专利名称：用于包封化合物的纳米颗粒及其制备和应用的制作方法食品エ业需要技术上的不断进步从而满足新的消费者需求。纳米技术存在使食品エ业彻底地变革巨大的潜力，因为这ー技术能够包封生物活性化合物[BAC]，例如香料、维生素、矿物质、精油、抗氧化剂、益生菌等等，从而具有众多优势，举例来说，能够延长制品的保存期限；能够降低BAC的用量；能够控制其释放；能够提高其生物利用度；能够掩盖不需要的味道，等等。 当设计适用于包封BAC的载体吋，正确地选择用作涂层剂或者基质的材料是非常重要的；为此，除其他因素外，必须要考虑到剂型、毒性、将要引入制剂的产品(食物、化妆品、药物，等等)等。在食品纳米技术领域中，不推荐使用合成的聚合物，因为它们可能存在毒性问题。天然的聚合物不具有这些缺点；然而，它们的使用必然使得颗粒的制造方法更复杂；此外，在大多数情况中，难以控制获得的粒度(在许多情况中大于100 μ m)，因此消费者可能会注意到这些纳米颗粒，并且其可能会改变目标食品的感官特性。传统上，在这些材料中，蛋白质被用作BAC涂层剂。使用酪蛋白作为载体包封疏水性的BAC在食品中的应用，已有所描述(CA2649788和EP2011472)。叶酸(蝶酸单麸胺酸或者维生素B9)，包括在叶酸组中的B族水溶性维生素，对于重要的生化过程、例如DNA合成是十分重要的。缺乏叶酸与巨成红细胞性贫血、阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、内分泌失调、某种类型的癌症(结肠癌、宫颈癌、白血病、胰腺癌)、在胎儿发育过程中的神经管缺陷、在怀孕过程中的并发症以及男性不育症相关。然而，叶酸并不能通过有机体来合成；因而其必须通过不同的补充剂或者饮食来供给。尽管叶酸天然存在于食物中(例如水果和蔬菜)，但是其主要是以聚麸胺酸盐的形式，它们的生物利用度并不完全，典型地为50%或更低。因此，摄取添加有叶酸的食物可以形成一种补充性的选择，从而増加在那些叶酸的摄入低于推荐量的情况中所述维生素的摄入。然而，除了其它的因素外，因为基体效应，添加至食物中的叶酸的生物利用度并不完全(叶酸可能与食物组分相连接，由此阻止其吸收)，或者存在于食物中的任意组分降低其生物利用度。此外，当叶酸没有在肠内溶解时，其也不能被很好地吸收。通过胶囊、片剂等的方式施用含有叶酸的补充剂或者强化剂具有如下的缺点，当其由于胃酸而在胃中降解吋，叶酸会发生沉淀，转化为其较难溶解的形式，由此仅部分所供给的叶酸能够到达肠。此外，含有叶酸盐或者叶酸的食物的強化是复杂的过程，因为除其他因素外，叶酸盐和它们的衍生物以及叶酸对于温度、光和PH值变化是十分敏感的；因此它们的稳定性受到食物加工条件的影响，并且消费者可利用的维生素的生物活性量可能会极大地降低。由此，当利用所述维生素強化食物时，就需要考虑这些方面，因为最大的损失可能会发生在食物的存储和制备过程中。已经有文献描述了如何令食物富含叶酸，主要是在乳制品和谷类制品中。富含叶酸或叶酸盐的膳食补充剂(EP2002839)或者食物，例如做香肠用的肉(ES2302571)，乳制品(EP1941804)，幼(婴)儿食品(US4753926)，或者甚至是鸡肉、猪肉或牛肉罐头食品(RU2223672和RU2213493)也已有所描述。然而，在所描述的情况中，均没有考虑维生素与食物基质的可能的相互作用以及其生物利用度。现有技术还公开了ー种用于获得藻酸盐和果胶微胶囊的方法，该微胶囊含有叶酸从而避免叶酸被保护其免导致其降解的环境因素(例如胃部环境)的损害，实现叶酸其在肠内的释放。然而，所获得的微胶囊太大，其影响了目标食物的感官特性。现有技术中还设计了一种用于将叶酸包封在乳酸-羟基こ酸共聚物(PLGA)纳米微球中并实现其持续地释放的方法；尽管结果是积极的，但是该设计在食物中的应用受到聚合物使用的损害，因为其在医学和药学领域是禁止使用的。因此,有必要开发BAC包封系统,优选水溶性的,更优选酸性的水溶性BAC，例如叶酸，其全部地或者部分地克服了上述缺陷。
