变本发明的其它特性，可以改变聚合物的单体成分或分子量、添加或调节药用辅料的组成及配比，添加水溶性低分子化合物，如，但不限于，各种糖或盐等。其中糖可为，但不限于，木糖醇、低聚糖、(硫酸)软骨素及甲壳素等，其中盐可为，但不限于，钾盐和钠盐等。
除上述辅料外，还可选用其他物质见美国专利(4757128；4857311；4888176；4789724)及《药用辅料大全》(第123页，四川科学技术出版社1993年出版，罗明生和高天惠主编)中已有详细描述。另外，中国专利(申请号96115937.5；91109723.6；9710703.3；01803562.0)及美国发明专利(专利号5,651,986)也列举了某些药用辅料，包括充填剂、增溶剂、吸收促进剂、成膜剂、胶凝剂、制(或致)孔剂、赋型剂或阻滞剂等。
助悬剂的含量因溶媒所悬浮的药物、缓释微球(或微囊)的组成、性质及其需要量、注射剂的制备方法及助悬剂的种类及其组成而定，如，羧甲基纤维素钠可为0.5-5％，但以1-3％为优选，甘露醇和或山梨醇为5-30％，但以10-20％为优选，而吐温20、吐温40或吐温80为0.05-2％，但以0.10-0.5％为优选。多数情况下，缓释微粒由有效成分与缓释辅料组成，溶媒为特殊溶媒。当溶媒为普通溶媒时，所悬浮之药物或缓释微球(或微囊)则由有效成分、缓释辅料和/或助悬剂组成。换言之，当缓释微粒(A)中的助悬剂为“0”时，溶媒(B)为特殊溶媒，当缓释微粒(A)中的助悬剂不为“0”时，溶媒(B)可为普通溶媒或特殊溶媒。助悬剂的黏度为100cp-3000cp(20℃-30℃时)，优选1000cp-3000cp(20℃-30℃时)，最优选1500cp-3000cp(20℃-30℃时)。
普通溶媒可为，但不限于，蒸馏水、注射用水、生理冲液、无水乙醇或各种盐配制的缓冲液，药典有相应规定；本发明所指的特殊溶媒为含助悬剂的普通溶媒，助悬剂可为，但不限于，羧甲基纤维素钠、(碘)甘油、二甲硅油、丙二醇、卡波姆、甘露醇、山梨醇、表面活性物质、吐温20、吐温40和吐温80之一或其组合。特殊溶媒中助悬剂的含量为0.1-30％体积重量百分比，优选如下(a)0.5-5％羧甲基纤维素钠；或(b)0.5-5％羧甲基纤维素钠和0.1-0.5％吐温80；或(c)5-20％甘露醇；或(d)5-20％甘露醇和0.1-0.5％吐温80；或。
(e)0.5-5％羧甲基纤维素钠、5-20％山梨醇和0.1-0.5％吐温80。
上述均为体积重量百分比，单位体积的普通溶媒中含助悬剂的重量，如g/ml，kg/l，下同。
注射剂的制备包括缓释微球或药物微粒的制备、溶媒的制备以及缓释微球或药物微粒在溶媒中悬浮，最后制成注射剂。
其中，缓释微球或药物微粒可用若干种方法制备如，但不限于，混合法、熔融法、溶解法、喷雾干燥法制备微球、溶解法结合冷冻(干燥)粉碎法、脂质体包药法及乳化法等。其中以溶解法(即溶剂挥发法)、冷冻(干燥)粉碎法、干燥法、喷雾干燥法和乳化法为优选。微球则可用于制备上述各种缓释注射剂。悬浮药物或缓释微球(或微囊)的粒径因具体需要而定，可为，但不限于，1-300um，但以20-200um为优选，30-150um最优选。药物或缓释微球可制成微球、亚微球、微乳、纳米球、颗粒或球形小丸。缓释辅料为上述生物可容性、可生物降解或非生物降解多聚物。
