碱基经修饰的寡核苷酸的制作方法[0001]本申请要求2010年11月5日提交的美国临时申请61/410，672的优先权，将其全部内容并入本文作为参考。[0003]微RNA(miR)牵涉在包括心脏功能的调节和维持在内的多种生物学过程中(VanRooij et al./iMicroRNAs:Powerful New Regulators of Heart Disease and ProactiveTherapeutic Targets, ^J.Clin.1nvest.117(9):2369-2376(2007) ；Chien KR,“MolecularMedicine:MicroRNAs and the Tell-tale Heart,，^Nature447:389-390 (2007))。因此，miR代表用于病症包括如心脏肥大、心肌梗塞、心力衰竭、血管损伤和病理性心脏纤维化等的一类相对新型的治疗靶标。miR是长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白质编码RNA，并通过促进它们的降解而充当靶标mRNA的阻抑物(此时它们的序列完全互补)，或者通过抑制翻译而充当靶标mRNA的阻抑物(此时它们的序列含有错配)。机制包括将成熟miRNA链结合至RNA诱导性沉默复合物(RISC)中，在那里它通过碱基对互补性与它的靶标RNA联入口 ο[0004]miRNA功能可通过反义多核苷酸或者通过模拟miRNA功能(“miRNA模拟”)的多核苷酸而进行治疗靶向。然而，在治疗上用基于寡核苷酸的药物靶向miRNA遇到数个挑战，包括RNA-结合亲和力和 特异性、细胞摄取的效力和核酸酶抗性。例如，当将多核苷酸引入完整细胞中时，它们被核酸酶攻击并降解，导致活性损失。尽管已经制备了多核苷酸类似物以试图避免它们的降解(例如，通过2’取代)(Sproat et al., Nucleic AcidsResearchl7:3373-3386 (1989))，但是所述修饰经常影响多核苷酸的预期生物作用的效力。这种降低的效力在各种情况中可能是由于经修饰的多核苷酸不能与靶标RNA形成稳定双链体和/或由于与细胞机构(cellular machinery)的相互作用的损失。其它修饰包括使用锁定的核酸，其具有改善RNA-结合亲和力的潜力(Veedu et al., “Locked Nucleic Acidas a Novel Class of Therapeutic Agent, ” RNA Biology6:3，321-323(2009))。[0005]用于miRNA抑制剂的寡核苷酸化学模式或者修饰具有改善抑制剂的递送、稳定性、效力、特异性，和/或毒性分布的潜力，并因此在治疗背景中为有效靶向miRNA功能所需要的。

[0006]本发明涉及寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一个具有2’修饰的核苷酸和至少一个具有氨基羰基修饰的碱基的核苷酸，以及涉及包含所述经修饰的寡核苷酸的药物组合物，和使用和合成这些寡核苷酸的方法。
[0007]在一个方面，本发明提供寡核苷酸，其包含至少一个具有2’修饰的核苷酸和至少一个具有氨基羰基修饰的碱基的核苷酸。在多个实施方案中，所述寡核苷酸提供的优点中包括在双链体结合亲和力方面中的优点，例如在RNA敲低中的效力。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与人miRNA的核苷酸序列至少基本互补的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述寡核苷酸至少基本上与非miRNA的哺乳动物转录体(transcript)互补，并因此可用于基因表达的反义抑制。在其它实施方案中，所述寡核苷酸包含人miRNA序列，并因此模拟miRNA功能。在其它实施方案中，所述寡核苷酸是使用任何常规平台体外检测或者量化样品中的核酸的检测探针。
[0008] 碱基修饰为氨基羰基，例如甲酰氨基(carboxamino)、氨基甲酰基(carbamoyl)或者碳酰胺(carbamide)基团。在各个实施方案中的修饰位于嘧啶碱基的C_5位或者嘌呤碱基的C-8位。本发明寡核苷酸的修饰用氨基羰基含有基团或者取代基，非限制性地，所述基团或者取代基可为C1-C18烷基、C1-C18烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，和-(CH2) ^NR1R2,其中η为1-6的整数以及R1和R2独立地为H或者C1-C6烷基。示例性部分包括哌啶、哌嗪、吗啉代、或者咪唑，所述示例性部分中的每个可为取代的或者未取代的。在其它实施方案中，所述取代基为C4-C20烷基或者烯基、苯基，或者胺基团。
