用寡核苷酸靶向改变dna的制作方法[0002]遗传修饰是在活细胞的遗传物质中特意制造改变的方法。通常目的是修饰细胞，或细胞形成部分的生物体或细胞可再生的生物体的遗传编码生物性质。这些改变可采用以下方式:删除部分遗传物质、添加外源遗传物质、或改变遗传物质中存在的核苷酸序列，例如用一个碱基取代另一个碱基。[0003]20多年前已经知道遗传修饰真核生物的方法，并发现已广泛应用于植物、人和动物细胞和微生物以改善农业、人类健康、食物品质和环境保护领域。[0004]常见的遗传修饰方法由以下步骤组成:向细胞基因组添加外源DNA片段，这可以赋予该细胞或生物体一种新特性，该性质超过并优于已存在基因编码的特性(包括从而抑制已存在基因表达的应用)。 [0005]虽然这些方法可能在向靶标提供需要的性质有一定功效，但是这些方法不是很精确。例如，无法控制外源DNA片段插入的基因组位置(进而控制最终表达水平)。另外，所需效果的自身体现必须超过原始和良好平衡基因组所编码的天然性质。相反，导致预定基因组基因座中核苷酸的增加、缺失或转化的遗传修饰的方法能够精确并可控地修饰现有基因。[0006]寡核苷酸介导的靶向核苷酸交换(TNE )是一种基于向真核细胞递送(合成)寡核苷酸(由短延伸段核苷酸段和/或类似DNA的沃森克里克碱基配对性质，但是化学上与DNA不同的核苷酸部分组成的分子;(Alexeev和Yoon, 1998)； (Rice等，2001)； (Kmiec, 2003))的方法。[0007]通过在寡核苷酸的同源序列上特意设计错配核苷酸，该错配核苷酸可能诱导改变该核苷酸杂交的基因组DNA序列。这个方法允许转化靶标中一个或多个核苷酸，并且可能，例如，应用于现有基因中以产生终止密码子，导致它们功能的破坏，或者产生密码子改变，导致基因编码的蛋白质具有改变的氨基酸组成(蛋白质工程)。[0008]靶向核苷酸交换(TNE)已经在包括植物、动物和酵母细胞的许多生物体中描述，也称为寡核苷酸诱变(ODM)。
[0009]TNE的第一批例子使用来自动物细胞的嵌合DNA:RNA寡核苷酸(参见(Igoucheva等，2001))。使用嵌合DNA:RNA寡核苷酸的TNE也在植物细胞中证明(Beetham等，1999 ；Kochevenko 和 Willmitzer, 2003 ；0kuzaki 和 Toriyama, 2004 ；Zhu 等，2000 ；Zhu 等，1999)。通常，在非选择性染色体基因座上实际应用TNE时，植物和动物研究中报告的频率都太低。发现使用嵌合寡核苷酸的TNE也难以重复(Ruiter等，2003)，从而需要寻找其它寡核苷酸设计以产生更可靠的结果。
[0010]多个实验室已聚焦于在TNE中使用单链(SS)寡核苷酸上。已发现其在植物和动物细胞中提供了更多可重复的结果(Liu等,2002) (Parekh-Olmedo等,2005) (Dong等,2006)。然而，在细胞，具体是较高等生物体(如植物)的细胞中使用TNE所面临的最大问题还是迄今为止报道的相对低的效率。在玉米中，报道的转化频率为lxl0_4 (Zhu等，2000)。在烟草(Kochevenko 和 Willmitzer, 2003)和水稻(Okuzaki 和 Toriyama, 2004)中的后续实验中报道的频率分别是1χ10_6和1χ10_4。
[0011]使用各种类型寡核苷酸的TNE已经是一些专利和专利申请的主题，包括US6936467、US7226785、US579597、US6136601、US2003/0163849、US2003/0236208、W003/013226、US5594121 和 W001/92512。
[0012]在US6936467中认为，使用未修饰的DNA寡核苷酸得到低基因改变频率是在反应混合物或靶细胞中存在的核酸酶降解了供体寡核苷酸的结果。提出引入修饰的核苷酸，其使所得的寡核苷酸(更)耐受核酸酶。公开了这些修饰优选位于寡核苷酸末端，其中错配存在于距离各末端至少8个核苷酸。
[0013]US7226785也揭示了用具有至少一个修饰的耐核酸酶末端区域的修饰单链寡核苷酸来靶向染色体基因组改变方法。使用修饰的单链寡核苷酸的TNE也是W002/26967的主题。
[0014]因为现有TNE方法效率低，需要替代和/或更好的TNE技术。这些技术可单独使用或与上述及本【技术领域】中的现有 TNE技术联用以改善效率。因此，本发明人已经展示对现有TNE技术的改进。


[0015]技术问题
[0016]本领域确定的技术问题是现有的在细胞中导入特定或需要的遗传变化的可用方法，例如在植物细胞中存在的基因组中导入特定的遗传变化，由于受到低效的阻碍，使得这些技术费力且昂贵。存在对替代和更好的TNE技术的需求。
[0017]需要解决的问题之一是提供替代的和/或更好的和/或另外的方法以将遗传变化引入遗传信息，尤其是存在于细胞中的双链DNA序列。优选地，与本领域中描述的方法相t匕，这些方法的效率提高。这些方法会向细胞提供改变的遗传信息，更具体的是通过向靶DNA导入变化从而改变该细胞的细胞功能。这些功能可能例如涉及DNA序列编码的蛋白质的特性改变，该DNA序列包含根据本发明方法改变的DNA。
[0018]问题的解决方案
[0019]问题的解决方案见所附的权利要求中。
[0020]双链的或双链DNA是本领域技术人员熟知的术语，指通过A和T之间以及G和C之间的互补碱基配对(沃森克里克碱基配对)形成的双螺旋的两条DNA链。
[0021]发明人现在已发现新的靶向改变双链DNA序列的方法，该方法包括第一 DNA序列(包含在第一条链中)和与第一 DNA序列互补的第二 DNA序列(包括在第二条链中)。[0022]该方法利用至少两条不同并特异性设计的供体寡核苷酸。两条供体寡核苷酸中各自包含能够与靶标杂交的结构域(在如本领域技术人员已知的允许杂交的条件下)。两条供体寡核苷酸中各自还包括相比靶双链DNA序列的至少一个错配，所述错配将要引入靶双链DNA序列中。
[0023]第一寡核苷酸包含能与所述第一 DNA序列(在第一条链中)杂交的结构域，并且第二寡核苷酸包含能与所述第二 DNA序列(在第二条链中)杂交的结构域。
[0024]第一寡核苷酸中至少一个错配针对/相对第一 DNA序列中的核苷酸，而第二寡核苷酸中至少一个错配针对/相对与双链DNA中第一 DNA序列中的核苷酸形成碱基配对的第二 DNA序列中的核苷酸。
[0025]在本领域中和常规知识主张寡核苷酸中的错配应该存在于寡核苷酸内，换言之，在寡核苷酸中间某处(参见例如上述各专利申请，具体是US6936467和US7226785)。