溶媒的制备则取决于溶媒的种类，普通溶媒有市售，也可以自制，如蒸馏水、注射用水、生理冲液、无水乙醇或各种盐配制的缓冲液，但必需严格按照有关标准。特殊溶媒需考虑到助悬剂的种类及其组成、溶媒所悬浮的药物、缓释微球(或微囊)的组成、性质及其需要量及注射剂的制备方法，如将羧甲基纤维素钠(1.5％)+甘露醇和或山梨醇(15％)和/或吐温80(0.1％)溶于生理盐水中得相应得溶媒，黏度在10cp-650cp(20℃-30℃时)。
本发明发现影响药物和/或缓释微球悬浮和/或注射的关键因素是溶媒的黏度，黏度越大，悬浮效果越好，可注射性越强。这种意外发现构成了本发明的主要指数特征之一。溶媒的黏度取决于助悬剂的黏度，助悬剂的黏度为100cp-3000cp(20℃-30℃时)，优选1000cp-3000cp(20℃-30℃时)，最优选1500cp-3000cp(20℃-30℃时)。按照此条件所制得的溶媒的黏度为10cp-650cp(20℃-30℃时)，优选20cp-650cp(20℃-30℃时)，最优选60cp-650cp(20℃-30℃时)。
注射剂的制备有多种方法，一种是将助悬剂为“0”的缓释微粒(A)直接混于特殊溶媒中，得到相应的缓释微粒注射剂；另一种是将助悬剂不为“0”的缓释微粒(A)混于特殊溶媒或普通溶媒中，得到相应的缓释微粒注射剂；再一种是将缓释微粒(A)混于普通溶媒中，然后加入助悬剂混匀，得到相应的缓释微粒注射剂。除外，还可先将缓释微粒(A)混于特殊溶媒中制得相应的混悬液，然后用真空干燥等办法去除混悬液中的水分，之后再用特殊溶媒或普通溶媒混悬，得到相应的缓释微粒注射剂。以上方法只是用于说明而非限制本发明。值得注意的是，悬浮药物或缓释微球(或微囊)在注射剂中的浓度因具体需要而定，可为，但不限于，10-400mg/ml，但以30-300mg/ml为优选，以50-200mg/ml最优选。注射剂的黏度为50cp-1000cp(20℃-30℃时)，优选100cp-1000cp(20℃-30℃时)，最优选200cp-650cp(20℃30℃时)。此黏度适用于18-22号注射针头和特制的内径更大的(至3毫米)注射针头。
注射剂的应用包括缓释微球或药物微粒的应用、溶媒的应用以及缓释微球或药物微粒在溶媒中悬浮后制成的注射剂的应用。
微球用于制备缓释注射剂，如混悬型缓释注射剂、凝胶注射剂、嵌段共聚物胶束注射剂。在各种注射剂中以混悬型缓释注射剂为优选。混悬型缓释注射剂是将含有效成分的药物缓释微球或药物微粒悬浮于溶媒中所得的制剂，所用的辅料为上述缓释辅料中的一种或其组合，所用溶媒为普通溶媒或含助悬剂的特殊溶媒。普通溶媒为，但不限于，蒸馏水、注射用水、生理冲液、无水乙醇或各种盐配制的缓冲液；嵌段共聚物胶束由疏水-亲水嵌段共聚物在水溶液中形成，具有球形内核-外壳结构，疏水嵌段形成内核，亲水嵌段形成外壳。载药胶束注射进入体内达到控制药物释放或靶向治疗的目的。所用药物载体为上述任意一种或其组合。其中优选分子量为1000-15000的聚乙二醇(PEG)作为胶束共聚物的亲水嵌段，优选生物降解聚合物(如PLA、聚丙交酯、聚己内酯及其共聚物(分子量1500-25000)作为胶束共聚物的疏水嵌段。嵌段共聚物胶束的粒径范围可在1-300um，但以20-200um为优选，30-150um最优选；凝胶注射剂系将生物降解聚合物(如PLA、PLGA或DL-LA和ε-己内酯共聚物)溶于某些两亲性溶媒，再加入药物与之混溶(或混悬)后形成流动性较好的凝胶，可经瘤周或瘤内注射。一旦注入，两亲性溶媒很快扩散至体液，而体液中的水分则渗入凝胶，使聚合物固化，缓慢释放药物。