[0009]所述寡核苷酸还包含至少一个具有2 ’修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述2 ’修饰可独立地选自C1-6烷基、2’ O-烷基(C1-C6)、F、Cl、NH2, CN，或者SH。其它潜在的2’修饰描述在本申请的其它部分中。示例性2’修饰为2’ Ο-Me，其可与碱基修饰一起提供寡核苷酸的Tm的协同增加。在其它实施方案中，至少一个核苷酸具有2’修饰，其为将糖锁定为C3内向构型的2’ -4’桥。未经修饰的2’位置可为氢。
[0010]具有经修饰的碱基的核苷酸的数目可发生变化，但是在某些实施方案中为至少25%的核苷酸，或者至少50%的核苷酸，或者至少75%的核苷酸或者100%的核苷酸。在一些实施方案中，所述Tm的增加可用相对少的碱基经修饰的核苷酸如少于50%的核苷酸或者少于25%的核苷酸来实现。在一些实施方案中，所述寡核苷酸仅含有1、2、3或者4个碱基经修饰的核苷酸。在这些实施方案中，碱基经修饰的核苷酸可为嘧啶碱基如尿苷或者胸腺嘧啶，和/或可含有2’修饰如2’ O’ Me0即，寡核苷酸(例如，具有约16个核苷酸)可单一结合具有碱基修饰和2’OMe修饰的核苷酸，未修饰的2’位置为氢，或者可选择地，独立选自LNA。
[0011]在某些实施方案中，所述寡核苷酸还包含骨架化学如帽修饰(capmodifications)和硫代憐酸酯连接物(phosphorothioate linkages)。
[0012]本发明包括以下发现:当结合至反义寡核苷酸中时，新的碱基经修饰的2’ -OMe-嘧啶显示出与它们互补序列的双链体增强的结合亲和力。另外，这些具有硫代磷酸酯骨架修饰的嘧啶碱基经修饰的2’ -OMe核苷酸在细胞培养中显示出抗它们的微RNA靶标序列的生物学活性，甚至在不使用转染试剂的情况下也是如此。本申请通过使用在心脏组织中显示靶标miRNA敲低的体内系统模型也证实了体内活性。
[0013]在另一方面中，本发明提供了减少或者抑制细胞中RNA表达或者活性的方法、预防或者治疗受试者中的与RNA或者其表达相关或者由RNA或者其表达介导的病症的方法、使用本申请所述的碱基经修饰的寡核苷酸的方法。



[0015]图2显示出用于结合至寡核苷酸中的经修饰的单体核苷和相应的亚磷酰胺的合成。
[0016]图3说明通过图2中的方案合成的亲水和疏水核苷修饰物，并显示在寡核苷酸中的一些示例性结合模式。
[0017]图4将数个碱基修饰的Tm测量值相对于LNA/DNA、2’_0Me硫代磷酸酯和DNA寡核苷酸进行比较。所显示的为碱基修饰模式。
[0018]图5是当与未修饰的miR_208a RNA形成双链时，经修饰的抗-miR_208a的实验Tni测量值的表。所有寡核苷酸含有硫代磷酸酯连接物；+U代表具有2’OMe的碱基修饰的核苷酸;m代表2’ OMe, yU代表C18碱基修饰和2’ OMe核糖；1代表LNA修饰；d代表DNA。
[0019]图6示出在不使用脂质转染试剂的情况下，在原代新生大鼠心肌细胞中由经修饰的抗miR-208a引起的miR_208a敲低。
[0020]图1示出叠加在bMHC水平上的图6中的miR_208a敲低数据。
[0021]图8是在C57BL/6小鼠中碱基修饰的寡核苷酸的体内效力图。该图示出一些经修饰的寡核苷酸相对于盐水注射的倍数变化。
[0022]图9示出对于磷酸酯和硫代磷酸酯骨架，碱基修饰和糖修饰的累积效应。
[0023]图10是Λ Tm对碱基修饰和2’修饰的数目的图，并显示协同效果。
[0024]图11是就修饰数目和骨架化学而言，选择的碱基修饰的Tni效果图。

[0025]本发明涉及寡核苷酸，其包含至少一个具有2’修饰的核苷酸和至少一个具有氨基羰基修饰的碱基的核苷酸。本发明还涉及这些寡核苷酸的使用方法和合成方法。