[0026]本领域中这种错配在中间并在两边的侧翼有多个核苷酸的寡核苷酸设计会使任何技术人员无法想到利用一组至少2条上述的寡核苷酸，因为这些寡核苷酸至少部分共享互补结构域而能够例如互相杂交，因而不会在靶向核苷酸交换中使用此方法。
[0027]然而惊讶并意外地发现，使用如本文详述的至少两条寡核苷酸实施本发明方法，当每条寡核苷酸的错配不位于寡核苷酸中间而位于特定位点时效率良好。具体地，发现对于高效TNE，本文所述的至少两条寡核苷酸中的错配应该位于距离寡核苷酸的3’末端最多两个，优选最多一个核苷酸处。最优选至少一个错配位于(单链)寡核苷酸的3’末端。
[0028]与通常认为的任何错配应该位于寡核苷酸中间，以及例如引入寡核苷酸5’末端和3’末端修饰是防止核酸酶过早降解寡核苷酸(参见例如US6936467)相反，现在发现在寡核苷酸距离3’末端0、1或2个核苷酸处的错配能提供优选用于靶向核苷酸交换的寡核苷酸，即文本所述的双链DNA序列的靶向改变方法。
[0029]采用上述方法，现在可能通过文中所述的使用至少两条寡核苷酸在双链DNA中同时靶向第一 DNA序列上的核苷酸和第二 DNA序列上与第一 DNA序列上的核苷酸碱基配对的核苷酸，进一步意外地改进靶向核苷酸交换。
[0030]每条寡核苷酸包括至少一个距离3’末端O、I或最多2个核苷酸的错配并如本文所述可另外通过纳入修饰的核苷酸，即具有碱基修饰、主链修饰、糖修饰的和/或所述核苷酸5’末端和/或3’末端修饰的核苷酸来修饰。这些修饰包括熟知的改善寡核苷酸与靶序列结合/杂交的修饰，和/或防止或抑制所谓核酸酶分解寡核苷酸的修饰。这些修饰核苷酸的例子包括锁核酸，或具有硫代磷酸酯连接的核苷酸。然而，如实施例2所示，没有要求本发明中第一或第二寡核苷酸包含有硫代磷酸酯连接的核苷酸也不要求包括引入任何其它类型修饰的核苷酸。
[0031]附图简要说明
[0032]图1含有一个终止密码子的GFP开放阅读框的核苷酸序列(SEQ IDN0:l)o
[0033]图2GFP-终止蛋白的氨基酸序列。终止密码子位点用星号表示(SEQID NO:2)。
[0034]图3该研究中使用的构建体。
[0035]图4数据显示用本发明寡核苷酸得到的TNE效率。
[0036]图5显示YFP-终止构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12)。位于186位点的核苷酸已经改变(C到A)，形成了一个框内的终止密码子。[0037]图6显示YFP-终止的蛋白序列(SEQ ID N0:13)。蛋白中的终止密码子的位置用星号表不。
[0038]定义
[0039]在以下说明和实施例中，使用了一些术语。为了提供对说明书和权利要求的清楚和一致的理解，以及这些术语的给定范围，提供了下列定义。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。所有出版物、专利申请、专利和其他文献的公开内容都在通过引入将全部内容纳入本文。
[0040]如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。例如，分离“一个”DNA分子，如上所用，包括分离多个分子(例如，上十、上百、上千、上万、上十万、上百万或更多的分子)。具体地，本文所述的发明利用至少两条寡核苷酸。在说明书中参照“一个”或“该”寡核苷酸，对于本领域技术人员来说并不应理解为表示缺失至少两个寡核苷酸中的一个，而应理解为表示独立地参照根据本发明方法使用的所有至少两个寡核苷酸中的一个、两个或更多，除非上下文中另有明确说明。例如，如果提到该寡核苷酸可包含一个LNA-核苷酸，这应被本领域技术人员理解为寡核苷酸中的一个可包括该LNA-残基，但也包括至少两条寡核苷酸都可包含该LNA-残基。
[0041]在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其变化形式是以非限制性使用，意味着该词语后面的条目被包含，但没有特别提及的条目并未被排除。
[0042]实施本发明方法中所用的常规技术的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。本领域技术人员熟知分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关的领域中实施的常规技术，并在，例如，以下参考文献中描述:Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(《分子克隆:实验室手册》)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1989 ;Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology,(《新编分子生物学实验指南》)，John ffiley&Sons公司，纽约，1987及定期更新；和《酶学方法》系列，学术出版社(Academic Pre`ss),圣地亚哥。
[0043]本发明的核酸可包括嘧啶和嘌呤碱基，优选胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或寡聚物(见Albert L.Lehninger, Principles of Biochemistry(《生物化学原理》),793-800 (Worth Pub.1982)通过引用全文纳入本文并用于所有目的)。本发明考虑了任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸成分，任何其化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。该聚合物或寡聚物在结构上可以是异源或同源的，可以分离自天然来源，或可人工或合成产生。另外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，可永久或瞬间以单链或双链形式存在，包括同源双链、异源双链、和杂交状态。
[0044](合成)寡核苷酸:可化学合成的具有优选约5-150个碱基的单链DNA分子被称为合成寡核苷酸。一般这些合成DNA分子设计成具有独特或所需的核苷酸序列，虽然也可能合成具有相关序列的分子家族，其在核苷酸序列内的特定位点具有不同核苷酸组成。术语合成的寡核苷酸用于指具有经设计或所需的核苷酸序列的DNA分子。
