错位双链寡核苷酸在制备治疗人类肝癌等药物中的应用制作方法

聂实践, 胡冬琴

2004年1月14日

2002年7月11日

2002年7月11日

北京百林康源生物技术有限责任公司

A61P1/00GK1467218SQ0212410

寡核苷酸 双链 错位 制备 治疗 人类

1.一种用于治疗人类恶性肿瘤的化合物，该化合物是错位双链寡核苷酸PolyI·PolyC11-32U或称rIn·r(C11-32U)n，其特征在于所述错位双链寡核苷酸是以核糖核酸RNA为对照物，分子量大小分布以沉降系数表示，集中在7S-28S范围内；或分子量大小分布，以碱基数表示，集中在100-10,000的范围内2.如权利要求1所述的错位双链寡核苷酸在制备治疗人类恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于所述人类恶性肿瘤为肝癌、肺癌、艾氏瘤、、黑色素瘤、乳腺癌或宫颈癌等恶性肿瘤3.一种用于治疗人类恶性肿瘤的药物，其特征在于该药物是由权利要求1所述的治疗人类恶性肿瘤的化合物和药物载体组成4.如权利要求3所述的用于治疗人类恶性肿瘤的药物，其特征在于所述药物为注射剂

本发明涉及错位双链寡核苷酸在制备治疗人类肝癌等药物中的应用，特别是在制备治疗人类肝癌、肺癌、艾氏瘤和黑色素瘤等药物中的应用引发肝癌的机理目前还不很清楚有学者认为，乙型肝炎病毒引发肝癌的途径，是由于先有HBV酿成肝炎，肝炎又导致肝硬变，使肝细胞发生不典型增生，继而发展成肝癌；另有一些学者则认为慢性肝炎可以不经过肝硬变阶段而直接导致肝癌的发生但他们不同的观点中有一点是一致的，即HBV可能是人类肝癌发病诸多因素中的主要启动因素错位双链寡核苷酸(错位dsRNA)的结构是两条单链核糖核酸(RNA)以所谓互补的方式由氢键相连构成的双螺旋结构dsRNA被预期具抗癌的生理活性，但我国对错位dsRNA的研究与应用几乎处于停滞状态，原因是由于原有的核酸类药物明显的毒副作用而限制了它的临床使用本发明的原理一、错位dsRNA的药理作用错位dsRNA为一类广谱的抗病毒材料，它可以刺激机体产生广谱的内源干扰素及其它免疫因子，干扰病毒合成，改变细胞骨架，促进2’，5’-寡聚腺苷酸合成，激活蛋白激活酶和RNAL酶的活力，以降解进入机体的病毒，提高机体综合免疫能力，保护正常细胞免受病毒感染；同时错位dsRNA还能够激活干扰素、白细胞介素、自然杀伤细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞、巨噬细胞的抗增殖作用，调节肿瘤的细胞生长，使之趋向正常化并失去瘤细胞表型，达到抑制、治疗恶性肿瘤的目的，同时保护正常细胞免受侵害错位dsRNA为对恶性肿瘤及AIDS病有明显的疗效，对人类免疫缺陷病作用十分明显，对于源于HIV感染的疾病，如艾滋病血清阳性、艾滋病前期以及艾滋病病人，施用错位dsRNA，可提高机体免疫系统功能二、错位dsRNA的制备和修饰错位dsRNA的制备方法是以RNA为基体，经退火而成；核酸是核糖等与嘌呤坏或嘧啶环相连，两条RNA以所谓互补的方式由氢键相连构成双螺旋结构本发明所制备的错位dsRNA采用申请号为01115648.1中所述方法制备经过修饰的具有特定序列的错位dsRNA在体内停留时间很短，可以很快地被RNA酶水解为短的碱基对片段，因此毒性大大降低；小的碱基对片段可以在细胞膜间传递，进入细胞内部发挥免疫作用，也可穿过粘膜，对体液、脑组织液等也有免疫作用技术方案一种用于治疗人类恶性肿瘤的化合物，该化合物是错位双链寡核苷酸PolyI·PolyC11-32U或称rIn·r(C11-32U)n，所述错位双链寡核苷酸是以核糖核酸RNA为对照物，分子量大小分布以沉降系数表示，集中在7S-28