溶媒的应用主要指特殊溶媒的应用在于有效悬浮、稳定和/或保护各种药物或缓释微球(或微囊)，从而制备相应的注射剂。特殊溶媒的应用会使所制得的注射剂具有更好的注射性、稳定性好及较高的黏度。
注射剂的应用是用高粘度的特殊溶媒将含药微粒，特别是缓释微粒，制成相应的缓释注射剂，从而使相应的药物能够以注射的方式输入所需药物的病人或哺乳动物体内。所注入的药物可为，但不限于，上述药物微粉或药物缓释微粒。
注射剂的给药途径取决于多种因素。对于非增生性病变，可经静脉、淋巴管、皮下、肌肉、腔内(如腹腔、胸腔、关节腔内及椎管内)、组织内、瘤内、瘤周、选择性动脉注射、淋巴结内及骨髓内注射。对于增生性病变，如实体肿瘤，虽然可经上述途径给药，但以选择性动脉、腔内、瘤内、瘤周注射为优选。
为于原发或转移肿瘤所在部位获有效浓度，也可经多种途径联合给予，如静脉、淋巴管、皮下、肌肉、腔内(如腹腔、胸腔、关节腔内及椎管内)或选择性动脉注射的同时结合局部注射。如此联合给药特别适用于对实体肿瘤。如瘤内、瘤周注射的同时结合全身注射。
本发明可以用于制备治疗人及动物的各种肿瘤的药物，主要为缓释注射剂。
本发明以抗肿瘤药物为例，通过如下试验和实施例对本发明的技术方案作进一步的描述给药途径取决于多种因素，为于原发或转移肿瘤所在部位获有效浓度，药物可经多种途径给予，如皮下、腔内(如腹腔、胸腔及椎管内)、瘤内、瘤周、选择性动脉注射、淋巴结内及骨髓内注射。以选择性动脉、腔内、瘤内、瘤周注射为优选。
本发明可以用于制备治疗人及动物的各种肿瘤的药物，主要为缓释注射剂，所指肿瘤包括起源于大脑、中枢神经系统、肾脏、肝、胆囊、头颈部、口腔、甲状腺、皮肤、黏膜、腺体、血管、骨组织、淋巴结、肺脏、食管、胃、乳腺、胰腺、眼睛、鼻咽部、子宫、卵巢、子宫内膜、子宫颈、前列腺、膀胱、结肠、直肠的原发或转移的癌或肉瘤或癌肉瘤。
本发明中的缓释微球可以用于制备治疗人及动物的各种肿瘤的缓释植入剂。
本发明所制的缓释注射剂中还可加入其它药用成分，如，但不限于，抗菌素、止疼药、抗凝药、止血药等。
通过如下试验和实施例对本发明的技术作进一步的描述
试验1、不同方式给药后氨甲喋呤的局部药物浓度比较以大白鼠为试验对象，将2×105个前列腺肿瘤细胞皮下注射于其季肋部，待肿瘤生长至1厘米直径后将其分组。每组剂量均为5mg/kg氨甲喋呤。测定不同时间肿瘤内氨甲喋呤含量(％)。结果表明，氨甲喋呤经不同方式应用后的局部药物浓度差异显著，局部给药能够明显提高并有效维持肿瘤所在部位的有效药物浓度，其中以瘤内放置缓释植入剂和瘤内注射缓释注射剂的效果最好。然而，瘤内注射缓释注射剂操作最方便、容易。不仅能够极大地提高肿瘤局部的药物浓度、降低药物在循环系统中的药物浓度、降低药物对正常组织的毒性，还能够极大方便药物注射、减少手术操作的并发症这一发现构成本发明的重要特征。以下的相关抑瘤试验进一步证实了这一点。
试验2、不同方式给药后的体内抑瘤作用比较以大白鼠为试验对象，将2×105个前列腺肿瘤细胞皮下注射于其季肋部，待肿瘤生长至0.5厘米直径后将其分为以下9组(见表2)。每组剂量均为5mg/kg氨甲喋呤和2mg/kgO6-BG。治疗后第10天测量肿瘤体积大小，比较治疗效果.
