专利名称：使用减毒大肠杆菌不耐热肠毒素治疗过敏症的制作方法使用减毒大肠杆菌不耐热肠毒素治疗过敏症相关申请本申请要求2010年3月23日提交的美国申请No. 12/729，649的优先权，其内容全部并入于此。病理性Th2型免疫反应介导的过敏性哮喘是西方国家的一个主要健康问题。过敏性哮喘的症状包括粘液增多及呼吸道高反应性。反复暴露于过敏原是该疾病的重要致病因 素。类固醇和其他抗炎药物常用于治疗过敏性哮喘。这些药物仅能缓解哮喘症状，不能预防过敏性免疫应答的出现。最近，人们开发了一种作为预防形式的过敏症疫苗。典型的过敏症疫苗包括诱导特异性免疫应答的过敏原(例如，花粉过敏原或微生物过敏原)以及增强所述过敏原-特异性免疫应答的佐剂(例如，CpG寡核苷酸或突变的大肠杆菌不耐热肠毒素)。发明概述本发明基于如下意料不到的发现单独的或与过敏原结合的减毒大肠杆菌不耐热肠毒素(E.coli heat-labile enterotoxin, LT)突变体可有效用于治疗过敏性哮喘。因此，本发明一个方面的特征在于一种用于治疗过敏症(如过敏性哮喘)的方法，以有效量向有需要的个体(subject)(例如，罹患哮喘或具有感染哮喘的危险)施用减毒LT突变体用于诱导抗过敏应答。相比于其野生型对应株(counterpart),减毒LT突变体显示出大幅降低的毒性。也就是说，当按照常规Y-I肾上腺细胞试验测定时，其毒性水平不超过其野生型LT对应株的1%，或者当按照常规Caco-2细胞试验测定时，不超过野生型对应株的10%。本发明方法中所用的减毒LT可以含有突变的亚单位A，例如，在与如下所示的SEQID NO: I的位点61或位点63相应的位点上含有氨基酸取代的亚单位A突变体。LTS61K和LTS63K为两个实例。单独的或与过敏原结合的减毒LT可被配制成药物组合物，进行粘膜(例如，鼻内或舌下)给药或其他途径(如经皮递送(transcutaneous delivery))给药。同样在本发明范围内的是上述提及的药物组合物，其通过例如粘膜或经皮给药用于治疗过敏症，或用于制备治疗药物。本发明的一个或多个具体实施方案如下所描述。通过下面的附图和多个实施方案详述，以及所附的权利要求将能明显看出本发明的其他特征或优势。首先描述附图。图I是显示了使用LT突变体LTS61K、过敏原Der P或其结合处理哮喘小鼠的预防方案和治疗方案的图表。图2是显示了按照图I所示预防方案采用LTS61K、Der p或其结合(LTS61K/DerP)处理的小鼠的AHR水平(以Penh值表示)的图表。* :p〈0. 05 (LTS61K/Der p vs生理盐水)。+ p<0. 05 (LTS61K/Der p vs 单独的 Der p)。++ p<0. 01 (LTS61K/Der p vs 单独的Der p)。通过双因素方差分析(ANOVA)获得p值。LT代表LTS61K。图3是显示了按 照图I所示治疗方案采用LTS61K、Der p或其结合(LTS61K/DerP)处理的小鼠支气管肺泡灌洗(BAL)液中某些细胞因子(A IL-5 ；B TNF-a ；C :IL_12 ；D :嗜酸性粒细胞趋化因子和E :TARC)的水平的图表。* p<0. 05 (LTS61K vs对照或LTS61K/DerP vs 生理盐水)。+ :p〈0. 05CLTS61K vs 单独的 Der p 或 LTS61K/Der p vs 单独的 Der p)。++ p<0. 01 (LTS61K vs 单独的 Der p 或 LTS61K/Der p vs 单独的 Der p)。通过学生 t_ 检验(Student t-test)获得 p 值。LT 代表 LTS61K。图4是显示了按照图I所示预防方案采用LTS61K、Der p或其结合(LTS61K/DerP)处理的小鼠中Der P-特异性IgA的血清(组a)和BAL液(组b)水平的图表。* p<0. 05(LTS61K/Der p vs 单独的 Der p)。++ p<0. 01 (LTS61K/Der p vs 生理盐水)。通过学生t_检验获得P值。LT代表LTS61K。图5是显示了按照图I所示治疗方案采用LTS61K、Der p或其结合(LTS61K/DerP)处理的小鼠中Der P-特异性IgA的血清(组a)和BAL液(组b)水平的图表。* p<0. 05(LTS61K/Der p vs 单独的 Der p)。+ p<0. 05 (LTS61K/Der p vs 生理盐水)。通过学生t_检验获得P值。LT代表LTS61K。