治疗血栓性疾病的反义寡核苷酸的结构与用途制作方法

王升启, 江其生

2004年1月14日

2002年7月8日

2002年7月8日

中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 桂林集琦集团有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院放射医

A61P7/02GK1467217SQ02123678

寡核苷酸 反义 血栓性 疾病 治疗

1.本发明涉及的反义寡核苷酸(ASODN)是与PAI-1mRNA的5’区、翻译区、3’区的互补寡核苷酸，其长度为10-30个碱基2.本发明涉及的反义寡核苷酸(ASODN)最佳序列为PAI86、PAI508、PAI588、PAI1265、PAI1316，其序列如下所示序号名称 作用位点(nt) 长度(nt) 序列(5’-3’)1 PAI86 67-8620 GAC ATC TGC ATC CTG AAG TT7 PAI508 489-508 20 TGA CCG TGC TCC GGA ACA GC8 PAI588 569-588 20 GAT CAT ACC TTT TGT GTG TG14 PAI12651246-126520 CCC ATG AAA AGG ACT GTT CC15 PAI13161297-131620 TTT GTC CCA GAT GAA GGC GT3.根据权利要求1和2，经化学修饰后的寡核苷酸可在制备治疗血栓性疾病及血栓相关性疾病的药物中应用

本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种针对PAI-1基因的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)的序列结构及其成为治疗血栓性疾病，减少血栓相关性疾病危害性的新型药物血栓性疾病是一类高发病率、高致残率、高死亡率疾病，包括心肌梗塞、脑血栓、深静脉血栓形成、肺栓塞、多种严重疾病(感染、创伤等)晚期并发的弥散性血管内凝血(DIC)等国内资料显示由血栓栓塞引起的心肌梗塞、脑梗塞、肺梗塞等死亡人数总和位居其它疾病之首；美国资料表明血栓栓塞引起的死亡人数是癌症死亡人数的5倍多血栓性疾病最有效的治疗手段是溶栓处理目前临床常用的溶栓药物为纤溶酶原激活物类药物(如尿激酶、组织型纤溶酶原激活物等)，虽然临床应用取得了较理想效果，但也显示出易引起出血、半衰期短、价格昂贵等缺点近年来临床及基础研究均发现PAI-1升高是引起血栓性疾病的一个独立危险因素(Hasenstab D，et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2000，20(3)853-859.Anderson JL，et al.J Am Coll Cardiol.1999，34(6)1778-1783.)，提示从降低PAI-1入手有可能筛选出溶栓药物但目前尚无此类药物问世ASODN在导入细胞后能与靶基因mRNA结合形成DNA-RAN杂合体，封闭或抑制靶基因复制或表达，从而减少其“下游”产物-蛋白或酶的表达水平目前ASODN在恶性肿瘤、病毒感染性疾病(肝炎，流感等)、某些遗传性疾病及其它基因表达异常所致疾病的实验治疗中已取得较理想疗效，且与传统治疗药物相比彰显出作用时间长、作用特异性强、毒副作用小等优点，自1998年8月美国FDA批准首个抗病毒反义药物进入床应用以来，国外已有一批反义药物进入临床II-III期试验或临床试用(Joensen H，Ann Med. 2000，32(1)31-33.MorrisMJ，et al.Clin Cancer Res.2002，8(3)679-683.Corey DR.Telomerase inhibition，oligonucleotides，and clinical trials.Oncogene 2002，21(4)631-637)由David Ginsenberg等报道的人PAI-1mRNA为2786bp，利用生物信息学软件可模拟PAI-1mRNA的二级结构，作为设计ASODN的重要依据但由于PAI-1mRNA在细胞内的状态难以预测，因此所设计的ASODN能否接近PAI-1mRNA并与之杂交以封闭或减少PAI-1表达尚有待体内外实验做进一步筛选与评价本发明的目的在于寻找特异高效新型溶栓反义药物，即对PAI-1mRNA表达有较好抑制效应的ASODN及能改善其生物活性的化学修饰衍生物本发明的主要内容是，根据Gene Bank中David Ginsberg等报道的人PAI-1mRNA全长序列，参考计算机预测的二级结构，采用计算机辅助设计了27条硫代ASODN(见表1)，采用PE公司生产ABI8909型DNA自动合成仪合成并在合成时进行硫代修饰经Micro Pure II反向纯化柱(Solid Phase