[0045]“靶向核苷酸交换”或“TNE”。靶向核苷酸交换(TNE)是通过至少一条与染色体或附加体基因中的位点至少部分互补的合成寡核苷酸，指导特定位点的核苷酸逆转的方法。TNE已经用大量的寡核苷酸和祀标描述。一些报道的寡核苷酸是RNA/DNA嵌合体,包含末端修饰以获得核酸酶耐受性。[0046]发明详述
[0047]一方面，本发明涉及靶向改变包括第一 DNA序列和与第一 DNA序列互补的第二 DNA序列的双链受体DNA序列的方法。
[0048]所述方法包括将一个/该双链受体DNA序列和至少两条供体寡核苷酸组合，这两条供体寡核苷酸是第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。第一寡核苷酸包含能与第一 DNA序列杂交的至少一个结构域并且还包含相对第一 DNA序列的至少一个错配。该至少一个错配位于距离所述第一寡核苷酸的3’末端最多2个核苷酸处。优选地，错配位于距离所述第一寡核苷酸的3’末端最多I个核苷酸处，更优选地，错配位于距离所述第一寡核苷酸的3’末端O个核苷酸处，换而言之，位于所述寡核苷酸的3’末端。第二寡核苷酸包含能与第二 DNA序列杂交的至少一个结构域并且还包含相对第二 DNA序列的至少一个错配。该至少一个错配位于距离所述第二条寡核苷酸的3’末端最多2个核苷酸处。优选地，错配位于距离所述第二寡核苷酸的3’末端最多I个核苷酸处，更优选地，错配位于距离所述第二寡核苷酸的3’末端O个核苷酸处,换而言之,位于所述寡核苷酸的3’末端。在第一寡核苷酸中的至少一个错配相对于双链受体DNA序列的第一 DNA序列的核苷酸，而在第二寡核苷酸中的至少一个错配相对于双链受体DNA序列的第二 DNA序列的核苷酸，其中所述核苷酸占据了双链受体DNA中的互补位点(即，能在双链受体DNA中形成碱基配对)。换而言之，至少两条寡核苷酸靶向双链受体DNA中的相同碱基对，第一寡核苷酸的错配靶向第一 DNA序列中的核苷酸而第二寡核苷酸的错配靶向双链DNA中第二 DNA序列中的互补核苷酸。
[0049]换而言之，提供了一种靶向改变包括第一 DNA序列和与第一 DNA序列互补的第二DNA序列的双链受体DNA序列的方法，所述方法包括将双链受体DNA和至少两条寡核苷酸组合，其中第一寡核苷酸包含能与第一 DNA序列杂交的结构域并且还包含相对第一 DNA序列的错配，而第二寡核苷酸包含能与第二 DNA序列杂交的结构域并且还包含与第二 DNA序列相对的错配，其中第一 DNA序列和第二 DNA序列中的所述核苷酸占据双链受体DNA中的互补位点(例如，在双链受体DNA中形成碱基对)，并且独立地，第一寡核苷酸中的错配和第二寡核苷酸中的错配位于距离所述寡核苷酸的3’末端最多2个核苷酸处。
[0050]如上所述，根据本发明的至少两条寡核苷酸中的每条寡核苷酸包含能与第一或者第二 DNA序列杂交的结构域(在本领域技术人员已知的允许杂交条件下)。优选地，能够与第一 DNA序列杂交的结构域包含至少相对于第一 DNA序列的至少一个错配，或该错配直接相邻于所述结构域(只要错配在距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸处)。优选地，能够与第二 DNA序列杂交的结构域包含相对于第二 DNA序列的至少一个错配，或该错配直接相邻于所述结构域(只要错配在距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸处)。
[0051]本发明方法通过针对双链DNA的两条链的寡核苷酸且每条寡核苷酸针对双链DNA中同一碱基对的不同核苷酸，能特定和选择性地改变在受体DNA序列的一个或多个特定位点的一个或多个核苷酸。
[0052]具体地，靶向改变能通过将本发明的至少两条寡核苷酸导入含有双链受体DNA序列的靶细胞中实施，即，第一寡核苷酸具有相比其杂交的第一 DNA序列的至少一个错配，所述至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个，优选最多I个核苷酸处，而第二寡核苷酸具有相比其杂交的第二 DNA序列的至少一个错配，所述至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个，优选所多I个核苷酸处，并且其中第一寡核苷酸中的错配和第二寡核苷酸的错配各自针对双链DNA中同一碱基对的不同核苷酸。
[0053]最优选地，所述至少一个错配位于寡核苷酸的3’末端，更优选地，所述至少一个错配位于两条寡核苷酸的3’末端。该方法的结果是靶向改变一条链中一个或多个核苷酸，因而靶DNA序列被改变。本发明可能优选在体内实施，但也可以离体或体外实施。
[0054]在本发明的范围内，双链DNA序列包括第一 DNA序列和第二 DNA序列。第二 DNA序列是第一 DNA序列的互补链并且配对形成双链。例如，第一 DNA序列ATTT (方向从5’到3’)的互补链是TAAA (方向从5’到3’)。该第二条DNA序列与第一条DNA序列配对形成双链。如果双链DNA序列例如是一个基因的部分，则第一条DNA序列可能在正义链或者在反义链上。
[0055]双链DNA序列的DNA可以是任意类型的DNA，如基因组DNA、衍生自基因组的DNA、线性DNA、人工染色体、核染色体DNA、细胞器DNA、BAC、YAC、质粒DNA、或附加体DNA。DNA序列可以是内含子或外显子的部分，编码或非编码，调控或不调控表达。
[0056]用于本文所公开方法的寡核苷酸优选单链并包含能与第一 DNA序列(第一寡核苷酸)或第二 DNA序列(第二寡核苷酸)杂交的至少一个结构域。
[0057]对于两条寡核苷酸中的每条，并且互相独立地,相对需待改变的DNA序列的至少一个错配位于能与第一 DNA序列(对于第一条核苷酸)或第二 DNA序列(对于第二条核苷酸)杂交的结构域内或直接相邻于该结构域，其中，该错配位于距离寡核苷酸的3’末端0、1或2个核苷酸处。
[0058]因此该寡核苷酸中的至少一个结构域可能包含至少一个相对待改变的DNA序列的错配或直接旁于/相邻于错配 。换而言之，寡核苷酸包含由能够在实验条件下与双链受体DNA序列的第一或第二 DNA序列杂交的相邻核苷酸组成的结构域，并且包含相对所述第一或第二 DNA序列的错配或者该错配直接相邻于所述结构域(其中错配位于距离寡核苷酸3’末端0，1或2个核苷酸处)。
