专利名称：一种采油微生物降解原油过程控制方法及应用的制作方法随着工业化发展、城市化进程的深入，石油的使用量加大，而由此带来的环境污染不断加剧。石油类物质进入土壤造成土壤生态系统结构与功能的破坏，严重影响土壤通透性，使土壤肥力下降，从而毒害植物生长，破坏地表植被，造成粮食减产；石油污染海洋后可以通过食物链在人体内富集对人类健康造成严重危害，同时，石油污染物进入海洋会对水生生物的生长、发育、繁殖及整个生态系统产生巨大破坏。目前，石油污染问题已经成为世界各国普遍关注的问题。石油是各种烷烃、环烷烃和芳香族化合物所组成的混合物，其中还含有杂环化合物；其中的多环芳香族化合物(PAHs)和一些杂环类物质(如咔唑类、噻吩类、呋喃类等)具有持久性和致癌性，是公认的环境毒物。目前，主要依靠机械刮油和化学吸附等物理、化学方法进行石油类污染的治理。但是物理、化学方法成本高、投资大，并且存在二次污染，因此，这不是解决石油污染的最优方法。近年来，利用微生物修复被污染的环境引起人们的重视。因为利用微生物修复异源生物质污染有很多优点，比如污染物在原地被降解；就地处理操作简便，对周围环境干扰少；修复经费较少；人类直接暴露在这些污染物下的机会减少；较少或不产生二次污染，遗留问题少等。然而，单纯的微生物治理污染方案效果上还不是特别明显，因此有业者研究将表面活性剂与微生物共用来进行石油污染物的治理。有文献表明(表面活性物质对多环芳烃的增溶作用及微生物可利用性的影响，吴应琴，2007)，表面活性剂能促进PAHs的释放，使PAHs分配到表面活性剂胶束中或吸附到表面活性剂单体上，提高PAHs表观溶解度，从而促进与PAHs的移动，提高生物对PAHs降解的效率。表面活性剂对污染物的增溶作用和生物降解作用与所采用的表面活性剂的种类直接相关。Doong等(Journal of Hazardous Materials，200 测试了不同表面活性剂对多环芳烃增溶和生物降解作用的影响，发现所实验的表面活性剂中，HLB值较小的表面活性剂 Tritonx-IOO对多环芳烃的增溶作用较强，HLB值较大的SDS增溶作用较小；TritonX-IOO 可增强多环芳烃的生物可降解性，不同表面活性剂对污染物生物降解的影响与表面活性剂的生物降解性有关。TWeen-80是由失水山梨醇油酸单质与环氧乙烷加合而成的非离子型表面活性剂， 具有很好的增溶和乳化作用，其毒性和临界胶束浓度也较小，是较为理想的降解促进剂。宋玉芳等(应用生态学报，1999)研究了非离子表面活性剂TWeen-80对土壤中多环芳烃生物降解的影响，认为表面活性剂能够提高多环芳烃的生物可利用性，加快多环芳烃的降解速率，但表面活性剂浓度过高则可抑制微生物(指土壤中原有微生物)活性。杨建刚等(应用生态学报，2004)研究了非离子表面活性剂Tween-20对多环芳烃类化合物生物降解过程的影响，结果表明，Tween-20不仅对菲具有较好的增溶效果，而且在实验所使用的浓度范围内，TWeen-20都可以增强降解菌对菲的去除效果。虽然化学合成的表面活性剂对疏水性有机污染物的增溶作用十分有效，但鉴于一些化学表面活性剂所具有的毒性以及生物可降解性差，有可能在污染场地引入二次污染，因而人们把目光转向了天然绿色的生物表面活性剂。在微生物降解原油的过程中，生物表面活性剂起到了非常重要的作用，有报道认为生物表面活性剂可以促使烃类物质乳化、分散，并改变微生物细胞表面的疏水性，达到加强微生物与烃类物质间的亲和力，同时也起到促使烃类物质扩散进入细胞的作用，从而强化微生物对石油污染物的降解。然而，如何利用这些化学或生物表面活性剂来促使其在微生物降解石油污染物过程中发挥作用仍然是需要攻克的难题。
本发明目的在于提供一种采油微生物降解原油过程控制方法及应用，以及活性物质与微生物共用降解石油污染物的方法。本发明微生物降解原油过程控制方法，用于确定石油污染物降解剂中活性物质的种类和浓度，包括通过研究活性物质对微生物生长和原油降解的影响分析确定所用的活性物质种类、浓度、用量等参数。其中，对微生物生长的影响分析包括以下步骤1) LB斜面培养基培养Mh，活化菌株；2)活化后种子接种到LB液体培养基，培养1 后，离心收集菌体，用磷酸缓冲液洗，并重悬于此缓冲液作为种子液；3) 5%接种量将种子液接种于无机盐培养基，分别添加原油作为碳源，分别添加设定浓度的活性物质作为激活剂，振荡培养后分析菌液值，以不接种和不添加活性物质的培养基作为对照。所述原油降解的影响分析是针对原油在处理前后的表观粘度随剪切速率变化的流变曲线来进行测定分析。所述处理是指将原油与微生物菌种和活性物质共同接触并保持接触一段时间。上述方法的一个直接应用为用于确定石油污染物降解剂组配。本发明利用上述方法确定的石油污染物降解剂，包括微生物菌和活性物质，所述活性物质为选自烷基苯磺酸盐、曲拉通 X-100 ((TritonX-IOO)Jiija (TWeen20)、羧酸盐、石油磺酸盐、吐温(tween80)等化学表活剂中的一种或生物表活剂脂肽或酵母粉。