Sciences)纯化备用采用培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对上述ASODN进行体外活性筛选与评价结果证明有5条ASODN即PAI86、PAI508、PAI588、PAI1265、PAI1316等在浓度为0.25-1μmol/L浓度范围内对PAI基因表达具有特异性的剂量依赖性抑制作用，提示它们可用于血栓性疾病(如脑血栓形成、心肌梗塞、动脉粥样硬化、深静脉血栓形成等)的治疗表127条硫代反义寡核苷酸序列及性质序号名称 作用靶点性质 长度(nt)序列(5’-3’)1 PAI86 67-86 A 20 GAC ATC TGC ATC CTG AAG TT2 PAI76 57-76 A 20 TCC TGA AGT TCT CAG AGG TA3 PAI166 147-166 A 20 CGT AGG ATG GGG GAT GGT GC4 PAI218 199-218 A 20 TGC GCC ACC TGC TGA AAC AC5 PAI339 320-339 A 20 CTT GAA TCC CAT AGC TGC TT6 PAI382 363-382 A 20 TGT ACA GAT GCC GGA GGG CG7 PAI508 489-508 A 20 TGA CCG TGC TCC GGA ACA GC8 PAI588 569-588 A 20 GAT CAT ACC TTT TGT GTG TG9 PAI660 641-660 A 20 GTT GAA GTA GAG GGC ATT CA10 PAI775 756-775 A 20 TAT AGT TFA ACT TGT TGG TC11 PAI881 862-881 A 20 GGC ACC TCT TTT TCA TAA GG12 PAI11321113-1132 A 20 CGT TCA CCT CGA TCT TCA CT13 PAI12071188-1207 A 20 CCA TGA TGA TCT CCT CGG GG14 PAI12651246-1265 A 20 CCC ATG AAA AGG ACT GTT CC15 PAI13161297-1316 A 20 TTT GTC CCA GAT GAA GGC GT16 PAI12941275-1294 A 20 TTC CCC AGG GTC AGG GTT CC17 PAI15571538-1557 A 20 AGG CGT CAC CGT CTG GTT TG18 PAI18081789-1808 A 20 TGC CAC AGT GGA CTC TGA GA19 PA1905I1886-1905 A 20 GGG GAG GGA GAT GGC CAG GC20 PAI20782059-2078 A 20 ATA TGA TAA ATA TTT AGG TA21 PAI21952176-2195 A 20 GGC TGG ACT TCC TGA GAT AC22 PAI24692450-2469 A 20 AAA GTT CTG TCC TGG TAG GT23 PAI25022483-2502 A 20 CCA ATG CGG CTG TGA GTC AC24 PAI26142595-2614 A 20 AAA GAT TAT CTA AGG TAG TT25 PAI11031084-1103 A 20 CCC CTC CCC ACC AAG AGA TT26 PAI53-68 A 16 GAG GGC TGG AGA CAT C27 PAI53-68 S 16 GAG GGC TGA AGA CAT C注AASODN；Sscramble根据本发明，针对PAI-1mRNA 3’区(PAI1265)、5’区(PAI86)及翻译区(PAI508、PAI588、PAI1316)的ASODN能特异性抑制PAI-1基因的表达，有可能成为治疗血栓性疾病的新型生物工程药物根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度、及组织靶向性等，本发明包含了PAI86、PAI508、PAI588、PAI1265、PAI1316的各种化学修饰，例如硫代修饰、半乳糖直接修饰、亲脂性分子或PH敏靶向脂质体修饰等根据本发明，发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的试剂根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其它反义寡核苷酸及其衍生物根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适量的剂量给药根据本发明，本发明的实施对严重危害人类健康的血栓性疾病的治疗与预防具有重要的社会和经济效益上述活性实验结果表明，PAI86、PAI508、PAI588、PAI1265、PAI1316在一定的剂量和时间范围内可抑制PAI-1Ag表达、降低PAI-1活性以及增加t-PA活性，提示可用于血栓性疾病的治疗表25条有效ASODN序列、作用靶点及靶基因的局部结构ASODN序号 