[0059]例如，如果结构域(方向从5’到3’)位于距离3’末端最多至3个核苷酸处，错配可直接相邻于结构域并位于距离寡核苷酸3’末端2个核苷酸处。例如，如果结构域(方向从5’到3’)位于距离3’末端最多至I个核苷酸处，错配可位于结构域内，例如位于距离3’末端2个核苷酸处，或者直接相邻于结构域，即位于距离3’末端O个核苷酸处，换而言之，位于寡核苷酸的3’末端。
[0060]可以理解的是在至少两条寡核苷酸中每条上的错配位点选择可独立于另一条寡核苷酸。换而言之，如果在第一寡核苷酸中的错配例如位于所述寡核苷酸的3’末端，在第二寡核苷酸中的错配不必位于所述寡核苷酸的3’末端，但也可以位于例如距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸处。
[0061]本领域技术人员可以理解的是，在本发明的内容中，当参照错配或包含在能与第一或第二 DNA序列杂交的结构域中的错配时，它们包括了在包含在结构域中或直接相邻于结构域的任意错配，只要该错配位于距离寡核苷酸3’末端2、1或O个核苷酸处。
[0062]在一个优选实施方式中，第一寡核苷酸优选包括相对第一 DNA序列不超过一个错配，和/或第二条寡核苷酸优选包括相对第二 DNA序列不超过一个错配(两个都针对双链DNA中碱基对中的不同核苷酸)。
[0063]在某些实施方式中，向靶DNA中同时或相继引入超过一个突变。该寡核苷酸能包含在寡核苷酸上相邻或删除的区域的超过一个错配。在某些实施方式中，寡核苷酸可包括2、3、4或更多的错配核苷酸，这些错配核苷酸可以是间隔的(B卩，非相邻)。寡核苷酸还可包含结构域以容纳这些错配。这些错配可以在相同或不同的结构域中。
[0064]本领域技术人员可以理解的是本发明寡核苷酸还可包含非杂交部分，换而言之，不与第一或第二 DNA序列杂交的相邻核苷酸，例如这些部分不与第一或第二序列中的任意片段互补。
[0065]在一个优选的实施方式中，第一寡核苷酸包含能与第一 DNA序列杂交的一个结构域，并包含或直接相邻于至少一个相对于待改变DNA序列的错配，优选一个错配，而第二寡核苷酸包含能与第二 DNA序列杂交的一个结构域，并包含或直接相邻于至少一个相对于待改变DNA序列的错配，优选一个错配，其中第一寡核苷酸中有至少一个相对于双链受体DNA序列的第一 DNA序列的错配并且第二寡核苷酸中有至少一个相对于双链受体DNA序列的第二 DNA序列的错配，并且所述的核苷酸占据了双链受体DNA中的互补位点(例如，形成双链受体DNA中的碱基对)。
[0066]在这个实施方式中，寡核苷酸原则上可以包含超过一个能够与相对第一或第二DNA序列杂交的结构域，然而其中只有一个结构域可包括，或直接相邻于，至少一个错配(或一个错配)。在另一个优选实施方式中，寡核苷酸，优选两条寡核苷酸都只包含一个能够与双链DNA杂交的结构域。这个结构域位于寡核苷酸3’末端或附近,并包括错配,或直接相邻于错配。
[0067]在本文所述的方法中用作供体的寡核苷酸长度可变化，但是通常在10至500个核苷酸长度间变化，优选11至100个核苷酸，再优选15至90个核苷酸，更优选20至70个核苷酸。
[0068]结构域可由至少5个核苷酸组成，包括错配，但也可由寡核苷酸中包括错配的所有核苷酸组成。如果错配直接相邻于结构域，结构域可由至少5个核苷酸组成，但也可由除了错配以外的寡核苷酸的所有核苷酸组成。寡核苷酸中的结构域通常有大约至少5、10个核苷酸，优选15、20、25、或30个核苷酸。
[0069]按照本发明的寡核苷酸包含至少一个位于距离所述的寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸，优选最多I个核苷酸处的错配。优选的所述(至少一个)错配位于寡核苷酸的3’末端，最优选的所述(至少一个)错配位于第一条寡核苷酸和第二条寡核苷酸的3’末端。本领域技术人员理解术语3’末端包含的内容。单链非环状的DNA有两个末端，3’末端和5’末端(也称为“3端”和“5端”)。
[0070]单链核酸的5’末端表示特定核苷酸的C-5碳原子形成了糖-磷酸主链的末端碳原子。C-5碳原子可通过磷酸二酯键与磷酸基团连接或不连接，但是这个磷酸基团反过来不与其它的核苷酸形成任何连接。
[0071]单链核酸的3’末端表示特定核苷酸，其C-3碳原子不与任意其它的核苷酸通过磷酸二酯键或其它键连接。C-5原子是核糖或脱氧核糖分子上的第5号碳原子且不形成呋喃糖环的一部分，从直接与呋喃糖环上的氧和核碱基相邻的碳原子开始数起。C-3原子是核糖或脱氧核糖分子上的第3号碳原子且不形成呋喃糖环的一部分，从直接与呋喃糖环上的氧和核碱基相邻的I号碳原子开始数起。
[0072]术语“错配位于距离3’末端2个核苷酸处”表示错配与寡核苷酸3’末端核苷酸距离2个核苷酸。术语“错配位于距离3’末端I个核苷酸处”表示错配与寡核苷酸3’末端核苷酸距离I个核苷酸。术语“错配位于距离3’末端O个核苷酸处”表示错配是寡核苷酸3’末端上的核苷酸。
[0073]在一个本文所述方法的优选实施方式中，第一寡核苷酸中的错配或第二寡核苷酸中的错配独立地位于距离所述寡核苷酸3’末端最多I个核苷酸处，更优选地，至少一个错配位于寡核苷酸的3’末端，优选地，两条寡核苷酸中的错配都位于相应的寡核苷酸的3’末端。
[0074]在本文所述的方法中同样优选的是在第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸中的结构域包含或直接相邻于至少一个错配。
[0075]另外，在本文所述的方法中优选地，第一寡核苷酸与第一 DNA序列除了错配处外互补和/或第二寡核苷酸与第二 DNA序列除了错配处外互补。在这个实施方式中，第一寡核苷酸因此包含相对第一 DNA序列的一个错配，而第二寡核苷酸包含优选相对第二 DNA序列的一个错配(各自针对双链DNA中碱基对的不同核苷酸)。这个寡核苷酸与第一或第二 DNA序列在除了位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸，优选最多I个核苷酸，最优选所述错配位于3’末端处的一个错配以外的整条寡核苷酸互补。在另一个实施方式中，寡核苷酸(方向从5’到3’)一直到错配处(位于距离3’末端2、1或O个核苷酸)的整条长度内与第一或第二 DNA序列互补。更优选地,第一寡核苷酸中的错配位于3’末端且第二寡核苷酸中的错配位于3’末端，第一寡核苷酸在除了错配的整个长度内与第一 DNA序列互补，且第二寡核苷酸在除了错配的整个长度内与第二 DNA序列互补。