发明详述本文描述的是一种采用有效量的单独使用或与过敏原结合的减毒LT突变体以治疗过敏症(如过敏性哮喘)的方法。本文所用的术语“治疗”是指以治愈(cure)、痊愈(heal)、缓解(alleviate)、减轻(relieve)、改变(alter)、补救(remedy)、转好(ameliorate)、改善(improve)或影响(affect)疾病、疾病症状或易患病体质为目的，向具有过敏性疾病、过敏性疾病症状或易患过敏性疾病体质的个体应用或给药包含一种或多种活性剂的组合物。本发明方法中使用的减毒LT突变体的“有效量”是指对个体产生治疗效果即诱导抗过敏性应答从而缓解个体过敏症状所需的LT突变体的量。抗过敏性应答包括抑制与过敏性应答相关的激活免疫细胞的渗透和募集(recruitment)、增加IgA (尤其是非抗原特异性IgA)的分泌、减少TARC分泌以及抑制Th2型免疫应答。Th2型免疫应答以Th2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)的释放为特征，引起产生体液免疫、激活嗜酸性粒细胞(espinophil)、调节细胞介导的免疫应答以及刺激IgE生产。本领域技术人员已知，依据给药途径、赋形剂用量和其他共用活性剂，有效量是可以变化的。按照本领域众所周知的Y-I肾上腺细胞试验或Caco-2细胞试验测定时，相对于其野生型对应株，本发明方法中所用的减毒LT突变体显示出大幅降低的细胞毒性。参见如 David 等，1975，感染与免疫(Infection and Immunity) , 11:334-336 ；Cheng等，1999，疫苗(Vaccine) 18:38-49 ;Grant, C. C.等，1994，感染与免疫(Infection andImmunity)，62:4270-4278 ；Cheng, E.等,2000,疫苗(Vaccine) 18:38-49 ；以及 Park, Ε·J.等，1999，实验与分子医学(Experimental and molecular medicine), 31:101-107。以下是对两种试验的简要说明。为进行Y-I肾上腺细胞试验，将小鼠Y-I肾上腺瘤细胞(ATCCCCL-79)、优选于补充T 15%马血清、2. 5%胎牛血清、2mM L-谷氨酸和I. 5g/L碳酸氢钠的Ham，s F12培养基中，以每孔2 X IO4个细胞(200ul/孔)的浓度接种到96孔平底板中，在37°C、5%C02下培养48h。用IXPBS (pH 7.4)洗涤细胞几次，然后在371及5%0)2供给下用不同浓度的试验1^ (野生型LT或突变LT)进行处理。处理后24小时左右，在光学显微镜下观查细胞来检测细胞圆形化的出现。将试验样品中LT的毒性定义为引发细胞圆形化所需的最低LT浓度(ECi)或诱导50%细胞圆形化所需的LT浓度(EC5tl)。Caco-2细胞试验可按如下操作。将于补充了 20%FBS的MEM- α培养基中的Caco_2细胞(ATCC HTB-37)以每孔5X104个细胞的浓度接种到24孔板中。当细胞接近100%饱和度时，用补充了 1%FBS和ImM 3-异丁基-I-甲基黄嘌呤(IBMX)的MEM-α培养基替换前述培养基。在5%C02供给下孵育30min之后，将细胞与试验LT混合并孵育4小时。用冷的PBS洗涤细胞几次，与200 μ I O. IN HCl在室温下混合15min，然后溶解(lyzed)，收集上清 液。使用如Assay designs、Correlate-EIA提供的试剂盒通过ELISA法测定代表试验LT毒性水平的上清液中的cAMP水平。通过常规基因工程技术，可以通过将一个或多个突变引入到野生型LT的亚单位A中或亚单位B中来制备减毒LT突变体。以下所示为野生型亚单位A (成熟型)和野生型亚单位B的氨基酸序列，以及编码A和B亚单位的核苷酸序列。成熟LTa的氨基酸序列(SEQ ID NO: I)NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60STSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP 120YSQIYGffYRV NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAffREEPffI 180HHAPQGCGNS SRTITCDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240LTb 