专利名称：用于治疗红细胞增多症的antimiR-451的制作方法红细胞增多症，或红细胞总量(red blood cell mass)不适当的增加可以是先天性的或获得性的。原发性红细胞增多症，又称为真性红细胞增多症(polycythemiavera, PV)是一种源自已经获得了 JAK2-V617F突变的髓样祖细胞的克隆扩张的获得性疾病。在95%的PV病例中观察到的此突变诱导红血球祖先的过度成熟，导致过度循环的成熟红血球。每100，000人约有2名具有PV，其中流行性在男性中比在女性中高。观察到由于红细胞总量增加直接所致的显著发病率和死亡率，包括脑血管事件、心肌梗死、深静脉血栓形成、和肺栓塞。距诊断时的中值存活是约13年，大于40%的死亡归因于血栓形成事件。目前，此疾病的主要疗法是通过静脉切开术控制红细胞总量。为了适当治疗PV，必须开发直接降低红细胞总量而没有显著毒性的治疗性化合物。贫血(其是红细胞的正常数目减少或血液中血红蛋白的正常水平降低)是最常见的血液病症，并且可以由各种因素，包括过度失血(例如，出血)、对红细胞的过度破坏(例如，溶血)、和红细胞生成不足(例如，有缺陷的红细胞生成)引起。目前的贫血治疗经常取决于根本的原因，并且包括铁补充、外源红细胞生成素、和输血。特别地，再生障碍性贫血源自骨髓不能生成足够量的血细胞。再生障碍性贫血通常不响应常规的抗贫血治疗，并且可能需要骨髓移植物以改善状况。如此，不断需要针对贫血的其它治疗，特别是那些作用为增加血细胞生成的治疗。最近，miRNA已牵涉在许多生物学过程中，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢、和造血细胞分化等的调节。miRNA指长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白质编码RNA，其源自单独的miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子、或通常编码多种紧密相关的miRNA的多顺反子转录物。见 Carrington 等的综述(Science,第 301 卷(5631) :336-338，2003)。miRNA起靶mRNA的阻抑物的作用，这通过促进它们的降解(当它们的序列完美互补时)或通过抑制翻译(当它们的序列含有错配时)来实现。许多miRNA是组织特异性的，容许它们以组织特异性方式调节遍在表达的基因。由于这些特性，有可能的是，对miRNA的调节可以以组织特异性方式在治疗上影响复杂的疾病状态。发明概述本发明部分基于如下的发现，miR-451是正常红细胞生成需要的，并且miR-451表达量的降低导致成熟红血球的显著减少。如此，miR-451表达的 调控提供了一种治疗与异常红细胞生成有关的病症和疾病，诸如红细胞增多症和贫血的治疗性方法。因而，在一个实施方案中，本发明提供了一种在有此需要的受试者(包括人)中治疗红细胞增多症的方法，其通过对受试者施用miR-451的抑制剂来进行。在某些实施方案中，miR-451抑制剂是经修饰的或未修饰的反义寡核苷酸，其包含与整个或部分成熟miR-451序列至少部分互补的序列。在一些实施方案中，受试者的红细胞计数在施用miR-451抑制剂后降低。受试者可以诊断为、患有、或有风险形成真性红细胞增多症、原发性家族性和先天性红细胞增多症、或与红细胞增多症有关的疾病。本发明还包括一种在受试者中增加红细胞计数的方法。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用miR-451模拟物。miR-451模拟物可以是包含成熟miR-451序列、前体miR-451序列、或初级miR-451序列(primary miR-451 sequence)的多核苷酸。在一些实施方案中，自载体表达包含miR-451序列的多核苷酸。受试者可以诊断为、患有、或有风险形成红细胞不发育或某种类型的贫血，诸如再生障碍性贫血。本发明还提供了一种在受试者中调控成熟红血球与红血球前体的比率的方法。在一个实施方案中，该方法包括对所述受试者施用miR-451活性或表达的调控物。可以通过施用本发明的miR-451抑制剂实现成熟红血球与红血球前体的比率的降低。可以通过施用本发明的miR-451模拟物实现成熟红血球与红血球前体的比率的增加。在一些实施方案中，成熟红血球是⑶71阴性且TER 119阳性的。附图简述图I :对自野生型小鼠分离的指定组织中miR-451表达的Northern印迹分析。BM,骨髓；Lg，肺；Sp，脾；K，肾；Η，心脏；SkM，骨骼肌;B1，膀胱;Lv，肝。图2. A.对自野生型(WT ；miR-451+/+)、杂合子(Het ;miR-451+/_)、和 miR-451 敲除(K0 ；miR-451-/-)动物分离的骨髓组织中miR-451表达的Northern印迹(左侧小图)和定量实时RT-PCR分析(右侧小图)。使用RNU6B表达作为上样对照。B. 8周龄野生型(WT ；miR-451+/+)小鼠和缺乏两个miR-451等位基因(K0 ;miR-451_/-)的小鼠中的血细胞比容水平。