[0076]在另一个本文所述方法的优选实施方式中，第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸包含至少一个含有至少一个修饰核苷酸的部分，其中修饰选自下组:碱基修饰、3’和/或5’末端碱基修饰、主链修饰或糖修饰。
[0077]碱基修饰、3’和/或5’末端碱基修饰、主链修饰和/或糖修饰可引入寡核苷酸中以增加寡核苷酸与靶序列的(结合/杂交)亲和力，独立或额外增加地提高寡核苷酸对细胞核酸酶的耐受。然而，如实施例2所示，不要求第一寡核苷酸或第二寡核苷酸必需引入任何修饰的核苷酸。
[0078]可以优选使用寡核苷酸中核苷酸的任意修饰，这些修饰提供了适用于本发明方法的寡核苷酸(并且包括至少一个位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸,优选最多I个核苷酸的错配，最优选所述错配位于寡核苷酸3’末端)。本领域技术人员可以理解的是修饰是相对天然存在的A、C、T、G核苷酸的。
[0079]较佳地，虽然并非本发明必须，按照本发明方法使用的第一和/或第二寡核苷酸包含修饰的核苷酸。如果第一和第二寡核苷酸都包含修饰，第一寡核苷酸的修饰可与第二寡核苷酸的修饰相同或不同。具体地，下文所述的任何修饰可引入到本发明的第一和/或第二寡核苷酸中。
[0080]例如，第一和/或第二寡核苷酸可以包含与天然存在的A、T、C和G核苷酸相比增加寡核苷酸抵抗细胞核酸酶的修饰。这些修饰可包括碱基修饰、主链修饰、和/或糖修饰。通常这些修饰的核苷酸会增加寡核苷酸对细胞核酸酶的耐受性，结果增加寡核苷酸在细胞环境中的稳定性，因而改善靶向核苷酸交换。优选地，按照本发明的方法使用的第一和/或第二寡核苷酸包含至少I个，优选至少2个，更优选至少4个，更优选至少6个，最优选至少8个如果与天然存在的A、T、C和G核苷酸相比增加寡核苷酸对细胞核酸酶耐受性的修饰核苷酸。另外，或同时，按照本发明的方法使用的第一和/或第二寡核苷酸包含至多25个，优选至多20个，更优选至多15个，最优选至多10个与天然存在的A、T、C和G核苷酸相比增加寡核苷酸对细胞核酸酶耐受性的修饰核苷酸。这些修饰核苷酸可位于第一或第二寡合苷酸中的任意位置，距离相应的寡核苷酸3’末端和/或5’末端优选在20个，优选在15个，更优选在10个，更优选在8个，更优选在6个核苷酸内，最优选位于寡核苷酸3’末端的最后一个核苷酸和/或5’末端的最后一个核苷酸。当待要引入靶DNA序列中的错配位于距离寡核苷酸3’末端O、I或最多2个核苷酸处，尤其优选该修饰的核苷酸保护3’端抵抗细胞核酸酶并因此位于第一和/或第二寡核苷酸3’末端，如在距离3’末端的20、15、10、9、8、7、6、或4个核苷酸内。然而，如前述和实施例2所示，寡核苷酸确实包括修饰的核苷酸以增加寡核苷酸细胞核酸酶耐受性对于本发明而言不是必要的。
[0081]文中提到的多种该修饰的核苷酸，如果与天然存在的A、T、C、和G核苷酸相比增加了寡核苷酸抵抗细胞核酸酶的耐受性，可引入按照本发明方法使用的第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸中。该修饰的核苷酸可以是有硫代磷酸酯连接的核苷酸，但也可以是亚磷酰胺、甲基磷酸酯、或具有非磷酸核苷酸间键的核苷酸，如碳酸酯、氨基甲酸酯、硅氧烷、磺酰胺和聚酰胺核酸。另外，可以使用如W00226967中所述具有细胞核酸酶耐受性的修饰核苷酸，如LNA (锁核酸)，或任意其它本领域技术人员知晓的改善寡核苷酸细胞核酸酶耐受性的修饰核苷酸。
[0082]替代上述具有核酸酶耐受性的修饰核苷酸或除此之外，按照本发明方法使用的第一和/或第二寡核苷酸可包含与天然存在的A、T、C、和G核苷酸相比对靶DNA序列有更高结合亲和力的修饰核苷酸。这些修饰可包括碱基修饰、主链修饰和/或糖修饰。通常，这些亲和力增强的修饰核苷酸会影响与靶序列的碱基配对，可以导致寡核苷酸与靶序列的杂交稳定性增强，相信这样能改善靶向核苷酸交换。优选地，按照本发明的方法使用的第一和/或第二寡核苷酸包含至少1-10，优选1-8，更优选1-6，更优选1-4，如1、2、3、或4，更优选2个修饰的如果与天然存在的A、T、C、和G核苷酸相比对靶DNA序列有更高结合亲和力的核苷酸。上述的这些修饰的寡核苷 酸可以位于第一和/或第二寡核苷酸中的任意位置，优选位于距离错配I个核苷酸处，优选距离错配最多2、3、4、5、6、或7个核苷酸处。优选地，这些修饰的核苷酸位于错配的5’侧，但是该修饰核苷酸也可以选择位于错配的3’侧，如果错配不位于第一和/或第二寡核苷酸的3’末端的最后一个核苷酸处。
[0083]文中描述了如果与天然存在的A、T、C、和G核苷酸相比有更高的结合亲和力的修饰核苷酸的多个例子，其可引入本发明方法使用的寡核苷酸，包括2-OMe取代，LNA (锁核酸)，核糖核苷酸、超级A (superA)、超级T (superT)、或其它本领域技术人员知晓的如果与天然存在的A、T、C、和G核苷酸相比增强寡核苷酸与靶DNA序列结合亲和力的任意修饰核苷酸。
[0084]确定修饰的核苷酸与天然存在的A，T，G，C核苷酸相比是否具有增强的细胞核酸酶耐受性可以通过例如比较含有所述修饰的核苷酸的寡核苷酸与不含所述修饰核苷酸的寡核苷酸在细胞核酸酶存在下的半衰期，该细胞核酸酶如存在于番茄提取物、番茄细胞、或在大肠杆菌中。如果第一项的半衰期更长，所述修饰的核苷酸如果与天然存在的A，T，G，C核苷酸相比就具有增强的细胞核酸酶耐受性。确定修饰的核苷酸与天然存在的A，T，C，或G核苷酸相比是否对靶DNA序列有更高的结合亲和力可通过例如比较含有所述修饰核苷酸的寡核苷酸和其靶DNA形成的双链熔融温度(Tm)与不含所述修饰核苷酸的寡核苷酸和其靶DNA形成的双链的熔融温度(Tm)。如果前一项的熔融温度更高，所述修饰核苷酸就相比天然存在的A，T，G，C对靶DNA序列具有更高的结合亲和力。
[0085]本发明中的一部分应理解为长度至少为I个核苷酸的寡核苷酸的任意部分。例如，一部分可包括1-10，优选1-6，更优选1-4，更优选1-2个核苷酸，并且可位于错配的3’侧和/或5’侧。至少一个部分可以是本发明结构域的一部分，换而言之，该部分可以在能与第一或第二 DNA序列杂交的结构域内。另外，该部分可与结构域完全或部分重叠。如果完全重叠，这部分可与结构域长度相同，但也可能超过结构域的长度。如果部分重叠，该结构域和该部分有至少一个核苷酸相同。