当前，意外地发现利用酪蛋白形成并且进ー步包括碱性氨基酸(例如精氨酸或赖氨酸)和适用于食物的金属(例如钙)的纳米颗粒，形成生物活性化合物(BAC)的一种新的包封和稳定系统，该生物活性化合物可以是水溶性和脂溶性的，优选为水溶性的，更优选为酸性的水溶性BAC，其可以应用在食物、化妆品和药物中。由此，一方面，本发明涉及纳米颗粒，其包括酪蛋白基质，碱性氨基酸和选自ニ价金属、三价金属及其组合的食品级的金属。所述纳米颗粒可被用为エ艺添加剂；它们进一歩具有包封BAC、优选水溶性BAC、更优选酸性的水溶性BAC的能力，例如B族维生素或者C族维生素，例如叶酸、泛酸和抗坏血酸，或其它的亲水性化合物，尽管它们还可以包封脂溶性BAC。所述纳米颗粒是稳定的并且能够保护BAC免于在产品加工(例如食物、药物或者化妆品)和存储过程中被外部因素降解，例如光、PH值变化、氧化等等，并且此外，当它们应用于食物中时，它们保护BAC免受胃部酸性环境的影响，防止其沿着胃道释放，从而避免BAC沉淀，并且由此避免生物利用度降低。此外，据发现所述纳米颗粒能够溶解在(模拟的)肠部介质中，促进BAC在肠内的完全释放，令其正确地吸收，并且进ー步避免了任何类型的毒性问题。有利地，所述纳米颗粒在引入的食物中是惰性的，因此避免了 BAC与基质的不同组分之间的反应，并避免降低其生物利用度。另外，本发明提供的该纳米颗粒的几个最重要的特征之ー在于使用酪蛋白作为用于保护BAC免受环境条件和胃部条件损害、促进其在肠部内释放并由此改善其生物利用度的天然载体，因为酪蛋白本身已经被证明具有营养特性，从而使得其补充了 BAC自身的有益效果。另ー方面，本发明涉及一种制造所述纳米颗粒的方法。所述方法是简单的并且能够エ业化大規模应用。有利地，所述方法不包括没有被批准为食品添加剂的合成或者反应性聚合物，最小化包含的表面活性剂或者乳化剤，并且该方法允许获得具有可控的粒度的纳米级的纳米颗粒。在ー种特定的实施方式中，所述方法进ー步包括干燥包含所述纳米颗粒的悬浮液从而获得粉末形式的制剂，随着时间的流逝維持BAC的稳定；特别地，这种类型的粉末制剂适用于在固体食物中使用。有利地，所述干燥处理在纳米颗粒保护剂的存在下执行。由此获得的包含BAC的纳米颗粒可以容易地悬浮在水介质中，保护BAC免于在溶液中降解。获得的最終制品是稳定的并且在整个长期的存储过程中保护BAC，并且其还可以应用于不同类型的食物，无论是液体食物(例如饮料等)还是固体食物。另ー方面，本发明涉及ー种包括所述纳米颗粒的组合物在食物、药物或者化妆品中的应用。实际上，所述纳米颗粒可以被结合在乳剂、凝胶和水凝胶中，从而获得适用于这ー领域的稳定的化妆品制剂。所述纳米颗粒还可以利用适用于通过局部途径施用所述纳米颗粒的赋形剂进行配制。另ー方面，本发明涉及ー种食品，包括由本发明提供的基于酪蛋白纳米颗粒的所述组合物。在ー种特定的实施方式中，所述食品为液体、半固体或者固体的形式。
图I示出了描述本发明方法的ー种特定的实施方式的示意图，其用于获得包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒。图2示出了空的酪蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。位于该图像的下部左侧边缘部分的黑条对应于lOOnm。图3示出了包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。位于该图像的下部左侧边缘部分的黑条对应于lOOnm。图4示出了包封的叶酸量和加入至该制剂中的每毫克的叶酸的酪蛋白量之间的比例。