表2
以上结果表明，氨甲喋呤和顺铂经不同方式应用后的抑瘤作用差异显著，局部给药能够明显提高其抑瘤作用，其中以瘤内放置缓释植入剂和瘤内注射缓释注射剂的效果最好。然而，瘤内注射缓释注射剂操作最方便，容易。不仅疗效好，毒副作用也小。
试验3、氨甲喋呤及氨甲喋呤增效剂(缓释注射剂)的抑瘤作用以大白鼠为试验对象，将2×105个乳腺肿瘤细胞皮下注射于其季肋部，待肿瘤生长14天后将其分为阴性对照(空白)、单药治疗组、联合治疗组。药物经瘤内注射。剂量均为5mg/kg。治疗后第10天测量肿瘤体积大小，用肿瘤生长抑制率作指标比较治疗效果(见表3)。
表3
以上结果表明，所用氨甲喋呤及氨甲喋呤增效剂-铂类化合物(顺铂、卡铂、奥马铂、右奥马铂)在该浓度单独应用时对多种肿瘤细胞生长均有明显的抑制作用，当联合应用时可表现出显著的增效作用。
试验4、氨甲喋呤和氨甲喋呤增效剂(缓释注射剂)的抑瘤作用以大白鼠为试验对象，将2×105个乳腺肿瘤细胞皮下注射于其季肋部，待肿瘤生长14天后将其分为阴性对照(空白)、单药治疗组、联合治疗组。缓释植入剂经瘤内放置。剂量均为5mg/kg。治疗后第10天测量肿瘤体积大小，用肿瘤生长抑制率作指标比较治疗效果(见表4)。
表4
以上结果表明，所用氨甲喋呤及氨甲喋呤增效剂-铂类化合物(庚铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂)在该浓度单独应用时对多种肿瘤细胞生长均有明显的抑制作用，当联合应用时可表现出显著的增效作用试验5、含氨甲喋呤和氨甲喋呤增效剂(缓释注射剂)的体内抑瘤作用以大白鼠为试验对象，将2×105个胰腺肿瘤细胞皮下注射于其季肋部，待肿瘤生长14天后将其分为以下10组(见表3)。第一组为对照，第2到10组为治疗组，药物经瘤内注射。剂量均为5mg/kg。治疗后第10天测量肿瘤体积大小，比较治疗效果(见表5)。
表5
以上结果表明，氨甲喋呤及所用氨甲喋呤增效剂-拓扑酶抑制剂(喜树硷、羟基喜树硷、拓扑替康、依力替康)在该浓度单独应用时对多种肿瘤细胞生长均有明显的抑制作用，当联合应用时可表现出显著的增效作用。
试验6、氨甲喋呤和氨甲喋呤增效剂(缓释注射剂)的抑瘤作用所用的肿瘤细胞包括CNS-1、C6、9L、胃腺上皮癌(SA)、骨肿瘤(BC)、乳腺癌(BA)、肺癌(LH)、甲状腺乳头状腺癌(PAT)、肝癌等。将氨甲喋呤和氨甲喋呤增效剂按10ug/ml浓度加到体外培养24小时的各种肿瘤细胞中，继续培养48小时后计数细胞总数。其肿瘤细胞生长抑制效果见表6所示。
表6
以上结果表明，所用氨甲喋呤及氨甲喋呤增效剂-拓扑酶抑制剂(勒托替康、依托泊甙、替尼泊甙)磷酸盐)在该浓度单独应用时对多种肿瘤细胞生长均有明显的抑制作用，当联合应用时可表现出显著的增效作用。进一步实验表明，氨甲喋呤还能明显增强其它拓扑酶抑制剂的抑瘤效果，如氨柔比星、艾柔比星、罗多比星、流柔比星、佐柔比星、戊柔比星、伊达比星等。
试验7、氨甲喋呤及氨甲喋呤增效剂(缓释注射剂)的抑瘤作用以大白鼠为试验对象，将2×105个前列腺肿瘤细胞皮下注射于其季肋部，待肿瘤生长14天后将其分为阴性对照(空白)、单药治疗组(氨甲喋呤或氨甲喋呤增效剂)和联合治疗组(氨甲喋呤和氨甲喋呤增效剂)。药物经瘤内注射。剂量均为5mg/kg。治疗后第10天测量肿瘤体积大小，用肿瘤生长抑制率作指标比较治疗效果(见表7)。
表7
以上结果表明，所用氨甲喋呤及氨甲喋呤增效剂-四嗪类化合物(甲基苄肼、米托唑胺、氮烯唑胺、替莫唑胺)在该浓度单独应用时对多种肿瘤细胞生长均有明显的抑制作用，当联合应用时可表现出显著的增效作用。