S范围内；或分子量大小分布，以碱基数表示，集中在100-10,000的范围内错位双链寡核苷酸在制备治疗人类恶性肿瘤药物中的应用，所述人类恶性肿瘤为肝癌、肺癌、腹水癌、、黑色素瘤、乳腺癌或宫颈癌等恶性肿瘤一种用于治疗人类恶性肿瘤的药物，药物是由权利要求1所述的治疗人类恶性肿瘤的化合物和药物载体组成所述药物为注射剂有益效果本发明的错位dsRNA，毒性小，对肝癌、肺癌、腹水癌、乳腺癌等恶性肿瘤有明显的抑制作用下列实施例中所使用的错位双链寡核苷酸为PolyI·PolyC12U或称rIn·r(C12U)n，在试验数据中用PolyIC12U表示实施例1错位dsRNA体外抑瘤活性试验(in vitro)(一)材料和方法1、受试药物PolyIC12U，安瓿针剂1mg/ml/支，药液无色透明，室温下保存2、试剂RPMI1640，小牛血清，MTT，DMSO和青链霉素等3、仪器BIO-RAD450型酶标仪4、人癌细胞株KB细胞(口腔癌)HCT-8(结肠癌)Bal-7402(肝细胞癌)A549(非小细胞肺癌)A2780(卵巢癌) MCF-7(乳腺癌)5、试验方法按常规MTT法，将细胞培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5％CO2的孵箱培养24小时常规方法计瘤细胞数，用RPMI1640液调整瘤细胞数至5～6×103/ml用96孔培养板进行药敏试验，每孔接种1000～1200个处于对数生长期的细胞液200μl37℃培养24小时后，弃去上清夜，除对照孔应换原培养液外，其它孔加入预先用RPMI1640稀释成不同浓度的PolyIC12U液，其终浓度分别为20，10，5，2.5，1.25，0.625μg/ml，每浓度设3个平行孔37℃、5％CO2培养3天届时弃去上清夜，用MTT法观察了本药对体外培养(in vitro)中的人癌细胞株的抑瘤活性BIO-RAD450型酶标仪，波长570nm，参数波长450nm下测定光密度值以不加PolyIC12U的瘤细胞对照组的3个平等孔OD值为对照求给药组肿瘤细胞存活率 (二)结果见表1根据测定结果，求出IC50值表1PolyIC12U对人癌细胞株的生长抑制作用(in vitro)人癌细胞株 半数抑制浓度(IC50)(μg/ml)KB(人口腔癌) 16.3HCT-8(人结肠癌) 43.8Bel-7402(人肝细胞癌) 21.2A549(人非小细胞肺癌) 18.6A2780(人卵巢癌) 14.8MCF-7(人乳腺癌) 19.5结果表明，PolyIC12U对体外培养中6种人癌细胞株的抑瘤活性不明显，的半数抑制浓度(IC50)值都大于10μg/ml，与文献报道一致(三)结论PolyIC12U如对体内试验的瘤株效果明显，则以上结果可以解释为本药的作用机理是通过调节体内因素如增强机体内NK细胞的活性达到抑制肿瘤作用的实施例2PolyIC12U对小鼠移植性肿瘤H22的抑瘤活性(一)材料和方法1、药物PolyIC12U(同实施例1)、环磷酰胺(CTX)200mg/支，白色粉针剂，用前以生理盐水(NS)稀释至所需浓度CTX是目前临床应用很广的一种具有抗细胞毒作用的抗癌药，疗效明显但毒性大2、动物试验用KM，G57BL，BAL B/L，DBA和T739品系的小鼠，购自中国医学科学院实验动物中心，均为II级实验动物3、瘤源小鼠移植性肿瘤H22(肝癌)，为中国医学科学院肿瘤研究所保藏瘤株采用腹水或瘤细胞匀浆液，用NS稀释并计数后，调整瘤细胞浓度至1×107/ml左右，每鼠于右前腋皮下接种0.2ml即2×106个细胞瘤细胞制备和肿瘤接种的全过程都在无菌操作下完成4、分组给药每批试验用小鼠50只，随机均分5组，每组10只，分别为对照组(NS20ml/kg，ip)，CTX组(30mg/kg)，PolyIC12U低剂量组(L，5mg/kg)，中剂量组(M，510mg/kg)，高剂量组(H，20mg/kg)，各组给药容积均为20ml/kg腹腔注射给药(po)肿瘤接种后24小时开始给药，每天1次，连续8～12次，末次给药后24小时处死动物，称体重后完整剥取瘤结并称重 (二)结果见表2表2PolyIC12U对小鼠移植性肿瘤H22的抑瘤活性动物数 给药剂量途径动物体重 瘤重 抑制率组别 (只) (mg/kg)(X±SD，g) (X±SD，g) (％)P始 终 始 终对照组10 10 NS20ml/kg×8，po18.6±0.8 24.1±4.63.68±0.75CTX组 10 10 30×8，ip 18.3±0.6 24.1±3.60.77±0.39 79.08 ＜0.001*L 10 10 5.0×8，po 18.7±0.9 31.0±3.32.48±0.75 32.61 ＜0.01*M 10 10 10.0×8，po 18.4±0.5 29.5±4.01.86±0.39 49.46 ＜0.001*H 10 10 20.0×8，po 18.7±0.8 27.6±3.11.26±0.11 65.76 ＜0.001** 注1、L、M、H分别代表PolyIC12U的低、中、高剂量组2、*为与对照组比较**为与CTX组比较(三)结论表2的结果说明，本药对小鼠肝癌H22在所有剂量下显示出较好的抑瘤作用，且有明确的量效关系，高剂量组抑瘤率达65.76％，虽低于CTX组的79.08％，但动物体重增长高于CTX组实施例3PolyIC12U对小鼠移植性ESC的抑瘤活性(一)材料和方法1、药物同实施例22、动物同实施例23、瘤源小鼠移植性肿瘤ESC(艾氏瘤实体型)为中国医学科学院肿瘤研究所保藏瘤株采用腹水或瘤细胞匀浆液，用NS稀释并计数后，调整瘤细胞浓度至1×107/ml左右，每鼠于右前腋皮下接种0.2ml即2×106个细胞瘤细胞制备和肿瘤接种的全过程都在无菌操作下完成4、分组给药每批试验用小鼠50只，随机均分5组，每组10只，分别为对照组(NS20ml/kg，ip)，CTX组(30mg/kg)，PolyIC12U低剂量组(L，5mg/kg)，中剂量组(M，10mg/kg)，高剂量组(H，20mg/kg)，各组给药容积均为20ml/kg腹腔注射给药(po)肿瘤接种后24小时开始给药，每天1次，连续8～12次，末次给药后24小时处死动物，称体重后完整剥取瘤结并称重计算公式同实施例2(二)结果见表3表3PolyIC12U对小鼠移植性肿瘤ESC的药效观察动物数 给药剂量途径动物体重 瘤重 抑制率组别 (只) (mg/kg) (X±SD，g) (X±SD，g)(％) P始 终 始 终对照组10 10 NS20ml/kg×10，po 18.4±0.7 24.8±4.52.79±0.96CTX组 10 10 30×10 18.5±0.9 26.8±5.00.96±0.3665.59 ＜0.001*L 10 10 5.0×10 18.4±0.7 28.1±2.72.05±0.5226.52M 10 10 10.0×1018.6±0.8 28.0±2.91.86±0.5033.33 ＜0.01*H 10 10 20.0×1018.4±0.8 28.1±3.01.65±0.6540.86 ＜0.001*注1、L、M、H分别代表PolyIC12U的低、中、高剂量组2、*为与对照组比较(三)结论表3的结果说明PolyIC12U20ml/kg对小鼠ESC有明显的抑瘤作用，量效关系较好，给药后体重变化与对照组相近，而且体重增长高于CTX组实施例4PolyIC12U腹腔注射对L795远地转移的影响(一)材料和方法1、药物同实施例22、动物同实施例23、瘤源小鼠移植性肿瘤L795(肺腺癌)，为中国医学科学院肿瘤研究所保藏瘤株采用腹水或瘤细胞匀浆液，用NS稀释并计数后，调整瘤细胞浓度至1×107/ml左右，每鼠于右小腿皮下接种0.2ml即2×106个细胞瘤细胞制备和肿瘤接种的全过程都在无菌操作下完成4、分组给药每批试验用小鼠50只，随机均分5组，每组10只，分别为对照组(NS20ml/kg，ip)，CTX组(30mg/kg)，PolyIC12U低剂量组(L，5mg/kg)，中剂量组(M，510mg/kg)，高剂量组(H，20mg/kg)，各组给药容积均为20ml/kg腹腔注射给药肿瘤接种后24小时开始给药，每天1次，连续8～12次，末次给药后24小时处死动物L795隔日测量肿瘤最大直径，停药后处死小鼠，摘取右肺Bouins’液固定，计数5个肺叶的转移灶数 (二)结果见表4表4PolyIC12U腹腔注射对L795远地转移的影响组别 动物数(只) 肺转移病灶平均数 转移抑制率％对照组 10 62.3CTX组 10 1.098.39L 10 23.1 62.92M 10 30.4 51.2H 10 17.4 72.07注1、L、M、H分别代表PolyIC12U的低、中、高剂量组(三)结论表4的结果说明PolyIC12U腹腔注射可有效地抑制L795远地转移实施例5PolyIC12U对小鼠移植性肿瘤B16的抑瘤活性(一)材料和方法1、药物同实施例22、动物同实施例23、瘤源小鼠移植性肿瘤B16(黑色素瘤)，为中国医学科学院肿瘤研究所保藏瘤株采用腹水或瘤细胞匀浆液，用NS稀释并计数后，调整瘤细胞浓度至1×107/ml左右，每鼠于右前腋皮下接种0.2ml即2×106个细胞瘤细胞制备和肿瘤接种的全过程都在无菌操作下完成4、分组给药每批试验用小鼠50只，随机均分5组，每组10只，分别为对照组(NS20ml/kg，ip)，CTX组(30mg/kg)，PolyIC12U低剂量组(L，5mg/kg)，中剂量组(M，510mg/kg)，高剂量组(H，20mg/kg)，各组给药容积均为20ml/kg腹腔注射给药肿瘤接种后24小时开始给药，每天1次，连续8～12次，末次给药后24小时处死动物，称体重后完整剥取瘤结并称重计算公式同实施例2(二)结果见表5表5PolyIC12U对小鼠移植性肿瘤B16的抑瘤活性动物数 给药剂量途径 动物体重 瘤重抑制率组别 (只) (mg/kg，ip) (X±SD，g) (X±SD，g) (％) P始 终 始 终对照组10 10 NS20ml/kg×1719.8±0.9 21.4±2.12.40±0.55CTX组 10 10 30×17 20.1±1.5 20.5±0.91.04±0.3256.67 ＜0.001*L 10 9 ^5.0×17 19.7±1.0 19.9±1.51.28±0.3546.67 ＜0.001*M 10 9 ^10.0×17 19.9±1.3 20.3±1.80.88±0.2963.33 ＜0.001*＞0.8**H 10 8 ^20.0×17 19.9±1.1 22.0±2.10.63±0.3373.75 ＜0.001*＜0.02**注1、L、M、H分别代表PolyIC12U的低、中、高剂量组2、*为与对照组比较**为与CTX组比较3、^为非药物原因死亡(三)结论表5的结果说明，本药对小鼠黑色素瘤B16在所有剂量下显示出较好的抑瘤作用，且有明确的量效关系，高剂量组抑瘤率达73.75％，高于CTX组的79.08％，而且动物体重增长也高于CTX组实施例6、PolyIC12U静脉注射一次性给药对小鼠的急性毒性观察(一)材料和方法1、药物PolyIC12U安瓿针剂，1mg/ml/支药液无色透明，可直接用于注射，也可用生理盐水(NS)稀释至所需浓度后用于试验，4℃冰箱保存2、