图3 :于 E14. 5 的整装(whole mount)野生型(miR-451+/+)或 miR-451 敲除(miR-451-/-)胚胎。箭头标示胎儿肝。miR-451敲除胚胎展现出苍白和胎儿肝大小的缩小。图4 :A.交配后14. 5和16. 5天对自野生型(miR-451+/+)、miR-451杂合子(miR-451+/-)、和miR-451敲除(miR-451-/-)动物分离的红血球的流式细胞术分析。在y轴上显示⑶71+细胞，而在X轴上显示TER119+细胞。B.分别代表在16. 5d. p. c.时来自WT (miR-451+/+)、miR-45IHet (miR-451+/-)、和 miR-45IKO(miR-451-/-)动物的未成熟的和成熟的红血球的III和IV区中红血球的百分比。图5 :以5X(左侧小图)或40X(右侧小图)放大的自成年野生型(miR-451+/+)或miR-451敲除(miR-451-/-)小鼠分离的脾的组织学切片。用苏木精和曙红对切片染色。miR-451敲除脾展现出红血球前体的显著扩张。图6· A.对自成年野生型(miR-451+/+)、miR-451 杂合子(miR-451+/-)、和miR-451敲除(miR-451-/-)动物分离的骨髓的流式细胞术分析。在y轴上显示⑶71+细胞，而在X轴上显示TERl 19+细胞。B.来自野生型(miR-451+/+)、miR-451杂合子(miR-451+/-)、和miR-451敲除(miR-451-/-)动物的骨髓组织中CD71-/TER119+成熟红血球(IV区)的百分比。图7.苯肼(PHZ)溶血应激研究后miR-451野生型(WT)和敲除(KO)动物的血细胞比容。miR-451动物展现出在产生高红血球生成率中的缺陷。图8.A.显示YWHAZ中针对miR-451 (SEQ ID NO: 3)的不同物种间的保守3’-UTR 结合位点(SEQ ID NO: 11-14)的示意图。miR-451种子区以红色突出显示。B.实时RT-PCR分析显示与野生型(WT)动物相比miR-451敲除(KO)动物中YWHAZ转录物的显著上调且编码14-3-3蛋白的其它转录物无显著变化。图9 :miR-451对红血球分化的可能的调节途径的示意图。miR-451可以抑制YWHAZ (即编码蛋白伴侣分子14-3-3zeta的基因)的表达，由此破坏自生长因子受体的下游信号传导。图10. A.来自自静脉内注射错配对照反义寡核苷酸(mm-451)或与成熟miR-451具有互补序列的反义寡核苷酸(anti-451)的小鼠分离的骨髓的Northern印迹分析。B.对自注射错配对照反义寡核苷酸(mm-451)或祀向miR-451的反义寡核苷酸(anti-451)的动物分离的骨髓的流式细胞术分析。在I轴上显示⑶71+细胞，而在X轴上显示TERl 19+细胞。C.分别代表未成熟的和终末分化的红血球的II和IV区中的红血球百分比。图11 antimiR-451在体内阻抑miR-451表达。对自用盐水、25mg/kg错配物、或25mg/kg antimiR-451处理的动物的骨髓收获的RNA的Northern印迹分析揭示仅在antimiR处理组中阻抑成熟的miR-451。展现出总RNA的经溴化乙啶染色的丙烯酰胺凝胶作为上样对照显示。每道代表单独的动物。图12:antimiR-451在PV的异种移植物模型中降低血细胞比容。对用antimiR-451 (antimiR)或错配antimiR(错配物)处理的移植有用野生型人JAK2激酶(WT)或组成性活性JAK2-V617F(VF)感染的干细胞的小鼠的血细胞比容的分析揭示了仅在VF-antimiR组中的血细胞比容降低。对WT-错配物、WT-antimiR、和VF-错配物，n=l。对于 VF-antimiR, n=4。图13 antimiR-451削弱人⑶34阳性造血细胞中的红系(erythroid)分化。用antimiR-451或错配antimiR核转染(nucleofect)人⑶34+干细胞。容许这些细胞自发分化10天，此时通过流式细胞术分析红血球分化。就红血球标志物⑶71和Terll9染色细胞。最多分化的红血球在4区(R4)中，而不太分化的红系细胞在2区(R2)中。每个区中门控的百分比在各自的门内列出。清楚的是，在与经错配antimiR核转染的细胞相比时，用antimiR-451对这些细胞的核转染降低红系分化。发明详述本发明部分基于如下的发现，即miR-451是哺乳动物红血球成熟需要的。缺乏两个miR-451等位基因的小鼠展现出成熟红血球的几乎完全消除，而杂合子动物具有成熟红血球的正常水平的大约一半。因此，可以采用miR-451表达的调控来调节成熟红血球或红细胞生成。因而，本发明提供了治疗与成熟红细胞的异常水平有关的疾病和病症，诸如红细胞增多症和贫血的方法。在人类中，miR-451自染色体17的基因间区与miR-144—起表达。人和小鼠的miR-451的pre-miRNA编码序列在下文分别以SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:2显示。