试验8、注射剂粘度对缓释剂注射性的影响将氨甲喋呤溶于含不同黏度助悬剂的溶媒中，按照实施例1-16所述之方法制成不同黏度的缓释注射剂。然后以小鼠皮下注射20次的成功率(％)代表其可注射性。见表8。溶媒的黏度范围为10cp-650(20℃-30℃时)。将等量缓释微球(约2-5毫克)混悬于5毫升溶媒中，用带18号针头的5毫升注射器将之注射到小鼠皮下。每次注射的时间为1-2分钟，注射后注射器内的药物残留量大于5％为注射失败。
表8
以上结果表明，影响注射剂可注射性的主要因素为溶媒的黏度，其中，在400到650cp黏度的溶媒的成功率在50％以上。这一发现构成本发明的又一主要特征。用22号针头重复试验8，得出同样结果。
总之，所用氨甲喋呤及各种氨甲喋呤增效剂单独应用时对多种肿瘤细胞生长均有明显的抑制作用，当联合应用时可表现出显著的增效作用。因此，本发明所述的的有效成分为氨甲喋呤与任意一种氨甲喋呤增效剂的组合。含有以上有效成分的药物可制成缓释微球，进而制成缓释注射剂和植入剂，其中以与含助悬剂的特殊溶媒组合形成的混悬注射剂为优选。
缓释注射剂或缓释植入剂还可通过以下实施方式得以进一步说明。上述实施例及以下实施例只是对本发明作进一步说明，并非对其内容和使用作任何限制。

实施例1.
将70mg聚苯丙生(对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)为20∶80)共聚物放入容器中，加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，加入20mg氨甲喋呤和10mg顺铂，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含20％氨甲喋呤与10％顺铂的注射用微球。然后将微球悬浮于含1.5％羧甲基纤维素钠和0.5％吐温80的生理盐水中，制得相应的混悬型缓释注射剂。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为10-15天，在小鼠皮下的释药时间为20-30天左右。
实施例2.
加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例1相同，但所不同的是所含抗癌有效成分为(1)5-30％的氨甲喋呤；或(2)2-40％的氨甲喋呤与1-30％的顺铂、卡铂、奥马铂、右奥马铂、庚铂、洛铂、奈达铂或奥沙利铂的组合。
实施例3.
将80mg聚苯丙生(对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)为20∶80)共聚物放入容器中，加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，加入10mg氨甲喋呤和10mg喜树硷，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含10％氨甲喋呤和10％喜树硷的注射用微球。然后将微球悬浮于含15％甘露醇的生理盐水中，制得相应的混悬型缓释注射剂。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为15-25天，在小鼠皮下的释药时间为30-40天左右。
实施例4.
加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例3相同，但所不同的是所含抗癌有效成分及其重量百分比为(1)2-40％的氨甲喋呤；或(2)2-40％的氨甲喋呤与5-30％的喜树硷、羟基喜树硷、勒托替康、拓扑替康、依力替康、依托泊甙、替尼泊甙、氨柔比星、艾柔比星、罗多比星、流柔比星、佐柔比星、戊柔比星或伊达比星的组合.
实施例5.