其中，所述菌为选自菌004(波茨坦短芽孢杆(Brevibacillus borstelensis) CGMCC No. 2441)、菌 shp (蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) CGMCC No. 1141)和菌 019(铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC No. 208114)中的任一种，菌浓度为 2% (ν/ν) 10% (ν/ν)，优选5% (ν/ν) 0所述化学表活剂在石油污染物降解剂中浓度为100mg/l 500mg/l，优选500mg/l ；所述酵母粉在石油污染物降解剂中重量浓度为 0. 01% 0. 2%，优选0. 2%;所述生物表活剂脂肽在石油污染物降解剂中浓度为10mg/l 200mg/l，优选 50mg/l。具体的，所述石油污染物降解剂中其包含以下终浓度的组分菌004，2 10% (ν/ν)，化学表活剂500mg/l或酵母粉0. 2wt %或脂肽50mg/l，Iwt %的石油原油为碳源，KH2PO4lg/1, CaCL2. 2H20 0. 05g/l、Na2HPO4lg/1, FeSO4O. 01g/l、MgSO4. 7H20 0. 16g/l、 MnCL2O. 01g/l、NH4NO3Ig/!、NaCL 3g/l、KCL lg/1，用水配制，pH7_8。更具体的，为包括Iwt %的石油原油为碳源，KH2PO4lg/1, CaCL2. 2H200.05g/l、 Na2HPO4lg/1, FeSO4O. 01g/l、MgSO4. 7H20 0. 16g/l、MnCL2O. 01g/l、NH4NO3lg/1, NaCL 3g/l、 KCL lg/1, pH值7-8的水溶液，还含有以下所列组配之一组配一烷基苯磺酸盐500mg/l ；菌004，5% ；组配二曲拉通 X-100 ((TritonX-100) 100mg/l ；菌 019，2% ；组配三吐温(TWeen20) 200mg/l ；菌 004，4% ；组配四羧酸盐 300mg/l ；菌 004，8% ；组配五石油磺酸盐400mg/l ；菌shp，10% ；组配六吐温(tween80) 500mg/l ；菌 004,5% ；
组配七吐温(tween80) 100mg/l ；菌 004，5% ；
组配八酵母粉0. 2% ；菌004，5% ；
组配九酵母粉0. 1% ；菌004，5% ；
组配十酵母粉 0.01% ；菌 004，5% ；
组配十-一脂肽 50mg/l ；菌 004，5%。
一种石油污染物的降解方法也属于本发明，包括将以上所述降解剂加入含有石油
污染物的环境中，针对被污染的土壤，可按降解剂与土壤体积比1 50加入。通过本发明方法，使微生物降解原油过程得以控制，通过活性物质和降解菌共用的方式减少或消除环境中的石油污染。


图IA显示添加酵母粉对菌004的作用，图IB显示添加酵母粉对菌019的作用；图2A显示添加烷基苯磺酸盐对菌004的作用，图2B显示添加烷基苯磺酸盐对菌 019的作用；图3A、图;3B和图3C分别显示Tween80对菌004、菌019和菌shp的作用；图4A、图4B和图4C分别显示Tween20对菌004、菌019和菌shp的作用；图5A、图5B和图5C分别显示石油羧酸盐对菌004、菌019和菌shp的作用；图6A、图6B和图6C分别显示磺酸盐对菌004、菌019和菌shp的作用；图7A和图7B分别显示曲拉通XlOO对菌004和菌019的作用；图8A、图8B和图8C分别显示脂肽生物表活剂对菌004、菌shp和菌019的作用；图9A、图9B和图9C分别显示石油羧酸盐菌组合004、菌019和菌shp对原油流变性的影响；图10A、图IOB和图IOC分别显示脂肽菌组合004、菌019和菌shp对原油流变性的影响；图11A、图IlB和图IlC分别显示Tween20组合菌004、菌019和菌shp对原油流变性的影响；图12A、图12B和图12C分别显示Tween80组合菌004、菌019和菌shp对原油流变性的影响；图13A、图1 分别显示酵母粉组合菌004、菌019对原油流变性的影响；图14A、图14B分别显示烷基苯磺酸盐组合菌004、菌019对原油流变性的影响；图15A、图15B分别显示曲拉通XlOO组合菌004、菌019对原油流变性的影响；图16A、图16B和图16C分别显示磺酸盐组合菌004、菌019和菌shp对原油流变性的影响。



本发明一种微生物降解原油过程控制方法，包括通过研究表面活性剂对微生物生长和原油降解的影响确定所用的表活剂种类、浓度、用量等参数。本发明还提供一种石油污染物降解剂，包括采油菌和确定的表活剂；本发明还提供一种利用微生物对石油污染物的降解方法，其中包括将所确定的石油污染物降解剂注入被污染环境的过程。本发明使微生物降解原油过程得以控制，通过表活剂和降解菌共用的方式减少或消除环境中的石油污染。