SEQ IDN0:3中提供了成熟miR-451序列。SEQ ID NO: 15中提供了小鼠pri-miR-144/451序列。预测的pri-miR-144/451序列位置在染色体17上在基因组坐标24212513-24212762处(Saini等(2008)BMC Genomics,第9卷564,通过提及而将其收入本文)。本发明还包括人pri-miR-144/451序列的用途。人pre-miR_451(SEQ ID NO: I)5， -CUUGGGAAUG GCAAGGAAAC CGUUACCAUU ACUGAGUUUAGUAAUGGUAA UGGUUCUCUU GCUAUACCCA GA-3’小鼠pre-miR_451(SEQ ID NO:2)5， -CUUGGGAAUG GCGAGGAAAC CGUUACCAUU ACUGAGUUUAGUAAUGGUAA CGGUUCUCUUGCUGCUCCCA CA-3’成熟的miR-451 (SEQ ID NO:3)5， -AAACCGUUAC CAUUACUGAG UU-3’小鼠pri-miR-144/451 (SEQ ID NO: 15)5， -CAGGCTCTCCCTGTGCAGAGGATTCCCTGGACGAGGCTCCAGCTCCACTCCAGCTCCAGGTAAGCAGTCCTTGGAGTGGCTGTCAGCCTGCTTATAGGTCTGCCCAGAGGGAAGCTCCTGCCTCACAACTTCGTTTCTGCCTGTAACTCTGGATCCCTAAGAGACCCGAGTAGACCTTAGCTTCCTTCTCTAAGCCACCTGGGGTTATCCTGGACCACAGGATCAGGGAGATGCTGCTCTGGGAGGGAAGTGGAGGAGCAGAGGTAGGGACTTAGGTGTCCCTGACTGACCCTGAGCCAATCCCCTGGCTCACTCCAGGCCTGCTGCTCACCTCCTCCTCCAGGACCTTGGCTGGGATATCATCATATACTGTAAGTTTGTGATGAGACACTACAGTATAGATGATGTACTAGTCTGGGTACCCCACCTCCAGAGCCTGCCTGGTTTGCAGCAGAGATGCAGAAGTACACGGGCTCACTGCTCGGCCTAATCAAGCCTGCTGACAGCTGTGGCACTTGGGAATGGCGAGGAAACCGTTACCATTACTGAGTTTAGTAATGGTAACGGTTCTCTTGCTGCTCCCACAAACTGTGCCAAGAAGAGCTCATGACCCTGGAGCAGACTGCTGGAAGAAAAGGACACCCAGGCTGACAAGAGAATGGGGTTGGGGGAAAGGGTACATTTTCCTCTTCACTGTGCCAAAGAAATAAAAGATAAGAATAAGAGCACTTGTCATTTAACTTTATTAGCATCCGAGGCTGGGTGGTTGGATG-3’应当理解，在需要脱氧核糖核苷酸的实施方案中使用本文中所公开的RNA序列时，用胸苷残基替换尿苷残基。类似地，在需要核糖核苷酸的实施方案中使用本文中所公开的DNA序列时，用尿苷残基替换胸苷残基。在一个实施方案中，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗红细胞增多症的方法，其通过施用miR-451活性或表达的抑制剂来进行。如本文中所使用的，术语“受试者”或“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类(例如，黑猩猩和其它猿和猴物种)、家畜(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，犬和猫)、实验室动物(例如，啮齿类诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、和禽类(例如，家养的、野生的和猎禽诸如鸡、火鸡及其它家禽(gallinaceous birds)、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，受试者是人。红细胞增多症是一种以红细胞总量增加为特征的骨髓增生性病症。认为原发性红细胞增多症或真性红细胞增多症是导致红细胞过度生成的骨髓异常引起的。本发明的方法提供了红细胞增多症的治疗，其通过对有此需要的受试者施用miR-451抑制剂，由此导致成熟红血球或红细胞的数目减少来进行。在一个实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，受试者的红细胞计数在施用miR-451的抑制剂后降低。例如，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，受试者的红细胞计数在施用miR-451抑制剂后可以降低约10%、20%、30%、或约40%。在另一个实施方案中，受试者的红细胞计数降低至正常的红计数水平内。