将70mg分子量峰值为25000的聚乳酸(PLGA，75∶25)放入容器中，加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，加入15mg氨甲喋呤和15mg奈达铂，重新摇匀后真空干燥去除有机溶剂。将干燥后的含药固体组合物冷冻粉碎制成含10％氨甲喋呤和10％的奈达铂微粉，然后悬浮于含1.5％羧甲基纤维素钠的生理盐水中，制得相应的混悬型缓释注射剂。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为10-15天，在小鼠皮下的释药时间为30-35天左右。
实施例6加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例5相同，但所不同的是所含抗癌有效成分及其重量百分比为2-40％的氨甲喋呤与2-40％的顺铂、卡铂、奥马铂、右奥马铂、庚铂、洛铂、奈达铂或奥沙利铂的组合。
实施例7.
将70mg乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)放入容器中，加入100毫升二氯甲烷溶解混匀后，加入20毫克氨甲喋呤和10毫克替莫唑胺，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含20％氨甲喋呤和10％替莫唑胺的注射用微球。然后将微球悬浮于含5-15％山梨醇的注射液中，制得相应的混悬型缓释注射剂。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为10-15天，在小鼠皮下的释药时间为20-30天左右。
实施例8.
加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例7相同，但所不同的是所含抗癌有效成分为(1)2-40％的氨甲喋呤；或(2)2-40％的氨甲喋呤与2-40％的咪唑并四嗪、咪唑并哌嗪、1H-咪唑并[b]哌嗪、咪唑并吡啶、1H-咪唑并[1，2-a]吡啶、甲基苄肼、米托唑胺、氮烯唑胺或替莫唑胺的组合。
实施例9将70mg聚苯丙生(对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)为20∶80)共聚物放入容器中，加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，加入20mg氨甲喋呤和10mg依托泊甙，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含20％氨甲喋呤和10％依托泊甙的注射用微球。然后将微球悬浮于含1.5％羧甲基纤维素钠和15％山梨醇和0.2％吐温80的生理盐水中，制得相应的混悬型缓释注射剂。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为10-15天，在小鼠皮下的释药时间为20-30天左右。
实施例10加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例9相同，但所不同的是所含抗癌有效成分为(1)2-40％的氨甲喋呤；或(2)2-40％的氨甲喋呤与5-30％的喜树硷、羟基喜树硷、勒托替康、拓扑替康、依力替康、依托泊甙、替尼泊甙、氨柔比星、艾柔比星、罗多比星、流柔比星、佐柔比星、戊柔比星或伊达比星的组合。
实施例11将70mg聚苯丙生(对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)为20∶80)共聚物放入容器中，加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，加入10mg喜树硷和20mg氨甲喋呤，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含10％喜树硷和20％氨甲喋呤的注射用微球。然后将微球经压片法制得相应的缓释植入剂。该缓释植入剂在体外生理盐水中的释药时间为10-15天，在小鼠皮下的释药时间为30-40天左右。
实施例12加工成缓释植入剂的方法步骤与实施例11相同，但所不同的是所含抗癌有效成分为2-40％的氨甲喋呤与2-40％的喜树硷、羟基喜树硷、勒托替康、拓扑替康、依力替康、依托泊甙、替尼泊甙、氨柔比星、艾柔比星、罗多比星、流柔比星、佐柔比星、戊柔比星或伊达比星的组合。
实施例13将70mg分子量峰值为35000的聚乳酸(PLA)放入容器中，加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，加入10mg氨甲喋呤和20mg米托唑胺，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含10％氨甲喋呤和20％米托唑胺的注射用微球。然后将微球经压片法制得相应的缓释植入剂。该缓释植入剂在体外生理盐水中的释药时间为10-15天，在小鼠皮下的释药时间为35-50天左右。
实施例14加工成缓释植入剂的方法步骤与实施例11、13相同，但所不同的是所含抗癌有效成分为10％的氨甲喋呤与20％的咪唑并四嗪、咪唑并哌嗪、1H-咪唑并[b]哌嗪、咪唑并吡啶、1H-咪唑并[1，2-a]吡啶、甲基苄肼、米托唑胺、氮烯唑胺或替莫唑胺的组合。
