专利名称：一种培养人角膜缘干细胞植片的方法组织工程学是细胞移植领域里出现的新兴交叉学科，其应用工程学和生命科学的原理发展生物替代物，通过移植重建，改善因病变而丧失的细胞功能。所述的组织工程学构建组织工程化组织和器官的基本原理和方法，是将体外培养扩增的正常细胞吸附于一种生物相容性良好，并可被机体吸收的生物支架材料上，形成细胞生物材料复合物，然后，将细胞生物材料复合物植入机体组织；器官的病变部分在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的形态和功能方面与相应器官组织相一致的组织，从而达到修复组织缺损和重建功能的目的。现代医学研究发现，角膜上皮的完整和无血管状态对维持角膜生理功能和透明性十分重要；多种致病因素可造成角膜上皮的反复缺损、糜烂、溃疡及新生血管长入，使角膜丧失完整性和透明性，致盲率较高1。角膜上皮的完整性有赖于角膜缘干细胞的增殖和分化，多种原因可造成角膜缘干细胞的缺乏或功能障碍。自从1986年Schermer等发现角膜缘干细胞位于角膜缘基底Vogt栅栏样结构内，对角膜缘肝细胞功能障碍的治疗有了许多新疗法，其中，以角膜缘上皮细胞的体外培养后移植成为研究热点。当前，大多数学者采用去上皮羊膜作为载体培养角膜缘上皮细胞2’3；其中，所述的去上皮羊膜采用感染性指标检测阴性(包括梅毒、艾滋病毒、乙肝、丙肝、戊肝及巨细胞病毒及细菌检测)的健康产妇剖宫产术后胎盘最内层的胎膜经去上皮处理，但由于目前的检测方法检测不出处于潜伏期的感染者，所以，无法完全避免受体远期感染的可能性，且制备过程麻烦，可能在取材、处理过程中遭受污染故其在临床应受限。与本发明有关的参考文献有I. Gomes JA, Dos Santos MS, Cunha MC, et al. Amniotic membrane transplantation for partial and total limbal stem cell deficiency secondary to chemical burn. Ophthalmology, 2003,110 :466-473.2. Koizumi N，Fullwood NJ，Bairaktaris G，et al. Cultivation of corneal epithelial cells on intact and denuded human amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41 :2506-2513.3.杨威，顾国贞，宋鄂等，羊膜为载体的人角膜缘上皮细胞移植治疗大鼠角膜碱烧伤的研究·中华眼科杂志，2007，43，134-141.。
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法。本发明采用生物羊膜作为载体培养角膜缘干细胞；所述的生物羊膜购自江西省科学院住友生物工程技术有限公司研制的商品化材料“瑞济”生物羊膜，其生产企业许可证号赣药管械生产许20020113号；产品注册证号国食药械(试)字2004第3061180号； 注册产品标准号=YZB/国1056-2003 ;该生物羊膜为经钴_60辐照灭菌消毒的冷冻干燥人羊膜，易于保存、方便获取、安全可靠在临床广泛使用。具体而言，本发明的以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法，其特征在于，包括以下步骤(I)组织块贴壁将修剪后的生物羊膜(上皮面向上)，平铺于插入式培养皿的聚碳酸酯膜上，将聚碳酸酯膜放入预置灭活3T3成纤维细胞的培养皿中；无菌条件下将修剪后的角膜缘组织直接放置在完整生物羊膜表面；向培养皿中加入Iml培养液；组织块表面加数滴培养液保持湿润；所用的培养液采用DMEM与F-12培养基I : I混合，加入10%胎牛血清，5 μ g/ml的胰岛素，20ng/ml的rhEGF (重组人上皮细胞生长因子)，50IU/ml的青霉素和链霉素；置于 37°C,5% C02-95%空气的培养箱中培养；培养液每2 3天更换一次；每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况；(2)包含有培养细胞的生物羊膜和去上皮羊膜的苏木素染色PBS冲洗标本一次,无水乙醇15min,苏木素5min,大量自来水冲洗,晾干、封片；(3)石蜡组织切片的HE染色取含培养细胞的组织，经固定后，常规石蜡包埋，4μπι切片；二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗；苏木素染色5min，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30s(提插数下)；自来水冲洗 15min ;置伊红液2min ;常规脱水，透明；中性树脂封片，获得人角膜缘干细胞植片。本发明所述方法的步骤(I)中，生物羊膜通常修剪为2. 5X2. 5cm2 ；本发明所述方法的步骤(I)中，角膜缘组织通常修剪为Imm2 ；本发明所述方法的步骤(3)中，二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，步骤为二甲苯I,5min — 二甲苯 II, 5min — 100% 乙醇 2min 95% 的乙醇 Imin 80% 乙醇 Imin — 75% 乙醇Imin —蒸懼水洗2min ；本发明所述方法的步骤(3)中，常规脱水，透明，步骤为95%乙醇I，min-95% 乙醇 II, Imin — 100% 乙醇 I, Imin — 100% 乙醇 II, Imin — 二甲苯石碳酸,3 : I, Imin — 二甲苯 I, Imin — 二甲苯 II，Imin0本发明的以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法，可避免受体远期感染，且制备过程简单，可减少在取材、处理过程中遭受污染，能更为安全、方便的培养角膜缘上皮细胞，促进人角膜缘干细胞植片的临床应用；所采用的生物羊膜安全性高于去上皮羊膜，且易于保存、方便获取、临床应用广泛。为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的一种以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本专利范围之内。图
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放大200倍的照片可见培养的角膜缘上皮细胞连成一片，右下角为撕开卷起的细胞层，其下为生物羊膜。图6显示了本发明中以生物羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞28天，培养细胞具有复层结构，其中，石蜡切片HE染色，放大400倍。

(II)5min — 100% 乙醇 2min 95% 的乙醇 Imin 80% 乙醇 Imin — 75% 乙醇 Imin —蒸馏水洗2min;(3)苏木素染色5min，自来水冲洗；(4)盐酸乙醇分化30s (提插数下)；(5) 自来水冲洗15min ;(6)置伊红液2min ; (7)常规脱水，透明95%乙醇(I)min —95%乙醇
(II)Imin — 100% 乙醇(I) Imin — 100% 乙醇(II) Imin — 二甲苯石碳酸(3 : I) Imin — 二甲苯(I) Imin — 二甲苯(II) Imin; (8)中性树脂封片，获得人角膜缘干细胞植片。上述实施例的结果表明，本以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法， 能避免受体远期感染，且制备过程简单，可减少在取材、处理过程中遭受污染，能更为安全、 方便的培养角膜缘上皮细胞，促进人角膜缘干细胞植片的临床应用；所采用的生物羊膜安全性高于去上皮羊膜，且易于保存、方便获取、临床应用广泛。


本发明属组织工程学领域，涉及一种以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法。本发明采用生物羊膜作为载体培养角膜缘干细胞；所述的生物羊膜为经钴-60辐照灭菌消毒的冷冻干燥人羊膜，安全性高于去上皮羊膜，且易于保存、方便获取、在临床广泛使用。本发明所述的方法，能避免受体远期感染，且制备过程简单，可减少在取材、处理过程中遭受污染，能更为安全、方便的培养角膜缘上皮细胞，促进人角膜缘干细胞植片的临床应用。