正常的红细胞计数是约4. 2至约5. 4百万个细胞/ μ L(对于女性)、约4. 7至约6. I百万个细胞/ μ L (对于男性)、和约4. 6至约4. 8百万个细胞/ μ L (对于儿童)。在某些实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成真性红细胞增多症、原发性家族性和先天性红细胞增多症、或与红细胞增多症有关的疾病。与红细胞增多症有关的疾病包括但不限于肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心力衰竭、睡眠呼吸暂停、多发性骨髓瘤、或肺动脉高压。如此，本发明还涵盖通过施用miR-451抑制剂治疗与红细胞增多症有关的疾病的方 法。在另一个实施方案中，本发明包括通过施用miR-451抑制剂治疗或预防受试者中的其它骨髓增生性病症的方法。例如，在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗特发性血小板增多症(又称为特发性血小板增多(essentialthromobocytosis))的方法,包括对受试者施用miR-451抑制剂。特发性血小板增多症是一种以血小板的过度生成为特征的疾病。在一些实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者中的血小板计数相比，受试者的血小板计数在施用miR-451抑制剂后降低。在其它实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，施用miR-451抑制剂后受试者中发生脾扩大的降低。在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗或预防骨髓纤维化的方法，包括对受试者施用miR-451抑制剂。患有原发性或特发性骨髓纤维化的患者的骨髓用胶原结缔组织纤维替换，引起进行性全血细胞减少症(progressivepancytopenia)。在某些实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比,受试者的骨髓的纤维含量在施用miR-451抑制剂后降低。在其它实施方案中，与没有接受miR-451抑制剂的受试者相比，受试者的红细胞、白细胞、和/或血小板计数在施用miR-451抑制剂后增加。在又一个实施方案中，本发明提供了在受试者中预防或治疗白血病的方法，其通过施用miR-451抑制剂进行。在一些实施方案中，受试者诊断为、患有、或有风险形成真性红细胞增多症，并且有风险形成白血病。在某些实施方案中，白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在其它实施方案中，白血病是慢性骨髓性白血病(CML)。在又一些实施方案中，白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或急性骨髓性白血病(AML)。miR-451活性或表达的抑制剂可以是靶向整个或部分成熟miR-451序列的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其组合。优选地，反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰(例如，糖或主链修饰)。例如，合适的反义寡核苷酸可以包含一个或多个“构象约束性”或二环糖核苷修饰(BSN)，所述修饰对含有BSN的寡核苷酸与其互补微小RNA靶标链间形成的复合物赋予增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个“锁定核酸”。锁定核酸(LNA)含有2’-O，4’-C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖模块为“锁定”构象。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个2，，4，-C-桥接的2，脱氧核糖核苷(CDNA,结构B)。见例如美国专利No. 6，403，566和Wang 等(1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,第 9 卷1147-1150,通过提及而将这两篇都完整收入本文。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的核苷，其具有结构C中所显示的结构。靶向miR-451的反义寡核苷酸可以含有BSN (LNA,CDNA等)或其它经修饰的核苷酸和核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。本发明提供了治疗与异常红细胞生成有关的疾病和病症的方法。具体地，本发明提供了用于治疗受试者中的红细胞增多症的方法，其通过施用miR-451抑制剂进行。还公开了通过施用miR-451模拟物在受试者中增加红细胞计数和治疗贫血的方法。