[0086]根据寡核苷酸中使用的修饰类型，修饰核苷酸优选在能与第一或第二条DNA序列杂交的结构域的部分，并且这个结构域包括或直接相邻于至少一个错配，该错配位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个，优选最多I个核苷酸处，最优选所述错配位于寡核苷酸的3’末端。与天然存在的A，C，T或G核苷酸相比与互补核苷酸有更高结合亲和力的修饰的核苷酸尤其如此。
[0087]碱基修饰包括，但不限于例如在W00226967中描述的修饰，包括对嘧啶C_5位置的修饰，如2’ -脱氧尿苷、5-氟-2’ -脱氧尿苷、5_溴-2’ -脱氧尿苷和5-甲基-2’ -脱氧尿苷。其它碱基修饰包括合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，具体地，5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧唆、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤(7-deazaguanine)和7-脱氮杂腺嘌呤(7-deazaadenine)和3_`脱氮杂鸟嘌呤(3_deazaguanine)和3_脱氮杂腺嘌呤(3-deazaadenine )。
[0088]末端(3’和/或5’)修饰可包括2’ -O-甲基碱基、3’胺基、硫代磷酸酯连接、或任何其它核酸酶耐受性修饰。本领域技术人员熟知这些修饰。提供核酸酶耐受性被认为还能改善祀向核苷酸交换。
[0089]各种主链修饰，如W00226967提到会提高细胞核酸酶耐受性的那些，包括硫代磷酸酯、亚膦酰胺和甲基磷酸酯和具有非磷酸核苷酸间键的那些，如碳酸酯、氨基甲酸酯、硅氧烷、磺酰胺和聚酰胺核酸。因此这些主链修饰有助于本发明方法使用的寡核苷酸。
[0090]另外，糖修饰，包括但不限于2’ -O-甲基、2’ -氟或2’ -甲氧基乙氧基能提高所形成双链的热稳定性，并且同时提供改善的核酸酶耐受性。
[0091]其它合适修饰的例子在W02007073149中描述。供体寡核苷酸的修饰，例如，可包括硫代磷酸酯连接、2-甲基氧取代、LNA (锁核酸)的使用、核糖核苷酸，和单独或共同通过改善结合靶DNA的亲和力或抑制核酸酶的活性来修饰并优选地增强寡核苷酸和受体链之间杂交稳定性的其它碱基。
[0092]本领域技术人员熟知所有这些类型的修饰并且易于从各种商业来源获得。本领域的技术人员应理解的是如本文所述方法在第一寡核苷酸中引入的修饰与第二寡核苷酸中引入的修饰是独立的。例如，第一寡核苷酸可包含上述修饰，而第二寡核苷酸可不包含上述修饰。另外第一寡核苷酸与第二条寡核苷酸相比可在相同或不同位置包含较多、较少或不同的修饰。
[0093]在一个实施方式中，提供了一种本发明的方法，其中向一条或两条寡核苷酸中引入修饰的核苷酸，并且该修饰的核苷酸相比天然存在的A、C、T、或G核苷酸对互补核苷酸有更高的结合亲和力，其中修饰的核苷酸与天然存在的与第一或第二 DNA序列中相反位置核苷酸互补的核苷酸相比与第一或第二 DNA序列中相反位置核苷酸结合更强，和/或该修饰核苷酸是耐受核酸酶的核苷酸。
[0094]优选地，修饰是碱基修饰、3’末端和/或5’末端的碱基修饰、主链修饰或糖修饰。如上所述，按照本发明的供体寡核苷酸可包括改善杂交特性的修饰，以至该供体展现出对靶DNA链增强的亲和力，这可使得供体更容易嵌合和/或提高所形成双链的热稳定性(与不包含这些修饰的相同寡核苷酸相比，并且在相同的实验环境下)。供体寡核苷酸能独立或额外修饰成对核酸酶更高的耐受性，这可稳定双链结构。
[0095]在现有技术中，多种修饰的核苷酸相比天然存在的A、C、T、或G核苷酸对其互补核苷酸有更高的结合亲和力，其中修饰的核苷酸与天然存在的与第一条或第二条DNA序列中相反位置核苷酸互补的核苷酸相比与第一条或第二条DNA序列中相反位置核苷酸结合更强，且/或其中修饰的核苷酸是所述耐受核酸酶的核苷酸(参见例子W02007073154和上述的各种修饰)。
[0096]在某些实施方式中，修饰位于距离错配I个核苷酸处，优选距离错配2、3、4、5、6或7个核苷酸处。在某些实施方式中，修饰位于错配的下游位置。在某些实施方式中，修饰位于错配的上游位置。
[0097]包含或直接相邻于 错配的结构域和含有修饰的核苷酸的部分可以是重叠的。因此，在某些实施方式中，含有错配或直接相邻于错配的结构域与考虑修饰的那部分位于寡核苷酸上的不同位点。在特定实施方式中，结构域包含一个或多个部分。在某些实施方式中，部分能引入结构域。在某些实施方式中，结构域与该部分可位于寡核苷酸上的相同位点并且长度相同，即，该部分在长度和位置上重合。在某些实施方式中，在一个结构域中可有多于一个的部分。
[0098]对本发明而言，这意味着含有改变DNA双链的错配的寡核苷酸部分可与修饰的寡核苷酸部分位于不同或转移的位置。
[0099]另外，本领域的技术人员应理解的是用于本文所述方法的第一寡核苷酸中引入的修饰与第二寡核苷酸中引入的修饰是独立的。例如，第一寡核苷酸可包含上述修饰，而第二寡核苷酸可不包含上述修饰。另外第一寡核苷酸与第二寡核苷酸相比可在相同或不同位置包含较多、较少或不同的修饰。
[0100]在一个优选实施方式中，修饰的核苷酸选自下组:LNA和/或含有硫代磷酸酯键/连接的核苷酸。
[0101]在一个优选实施方式中，修饰的核苷酸是锁核酸。锁核酸(LNA)是在反义基因治疗中有感兴趣特性的DNA类似物并被本领域技术人员所知。
[0102]LNA是双环和三环核苷和核苷类似物并可引入到寡核苷酸中。LNA和其相关类似物的基本结构和功能特性在多个文献和专利中揭示，包括W099/14226、W000/56748、W000/66604, W098/39352, US6043060和US6268490，其内容通过引用全文纳入本文。
[0103]LNA核苷对于所有常用核碱基(T、C、G、A、U ;例如从Exiqon公司(www.exiqon.com))市售可得并能够按照标准沃森克里克碱基配对规律形成碱基对。当引入DNA寡核苷酸中时，LNA与互补的核苷酸链配对更快并且增加了所得双链的稳定性。换而言之，LNA结合了区分正确和错误靶标的能力(高特异性)和极高的生物稳定性(低周转)以及前所未见的亲和力(对靶标的结合强度极高)。事实上，LNA记录的亲和力增加使得之前报道的所有类似物处于低到中等的范围。