[0026]核苷碱基修饰的研究在很大程度上限于对于基因表达的影响的研究。某些核碱基衍生物(尤其是C-5丙炔化嘧啶)仅呈现针对DNA/RNA双链体的亲和力/双链体稳定性的小幅提高(Znosko et al.，J.Am.Chem.Soc.，125(20): 6090-60972003))。由于疏水性或者位阻效应的潜在竞争性影响，更复杂的侧链官能团(除了已知的嵌入剂)被认为不太可能提高寡核苷酸亲和力(Hashimoto et al., J.Am.Chem.Soc., 115 (16): 7128—7134 (1993))。类似于糖替代物(sugar alteration),碱基修饰可潜在地改变携带所述修饰的寡核苷酸的总体疏水性和氢键特性，并甚至可导致非规范碱基配对相互作用(Vaught etal.，J.Am.Chem.Soc.，132 (12):4141-4151 (2010))，这是一种对于序列特异性RNA抑制而言不希望的作用。
[0027]在一个方面，本发明提供寡核苷酸，其包含至少一个具有2’修饰的核苷酸和至少一个具有氨基羰基修饰的碱基的核苷酸。在不同实施方案中，所述寡核苷酸提供的优点包括在双链体结合亲和力中的优点，例如在RNA敲低中的效力。
[0028]在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少基本上与人miRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述寡核苷酸与非miRNA的哺乳动物转录体基本互补或者完全互补，并因此可用于基因表达的反义抑制。在其它实施方案中，所述寡核苷酸包含足以模拟miRNA功能的人miRNA的序列。在其它实施方案中，所述寡核苷酸是使用任何常规平台如微阵列或者其它基于杂交的平台体，用于外检测或者量化样品中的核酸的检测探针。
[0029]在一些实施方案中，所述寡核苷酸在长度上为约6至约22个核苷酸。本申请披露的具有碱基、糖和/或骨架修饰中的一个或者多个的寡核苷酸可为，例如，长度上为8-18个核苷酸，或者长度上为12-16个核苷酸。在某些实施方案中,所述寡核苷酸在长度上为约8个核苷酸，在长度上为约9个核苷酸,在长度上为约10个核苷酸,在长度上为约11个核苷酸，在长度上为约12个核苷酸，在长度上为约13个核苷酸，在长度上为约14个核苷酸，在长度上为约15个核苷酸,或者在长度上为约16个核苷酸。例如,在寡核苷酸祀向miR-208a的情况下，寡核苷酸可具有序列CTTTTTGCTCGTCTTA(序列号:64)。
[0030]所述碱基修饰通常为氨基羰基，例如甲酰氨基、氨基甲酰基，或者碳酰胺基团。在各个实施方案中，所述修饰位于一个或者多个嘧啶碱基的C-5位，和/或一个或者多个嘌呤碱基的C-8位。本发明的寡核苷酸的修饰用氨基羰基含有基团或者取代基，非限制性地，所述基团或者取代基可为C1-C18烷基、C1-C18烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，和-(CH2)^NR1R2，其中η为1-6的整数以及R1和R2独立地为H或者C1-C6烷基。
[0031]例如，在一些实施方案中，所述基团或者取代基为含氮的杂环，例如，哌啶、哌嗪、吗啉代，或者咪唑，其中的每个可为未取代的或者取代有I个、2个,或者3个烷基或者烯基取代基(例如，C1-8或者C1-4)。实例包括2-乙基、1-甲基-咪唑、3-丙基咪唑，和丙基吗啉代，其示于图1中。在其它实施方案中，所述基团或者取代基为碳环基，例如环烷基(例如，C5-C8)或者苯基，其可任选取代有一个或者多个(例如，1、2，或者3)烷基或者烯基取代基(例如，C1-8或者C1-4)。实例包括图6中所示的苄基。在其它实施方案中，所述基团或者取代基为例如具有I个或者2个烷基或者烯基取代基(例如，C1-8，或者C1-4)的仲胺或者叔胺。实例包括丙基二甲基氣基和乙基二甲基氣基，如图1中所不。在一些实施方案中，所述修饰用氨基羰基含有亲脂或者亲水性取代基，以及在一些实施方案中，所述取代基为阳离子取代基。实例包括图1中所示的C6和C18烷基。在一些实施方案中，所述基团或者取代基通过任选具有1-4个碳单元的连接基团的甲酰氨基连接物(carboxamino linkage)与嘧啶碱基的C5位结合。所述基 团或者取代基可如本申请其它部分所述。
[0032]在一些实施方案中，所述碱基修饰含有在生理条件下带正电荷，并任选具有多个正电荷的基团，例如哌嗪。也可使用伯、仲和季胺作为适合的碱基修饰。在多个实施方案中，所述碱基修饰含有肽连接物，其更有可能被代谢成较小毒性的核碱基(nucleobase)。