作用靶点靶基因局部结构 ASODN序列PAI86 67-86 多分枝环 GAC ATC TGC ATC CTG AAG TTPAI508 489-508 多分枝环 TGA CCG TGC TCC GGA ACA GCPAI588 569-588 多分枝结构 GAT CAT ACC TTT TGT GTG TGPAI1265 1246-1265 内环 CCC ATG AAA AGG ACT GTT CCPAI1316 1297-1316 内环 TTT GTC CCA GAT GAA GGC GT表3ASODN对PAI-1Ag(ng/mL)表达的抑制效应24h 48h序列C0.10.25 0.51.0(uM) C 0.10.25 0.51.0(uM)PAI86 173.3±35.1 200.3±60.0 98.3.0±16.7 52.3±13.1*68.3±6.7*290.0±57.2 302.7±34.5 150.6±18.8*109.3±14.0*110.3±11.6*PAI508 173.3±35.1 183.0±27.1 63.0±12.2*52.0±16.1*52.6±7.6*290.0±57.2 343.6±33.0 215.0±29.1*131.0±27.2*154.0±22.0*PAI588 173.3±35.1 127.3±27.2 104.6±21.8 104.7±21.8 77.0±10.5*290.0±57.2 316.3±29.6 21.8±29.7 113.6±11.6*141.3±16.8*PAI1265 173.3±35.1 197.3±17.5 121.3±19.1*103.7±16.2*89.0±19.1**290.0±57.2 330.3±34.7 137.5±18.2*91.0±18.6**61.7±14.4**PAI1316 173.3±35.1 193.3±26.5 189.6±23.0 116.0±18.0*114.3±20.1*290.0±57.2 292.3±18.2 134.7±21.2*150.0±21.6*104.3±23.7**Note*P＜0.05，**P＜0.01vs Cat same time.表4ASODN对PAI-1活性(×10-2AU/mL)的抑制效应24h 48h序列C 0.1 0.25 0.5 1.0(uM) C 0.10.25 0.5 1.0(uM)PAI86 14.3±1.5 12.3±2.1 10.3±1.5 10.3±1.2*10.0±1.7 15.0±1.5 12.0±2.6 8.0±1.5*9.0±1.0**9.0±1.2**PAI508 14.3±1.5 11.0±2.6 9.7±1.5*9.7±0.8*9.0±0.2*15.0±1.5 13.0±2.5 10.0±1.7 9.0±1.1*8.1±1.1*PAI588 14.3±1.5 11.3±3.1 11.7±3.1 9.7±1.1 9.3±1.5*15.0±1.5 13.0±2.0 11.1±3.1*9.0±1.1*9.0±0.6**PAI1265 14.3±1.5 11.3±3.1 10.3±1.5 9.7±1.2**7.7±0.6**15.0±1.5 11.1±0.6 9.0±2.1*8.0±1.7**7.1±0.6**PAI1316 14.3±1.5 13.1±3.6 11.3±2.5*9.3±0.6*8.3±0.6*15.0±1.5 12.1±2.5*10.0±1.1*8.1±1.2**7.1±0.6**Note*P＜0.05，**P＜0.01vs Cat same time.表5ASODN对t-PA活性(×10-4IU/mL)的增强效应24h 48h序列C 0.1 0.25 0.51.0(uM)C 0.10.25 0.51.0(uM)PAI86 4.7±1.2 8.7±.2.1 10.7±0.6*12.7±0.6**13.3±0.6**6.7±1.2 8.0±1.1 9.3±0.6*11.3±1.5**14.7±2.1**PAI508 4.7±1.2 9.3±2.110.7±1.5**12.7±0.6**13.3±15**6.7±1.2 8.0±2.6 10.0±1.1 11.3±0.6**13.7±0.6**PAI588 4.7±1.2 10.3±1.7 11.3±21*11.3±1.5**13.3±1.5**6.7±1.2 8.3±1.7 10.0±2.7**11.3±1.5**14.0±1.0**PAI1265 4.7±1.2 9.3±1.510.3±1.5*10.7±1.5*12.7±0.6**6.7±1.2 8.3±2.6 10.7±1.5*13.3±1.5**14.0±2.0**PAI1316 4.7±1.2 9.7±1.5*12.7±2.1*11.6±1.2*13.0±1.0**6.7±1.2 8.3±1.2 10.0±1.0 12.0±1.7**12.7±2.1**Note*P＜0.05，**P＜0.01vs Cat same time.