[0104]LNA是RNA类似物，其核糖在结构上受到2’ -氧原子和4’ -碳原子之间亚甲基桥限制。这个桥限制了呋喃核糖环的柔性并将结构锁定为刚性的双环体。这所谓的N-型(或3’ -内)构象造成含有LNA双链的Tm (熔融温度)上升，从而产生更高的结合亲和力和更高的特异性。重要的是，LNA的有利特性不以其它重要特性为代价，这种代价在其它核酸类似物中很常见。
[0105]LNA能够与组成DNA类似物体系的所有其它化学物自由混合。LNA碱基能够以短的全LNA序列或较长的LNA/DNA嵌合体引入寡核苷酸中。LNA能位于内部、3’或5’的位置。然而，由于刚性双环构象，LNA残基有时会阻碍核酸链的螺旋扭转。因此通常不优选设计有两个或更多相邻LNA残基的寡核苷酸。优选地，LNA残基被至少一个不会阻碍螺旋扭转的(修饰的)核苷酸隔开，如普通核苷酸(A、C、T、或G)。
[0106]最初开发的和优选的LNA单体([β ]-D_氧基-LNA单体)已经被修饰为新的LNA单体。新型[a ]-L_氧基-LNA已经显示出抗3’外切核酸酶活性的优良的稳定性，并且在设计有效的反义寡核苷酸中也比[β]_?-氧基-LNA更加强大和通用。也可使用木糖LNA、L-核糖 LNA 和其它 LNA，如在 W09914226、W000/56748、W000/66604 和 J.0rg.Chem.，2010，75 (7)，第2341 - 2349页中的公开内容。在本发明中，上述类型的任意LNA能高效地完成本发明的目标，即改善TNE的效率，优 选[β ] -D-LNA类似物。
[0107]如上所述，优选地，在本发明方法使用的一条寡核苷酸(或同时在至少两条寡核苷酸)中LNA距离错配至少I个核苷酸。虽然在TNE的【技术领域】，LNA修饰列在可能的寡核苷酸修饰之中作为TNE中使用的嵌合体分子的替代物，已经发现当按照本发明方法使用的单链DNA寡核苷酸被修饰成特定LNA时，TNE的效率显著增加到目前发现的当LNA位于距离错配至少一个核苷酸，甚至更优选距离错配一个核苷酸时的程度。寡核苷酸优选含有不超过约75%的LNA (归整到最接近的核苷酸整数)。
[0108]在另一个优选实施方式中，修饰的核苷酸包括含有硫代磷酸酯连接的核苷酸。已开发许多市售的核苷酸修饰以用于基因治疗的反义应用。在反义应用(“第一代”反义寡核苷酸)中最简单且最广泛应用的核酸酶耐受性化学物是硫代磷酸酯(PS)连接。在这些分子中，一个硫原子代替了寡核苷酸磷酸主链上的非桥连氧(参见，例如，W02007073154的图2 )，产成了耐受内切核酸酶和外切核酸酶的活性。
[0109]对于基因治疗，硫代磷酸酯/磷酸二酯嵌合体通常有在未修饰DNA中央核心的5’ -和3’ -末端上具有一至四个修饰的核苷酸间连接。然而，硫代磷酸酯键能引入到寡核苷酸上任意所需位点。
[0110]优选地，修饰的核苷酸是LNA，或者更优选地是具有硫代磷酸酯连接的核苷酸，更优选地，修饰的寡核苷酸有至少一个，例如，一个、两个、三个或四个硫代磷酸酯。优选地，寡核苷酸含有位于本发明的寡核苷酸5’末端或在其附近(例如,在距离1、2、3、4、5、6、7个核苷酸处)的至少一个硫代磷酸酯。
[0111]在某个实施方式中，按照本发明的方法使用的寡核苷酸含有至少2、3、4或5个修饰的核苷酸。优选地，寡核苷酸含有2、3、4或5个修饰的核苷酸。优选地，修饰选自下组:LNA和/或硫代磷酸酯键。
[0112]在本发明的某些优选实施方式中，寡核苷酸中错配位置的核苷酸可以被修饰。错配处是否能被修饰很大程度上取决于靶向核苷酸交换的确切机制或细胞DNA修复的机制，这些机制利用供体链和受体链之间的不同亲和力。在某个优选的实施方式中，位于错配处的核苷酸不是修饰的核苷酸。
[0113]在一个实施方式中，提供了一种本发明的方法，其中修饰的核苷酸位于距离至少一个错配至少一个核苷酸处，该错配位于距离所述寡核苷酸的3’末端最多2个，优选最多I个核苷酸处，最优选所述至少一个错配位于寡核苷酸3’末端。
[0114]如前所述，已经发现本发明方法使用的单链DNA寡核苷酸经修饰含有修饰的核苷酸例如LNA时，TNE效率显著增加到目前发现的当修饰的核苷酸，优选LNA位于距离错配至少一个核苷酸，甚至更优选距离错配一个核苷酸时的程度。换而言之，在一个优选实施方式中，修饰的核苷酸，优选LNA,通过至少一个其它核苷酸与错配分离,所述至少一个其它核苷酸不是LNA，优选不是修饰的核苷酸。然而，如果例如是硫代磷酸酯连接，该连接直接相邻于错配的核苷酸。
[0115]在一个实施方式中提供了一种方法，其中双链受体DNA的改变优选地在选自下组的细胞中进行:原核细胞、细菌细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞、酵母细胞、真菌细胞、啮齿细胞、人细胞、非人细胞、和/或(非人)胚胎细胞。本发明最广义的形式一般可应用于各种生物体如人、动物、植物、鱼类、爬`行类、昆虫、真菌、细菌等等。本发明可因此在选自下组的细胞中实施:原核细胞、细菌细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞、酵母细胞、真菌细胞、啮齿动物细胞、人细胞、非人细胞、和/或胚胎细胞。在某个优选的实施方式中，所述细胞是植物细胞。
[0116]本发明也提供了如本文所述的方法，其中双链受体DNA从原核生物体、细菌、真核生物体、植物、动物、酵母、真菌、啮齿动物、或人中得到。在一个优选实施方式中，双链受体DNA从植物(植物细胞中存在的植物DNA)中得到。
[0117]在本发明的一个实施方式中，双链受体DNA序列的改变是缺失、替换和/或插入至少一个核苷酸。优选地，双链DNA序列的改变是缺失、替换和/或插入不超过5个核苷酸，优选不超过4、3、2、1个核苷酸，最优选I个核苷酸(或换而言之，在双链DNA中一个碱配对被修饰)。更优选地，双链受体DNA序列的改变是不超过5个核苷酸的替换，优选不超过4、
3、2、I个核苷酸，最优选I个核苷酸。
[0118]在另一个实施方式中，提供了按照本发明的方法，其中双链受体DNA来自基因组DNA、线性DNA、人工染色体、哺乳动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器DNAJP /或包括质粒的附加体DNA。
[0119]实际上本发明可用于任意类型DNA的修饰，如上所述。本发明能在体内、离体或体外实施，例如在能靶向核苷酸交换的蛋白的存在下用供体寡核苷酸使DNA被修饰，其中，该蛋白质例如、具体地是具有细胞错配修复机制功能的蛋白。