[0033]在一些实施方案中，将所述碱基修饰的核苷酸结合在序列中间。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸不结合在5’和3’端的最后1、2，或者3个核苷酸处。在生理条件下为阳离子的部分可使Tm大量提高。特别地，pKa为6.5-7.5的咪唑和吗啉衍生物提供大量的结合和生物学活性。三烷基胺也被证实在本申请中是有效的。其它感兴趣的阳离子种类包括胍型衍生物和肼或者羟胺。还值得注意的是取代的哌嗪，取代的哌嗪部分由于相似的pKa，经常在药理学上起类似于吗啉的作用，但是所述取代的哌嗪部分具有2个阳离子中心。疏水取代如苄基和烷基部分也可增加Tm、提供核酸酶抗性和/或帮助细胞溶质递送。
[0034]根据本发明，生物学活性和Tm的增加可部分地由于j:含结合(enthalpic binding)增加，经修饰的寡核苷酸因此具有提高错配辨别力的潜力，并由此可作为探针用于诊断应用。
[0035]寡核苷酸还包含至少一个具有2’修饰的核苷酸。本申请使用的术语“2’修饰”包括非H或者OH的任何2’基团。例如，2’修饰可独立选自C1-6烷基、2’ O-烷基(C1-C6)、F、Cl、NH2, CN或者SH。其它潜在的2’修饰描述在本申请的其它部分。示例性2’修饰为2’ Ο-Me，其可与碱基修饰一起(例如，当结合在相同核苷酸中时)使寡核苷酸的Tm协同增加。在其它实施方案中，至少一个核苷酸具有2’修饰，该2’修饰为2’ -4’桥，将糖锁定为C3内向构型。
[0036]在这些或者其它实施方案中，寡核苷酸含有选自烷基、烯基、炔基，和烷氧基烷基的2’修饰，其中所述烷基(包括烷氧基的烷基部分)、烯基和炔基可为取代的或者未取代的。所述烷基、烯基，和炔基可为Cl-ClO烷基、烯基或者炔基，例如C1、C2，或者C3。烃取代基可包含I个或者2个或者3个非碳原子，其可独立选自N、0，和/或S。2’修饰还可包含O-烷基、O-烯基，和O-炔基形式的烷基、烯基，和炔基。
[0037]根据本发明，其它示例性2’修饰包括2’ -O-烷基(C1-3烷基，例如2’ OMe或者2’ OEt)、2’_0_ 甲氧基乙基(2’ ~0~Μ0Ε)、2，~0~ 氣某丙某(2’_0_ΑΡ)、2’_0_ 二甲基氣基乙基(2’-0-DMA0E)、2’-0-二甲基氨基丙基(2’-0-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’ -0-DMAE0E)，或者 2’ -O-N-甲基乙酰氨基(2’ -0-ΝΜΑ)取代。
[0038]寡核苷酸可具有数个具有所述碱基修饰的核苷酸，例如I至约10个，或者约2至约9个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸含有(准确地)1、2或者3个具有经修饰的碱基的核苷酸。所述寡核苷酸也可独立地具有数个在2’位被修饰的核苷酸。即，碱基修饰的核苷酸也可含有所述的2’修饰，例如2’ OMe修饰。在一些实施方案中，至少一个或者两个核苷酸具有经修饰的碱基和经修饰的2’位，所述经修饰的碱基和经修饰的2’位各自如上所述。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含具有图1中所示的碱基修饰并具有2’OMe修饰的核苷酸。所述寡核苷酸在某些实施方案中准确地具有I个、2个，或者3个这种经修饰的核苷酸。
[0039]在2’修饰为2’_4’桥的情况下，2’修饰可为锁定的核酸(LNA)。LNA例如描述在美国临时申请61/495，224、美国专利6，268，490、美国专利6，316，198、美国专利6，403，566、美国专利6，770，748、美国专利6，998，484、美国专利6，670，461，和美国专利7，034，133中，将所有这些文献的全部内容并入本文作为参考。LNA为经修饰的核苷酸或者核糖核苷酸，其在核糖的糖部分的2’和4’碳之间含有额外的导致"锁定的"构型的桥，和/或二环结构。在一个实施方案中，所述寡核苷酸含有一个或者多个具有下面结构A所示的结构的LNA。替代地或者另外地，所述寡核苷酸可含有一个或者多个具有下面结构B所示的结构的LNA。替代地或者另外地，所述寡核苷酸含有一个或者多个具有下面结构C所示的结构的LNA。
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