实施例15加工成缓释剂的方法步骤与实施例1-14相同，但所不同的是所用的缓释辅料为下列之一或其组合a)分子量峰值为5000-30000、30000-60000、60000-100000或100000-150000的聚乳酸(PLA)；b)分子量峰值为5000-30000、30000-60000、60000-100000或100000-150000的聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物(PLGA)，其中，聚乙醇酸和羟基乙酸的比例为50-95∶50-50；c)乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)；d)10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50或60∶40的对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)共聚物(聚苯丙生)；d)FAD与葵二酸(SA)共聚物；e)木糖醇、低聚糖、软骨素、甲壳素、钾盐、钠盐、透明质酸、胶原蛋白、明胶或白蛋胶。
实施例16加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例1-15相同，但所不同的是所用的的助悬剂分别为下列之一或其组合a)0.5-3.0％羧甲基纤维素(钠)；b)5-15％甘露醇；c)5-15％山梨醇；d)0.1-1.5％表面活性物质；e)0.1-0.5％吐温20。
实施例17将80mg分子量峰值为25000的聚乳酸(PLGA，75∶25)放入容器中，加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，加入10mg奥沙利铂和10mg氨甲喋呤，重新摇匀后真空干燥去除有机溶剂。将干燥后的含药固体组合物冷冻粉碎制成含10％奥沙利铂10％的氨甲喋呤微粉，然后悬浮于含1.5％羧甲基纤维素钠的生理盐水中，制得相应的混悬型缓释注射剂。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为10-15天，在小鼠皮下的释药时间为20-30天左右。
实施例18.
加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例1-17相同，但所不同的是所含抗癌有效成分为(a)15％的氨甲喋呤；或(b)15％的氨甲喋呤与10％的顺铂、卡铂、奥马铂、右奥马铂、庚铂、洛铂、奈达铂或奥沙利铂的组合；或(c)15％的氨甲喋呤与15％的喜树硷、羟基喜树硷、勒托替康、拓扑替康、依力替康、依托泊甙、替尼泊甙、氨柔比星、艾柔比星、罗多比星、流柔比星、佐柔比星、戊柔比星或伊达比星的组合；或(d)15％的氨甲喋呤与15％的甲基苄肼、米托唑胺、氮烯唑胺或替莫唑胺的组合。
实施例19.
加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例1-18相同，但所不同的是缓释辅料选自下列之一或其组合a)聚乳酸，分子量峰值为10000-30000、30000-60000、60000-100000或100000-150000；b)聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物，分子量峰值为10000-30000、30000-60000、60000-100000或100000-150000，其中，聚乙醇酸和羟基乙酸的比例为75∶25；c)FAD与葵二酸共聚物；d)聚苯丙生中对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50或60∶40；助悬剂的黏度为100cp-2000cp(20℃-30℃时)，选自下列之一或其组合a)1％羧甲基纤维素钠；b)10％甘露醇；c)5％山梨醇；d)0.3％吐温20；e)1％羧甲基纤维素钠+0.5％土温80；f)12％甘露醇+0.5％土温80；g)1.5％羧甲基纤维素钠+10％山梨醇+0.5％土温80；h)1％羧甲基纤维素钠+15％甘露醇+0.5％土温20.
以上实施例仅用于说明，而并非局限本发明的应用。
本发明所公开和保护的内容见权利要求。


一种含氨甲喋呤的缓释注射剂由缓释微球和溶媒组成。其中缓释微球包括抗癌有效成分和缓释辅料，溶媒为普通溶媒或含助悬剂的特殊溶媒。抗癌有效成分为氨甲喋呤与选自铂类化合物、拓扑酶抑制剂和/或四嗪类化合物的氨甲喋呤增效剂的组合；缓释辅料选自聚乳酸、聚乙醇酸和羟基乙酸的共聚物、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚苯丙生、FAD与葵二酸共聚物之一或其组合；助悬剂选自羧甲基纤维素钠等；用于将抗癌有效成分或包含抗癌有效成分的缓释颗粒或微球悬浮，从而制成缓释注射剂。肿瘤注射该缓释注射剂不仅能够降低药物的全身毒性反应，同时还能选择性地提高肿瘤局部的药物浓度，增强化疗药物及放射治疗等非手术疗法的治疗效果。