在所有的制剂中，赖氨酸和该蛋白质的重量比在加入叶酸溶液之前均为I :12。图5示出了包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒并且在制剂中具有赖氨酸的扫描电子显微镜(SEM)显微图，分别为未进行高压处理(A和B)、在IOOMPa下处理5分钟(C)、在400MPa下处理5分钟(D)和在800MPa下处理5分钟(E)。图6示出了包含叶酸的酪蛋白纳米颗粒并且制剂中具有精氨酸的扫描电子显微镜(SEM)显微图，其在400MPa下处理5分钟。图7示出了在37±1°C下的模拟胃液(SGF)中(在前2个小时中0_2小时)以及在模拟肠液(SIF) (2-24小时)中孵育后，不用高压处理时叶酸从酪蛋白纳米颗粒中的释放。该数据示出了平均值土标准偏差(ri=6)。图8示出了 37土 1°C下在模拟胃液(SGF)中(在前2个小时中0_2小时)以及在模拟肠液(SIF) (2-8小时)中孵育后，在(A) 150MPa下高压处理5分钟和在(B)400MPa下高压处理5分钟时，叶酸从酪蛋白纳米颗粒中的释放。该数据示出了平均值土标准偏差(n=4)。图9示出了在试验动物中施用不同的维生素制剂后，根据时间的血清叶酸浓度(ng/mL)变化。该结果示出了平均值土标准偏差(n=5)。A)静脉注射,剂量lmg/kg。B) ロ服途径，剂量lmg/kg :溶解在水中的未包封的叶酸(·);分散在水中的包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸(■);分散在水中的用高压处理的包封在酪蛋白纳米颗粒中的叶酸 C4)。发明详述本发明提供酪蛋白纳米颗粒以及包封生物活性化合物(BAC)的方法，从而防止它们由于外部因素而降解，例如光、PH值变化、氧化等等。定义出于帮助理解本发明的目的，在本发明内容中所使用的某些术语和表述的含义如下所述。作为在本文中使用的，“碱性氨基酸”包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。作为在本文中使用的，“酪蛋白”涉及结合蛋白，其形成约80%的全乳蛋白。在球蛋白的定义范围内，酪蛋白为磷蛋白质类型的蛋白质，可溶，具有高保水能力并且于20°C在 约4. 6的pH值下沉淀。酪蛋白由四个基本部分(a si-酪蛋白、a s2_酪蛋白、β-酪蛋白和K -酪蛋白)形成，其相互之间通过它们的氨基酸成分，它们的电荷分布以及在钙的存在下它们形成凝聚体的趋势而加以区分。在乳液中，酪蛋白形成直径为50至600nm (平均约150nm)的被称为“酪蛋白微胶粒”的大胶体颗粒。这些颗粒通过疏水相互作用并且通过由存在于酪蛋白结构中的磷酸丝氨酸自由基复合的磷酸钙而形成。在乳液中所述微胶粒形成非常稳定的胶体系统，这是形成其顔色、热稳定性以及由于凝乳酶而凝聚的主要原因之一。作为在本文中使用的，“生物活性化合物”或者“ BAC”涉及任意的脂溶性和水溶性的具有营养的、治疗的和/或化妆用的活性的化合物。根据本发明的BAC的非限制性的说明性的例子包括氨基酸、抗微生物剂、芳化剂、防腐剤、甜味剂、类固醇、药物、激素、脂类、肽、多核苷酸、多醣、蛋白质、蛋白聚糖、芳香剤、维生素等等。作为在本文中使用的，“水溶性生物活性化合物”或者“水溶BAC”涉及具有营养的、治疗的和/或化妆用的活性并且可溶于水溶液的(极易溶的、易溶解的、可溶的、难溶的或者微溶的)化合物，其根据西班牙皇家药典的标准来定义


本发明涉及用于包封化合物的纳米颗粒，及其制备和应用，该纳米颗粒包括酪蛋白基质，碱性氨基酸以及选自二价金属、三价金属及其组合的金属。所述纳米颗粒可以包封水溶性或者脂溶性的生物活性化合物。本发明可以应用于食物、制药和化妆品领域以及纳米技术领域。