[0120]向细胞递送寡核苷酸能通过电穿孔或能够向核或胞质递送的其它常规技术来实现。本发明方法的体外实验可以使用描述在W001/87914、W003/027265、W099/58702、W001/92512中的细胞游离系统(Cell Free system)来实现。寡核苷酸可包括甲基化核苷
酸、非甲基化核苷酸或两者。
[0121]本发明的最广义形式可应用于许多目的来改变突变、通过野生型的恢复改正突变、诱导突变、通过破坏编码区使酶失活、通过改变编码区调节酶的生物活性、通过破坏编码区改变蛋白。
[0122]本发明也涉及将基本按照本文上述的寡核苷酸应用于改变细胞、通过野生型的恢复改正突变、诱导突变、通过破坏编码区使酶失活、通过改变编码区调节酶的生物活性、通过破坏编码区改变蛋白、错配修复、(植物)遗传物质的靶向改变、包括基因突变、靶向基因修复和基因敲除。优选地，按照本发明的方法用于靶向改变双链受体DNA，该DNA获自植物、存在于植物中或递呈给植物。
[0123]本发明还涉及试剂盒，优选地包括至少一条，优选两条用于本发明方法的寡核苷酸，并且如文中限定，与具有TNE能力的蛋白的任意组合。
[0124]具体地，所述试剂盒包括按照本文所述方法和权利要求靶向改变双链DNA的说明书。说明书基本包括按照本文所述发明方法的步骤描述。
[0125]具体地，本发明提供了含有说明书的试剂盒，该试剂盒用于实施按照本发明和文中所述靶向改变双链受体DNA的方法，其中试剂盒还包括用于本文所述方法中的至少两条寡核苷酸，优选如本文所述 的至少两条寡核苷酸。
[0126]在该实施方式中，试剂盒可包括至少第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，每条寡核苷酸独立地包含能分别与第一或第二 DNA序列杂交的至少一个结构域，该结构域包含或直接相邻于分别相对于第一或第二 DNA序列的至少一个错配，其中所述至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个，优选最多I个核苷酸处，最优选所述至少一个错配位于所述寡核苷酸的3’末端，其中第一寡核苷酸上的错配和第二寡核苷酸上的错配各自靶向不同的核苷酸，其中第一链上靶向的核苷酸占据了第二链上靶向的核苷酸的互补位置，例如，所述核苷酸在双链DNA中形成碱基对，并且另外包括按照本发明的方法实施的说明书。
[0127]本领域技术人员可以理解的是，通过提供至少说明以下内容的说明书:上述错配位于寡核苷酸的3’末端或距离3’末端I个核苷酸处或距离3’末端2个核苷酸处，并且所述寡核苷酸能用于改变双链DNA序列，包括这些说明书和寡核苷酸的这种试剂盒在前述和权利要求书保护的试剂盒的范围之内。
[0128]所述的试剂盒，例如，也可采用网页或文件形式提供实施按照本发明的方法靶向改变双链受体DNA的说明书或信息，如本文描述和揭示，并且(单独)提供或供应如本文描述和公开的适于按照本发明方法使用的寡核苷酸。
[0129]在一个优选的实施方式中，提供了按照本发明的试剂盒，如上所述，其中所述的寡核苷酸与含有第一 DNA序列和互补于第一 DNA的第二 DNA序列的双链受体DNA序列组合时，包括能够与第一 DNA序列杂交的结构域，该结构域包含或直接相邻于相对第一 DNA序列的至少一个错配，所述至少一个错配位于距离所述寡核苷酸3’末端最多2个，优选最多I个核苷酸处，最优选所述的至少一个错配位于寡核苷酸的3’末端。[0130]在一个优选的实施方式中，提供了试剂盒，其中，当与包含第一 DNA序列和与第一DNA序列互补的第二 DNA序列的双链受体DNA组合时，第一寡核苷酸序列包含能够与第一DNA序列杂交的至少一个结构域并且第一寡核苷酸还包含相对于第一 DNA序列的至少一个错配，该至少一个错配位于距离所述的第一寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸处，第二寡核苷酸包含能够与第二 DNA序列杂交的至少一个结构域并且第二寡核苷酸还包含相对于第二 DNA序列杂交的至少一个错配，该至少一个错配位于距离所述的第二条寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸处，其中，第一寡核苷酸中的至少一个错配相对于双链受体DNA中的第一 DNA序列中的核苷酸并且第二寡核苷酸中的至少一个错配相对于双链受体DNA中的第二DNA序列中的核苷酸，并且所述的核苷酸占据了双链受体DNA的互补位点(例如,在双链受体DNA中形成碱基对)。
[0131]本领域技术人员应理解的是，在优选的实施方式中，第一寡核苷酸中的错配和第二寡核苷酸中的错配，各自针对双链DNA中的一个(相同)的碱基对的不同核苷酸，以及优选地当两个错配都引入双链DNA时，这些核苷酸互补并且可形成其引入的双链DNA中的碱基对(A-T/C-G)。
实施例
[0132]实施例1:在烟草原生质体中GFP附加体上使用2条寡核苷酸的TNE
[0133]TNE包括向细胞引入寡核苷酸，在基因组的靶位点通过寡核苷酸的错配核苷酸驱动诱导突变。
[0134]在下面的实验中，TNE的精度和效率通过在携带含有框中终止密码子的非功能性绿色荧光蛋白(GFP)附加体(质粒)上实施TNE确定。设计两条寡核苷酸分别在3’末端携带能够修复GFP中的终止密码子的错配核苷酸。质粒与两条寡核苷酸的共转染恢复GFP的表达和活性，在下面的实验中，在原生质体转染24小时后在单个细胞水平评分。第一个实施例描述了在烟草原生质体中实施的实验。
[0135]材料和方法
[0136]构建体
[0137]合成功能性GFP开放阅读框并优化爺科植物(Solanaceae)中的密码子使用。如图1所示，通过位点82的核苷酸改变(G到T)产生GFP变体。这产成了框内终止密码子，所得蛋白的氨基酸序列如图2所示。GFP开放阅读框(GFP野生型)和GFP终止密码子变体(GFP-终止)克隆得到基于pUC的含有CaMV35S启动子的用于在植物细胞中表达基因的载体的多克隆位点中的Xho1-SacI片段。这得到了构建体pKG7381 (GFP-野生型)和pKG7384(GFP-终止)。另外，GFP融合了 6xHIS标签和NLS (序列核定位信号)翻译，以辅助GFP蛋白在原生质体核中的积累然后改善我们评分GFP阳性细胞的能力。这些构建体如图3所示。
[0138]寡核苷酸
[0139]修复GFP基因中的终止密码子的寡核苷酸如表1所示。