动物KM种小鼠50只，雌雄各半，体重20±2.0g，购于中国医学科学院实验动物所，为II级实验动物3、方法50只小鼠按性别随机分为5组，每组10只；雌雄各5只，分笼饲养在预试验基础上，确定5个组的给药剂量分别为50.0mg，47.5mg，45.13mg，42.87mg和40.73mg(等比例差0.95)每组动物依相应剂量一饮性静脉注射给药观察记录动物出现的急性毒性反应，中毒症状出现和消失的时间，反应程度，小鼠死亡前的特征和死亡时间，解剖死亡动物观察内脏病变，给药后连续观察14天，届时处死存活小鼠并剖检用Bless法计算出LD50值(二)结果给药后各剂量组小鼠未出现任何异常表现，小鼠活性正常，口、鼻、眼、眦无分泌物，毛发光泽不紊乱，饮食二便正常观察期内小鼠无死亡，给药前和处死前的体重分别为20.0±2.0g和33.6±3.1g给药未影响体重的正常增长各组小鼠处死后剖检未发现肉眼可见的病理改变(三)结论小鼠一次性静脉注射PolyIC12U 40.73～50.00mg/kg后，均未出现明显的毒性反应，无动物死亡，处死的动物内脏亦无明显病理改变鉴于50mg/kg的给药容积和药物浓度都已达到小鼠可以耐受的最高值，而动物并无死亡，所以LD50值不能测出实施例7、PolyIC12U对小鼠最大耐受量的测定(一)材料和方法1、药物同实施例62、动物同实施例63、方法选用健康KM小鼠30只，雌雄各15只，给药剂量50mg/kg首次静脉注射PolyIC12U后观察6小时，如无明显毒性反应出现，再以同剂量重复给药一次(间隔6小时)观察2周，记录毒性反应出现的时间和程度，处死后剖检(二)结果PolyIC12U以50mg/kg的剂量，间隔6小时共给药2次后，在2周的观察期内，小鼠无明显毒性反应(亦无死亡)，处死后剖检主要脏器，未见到肉眼可辨的病理变化，动物的表现与测量小鼠LD50试验相同(三)结论50mg/kg间隔6小时给小鼠静脉注射2次，未见毒性反应出现，测得的MTD值为100mg/kg实施例8、PolyIC12U静脉注射一次性给药对大鼠的急性毒性观察(一)材料和方法1、药物同实施例6 2、动物Wistar品系大鼠50只，雌雄各半，体重52～62g，购于中国医学科学院实验动物中心，为II级实验动物3、方法50只大鼠按性别随机分为5组，每组10只；雌雄各5只，分笼饲养在预试验基础上，确定5个组的给药剂量分别为50.0mg，47.5mg，45.13mg，42.87mg和40.73mg(等比例差0.95)每组动物依相应剂量一次性静脉注射给药观察记录动物出现的急性毒性反应，中毒症状出现和消失的时间，反应程度，大鼠死亡前的特征和死亡时间，解剖死亡动物观察内脏病变，给药后连续观察14天，届时处死存活大鼠并剖检用Bless法计算出LD50值(二)结果给药2周后各剂量组大鼠未出现明显毒性反应，亦无1例死亡处死后剖检，主要脏器未发现病理变化1mg/ml是PolyIC12U的最高浓度，50g的大鼠一次注射2.5ml已属最大允许容积，故本试验不能测知PolyIC12U对大鼠的LD50值(三)结论急性毒性实验显示，错位dsRNA无近期毒性实施例9、PolyIC12U对大鼠最大耐受量的测定(一)材料和方法3、药物同实施例84、动物同实施例83、方法Wistas大鼠20只，雌雄各10只，体重50～60g给药剂量50mg/50ml/kg首次静脉注射PolyIC12U后观察6小时，如无明显毒性反应出现，再以同剂量重复给药一次(间隔6小时)观察2周，记录毒性反应出现的时间和程度，处死后剖检(二)结果PolyIC12U以50mg/50ml/kg的剂量，间隔6小时共给药2次后，大鼠无明显毒性反应(亦无死亡)，处死后剖检主要脏器，未见到肉眼可辨的病理变化本试验测得的MTD值为100mg/kg