的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)MNKVKCYVLF TALLSSLCAY GAPQSITELC SEYRNTQIYT INDKILSYTE SMAGKREMVI 60ITFKSGATFQ VEVPGSQHID SQKKAIERMK DTLRITYLTE TKIDKLCVffN NKTPNSIAAI 120SMENLT (亚单位 A :1-777 ;亚单位 B :774-1148)的核苷酸序列(SEQID NO: 3)atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttccact 240tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac 480agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag 660acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatgaata 780aagtaaaatg ttatgtttta tttacggcgt tactatcctc tctatgtgca tacggagctc 840cccagtctat tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat acgataaatg 900acaagatact atcatatacg gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt atcattacat 960ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata gactcccaaa 1020aaaaagccat tgaaaggatg aaggacacat taagaatcac atatctgacc gagaccaaaa 1080ttgataaatt atgtgtatgg aataataaaa cccccaattc aattgcggca atcagtatgg 1140aaaactag优选地，减毒LT突变体包括突变的亚单位A，其在对其ADP-核糖基转移酶活 性必不可少的位点上含有突变的残基，例如SEQ IDNOil中的位点53、61、63、69、97、104、106、110 或 112。参见美国专利 6，149，919、US 20081012078、Ci印Iak 等，生物化学杂志(J. Biol. Chem. ) 270(51) :30545-30550, 1995 ；及 Cheng 等，疫苗(Vaccine)，18:38-49, 2000。在LT突变体中，A和B亚单位形成典型的AB5全毒素结构(holotoxinstructure)ο在一个实施例中，减毒LT突变体(LTS61K)包含在SEQ ID N0:1的位点61含有K的突变亚单位A以及野生型亚单位B。在另一个实施例中，减毒LT突变体(LTS63K)包含在SEQ ID NO: I的位点63含有K的突变亚单位A以及野生型亚单位B。其他减毒LT突变体公开于US2001/0044416 ；Nawar等，感染与免疫(Infectionand Immunity)73 (3) : 1330-1342 (2005) ;Komase 等，疫苗(Vaccine)16 (2) : 248-254，1993 ；Magagnoli 等，感染与免疫(Infection and Immunity) 64(12) :5434-5438, 1996 ；W099/47164 与美国专利 6，818，222。减毒LT突变体可以通过常规重组技术制备。例如，编码LT突变体的A和B亚单位的核苷酸序列可以插入到表达框并在宿主细胞(如大肠杆菌细胞)中表达。A和B亚单位可以在宿主细胞中自组装形成全毒素，其可以通过如色谱法从宿主细胞中分离。参见US20081012078。由此制备的LT突变体的毒性可以通过Y_1肾上腺细胞试验或Caco-2细胞试验来测定，两种方法描述如上，而且，确认了本发明方法中所用的突变体表现出大幅降低的毒性。单独的或与一个或多个过敏原结合的任何减毒LT突变体都可以用于治疗过敏症。过敏原是一种在反复暴露于其的个体(例如，人)中能诱导过敏性反应即IgE介导的免疫反应的物质。其可以为任何天然的蛋白，包括花粉过敏原(树木_、草本植物(herb)、杂草-和草地花粉过敏原)、昆虫过敏原(吸入性，唾液和毒液过敏原，如螨类过敏原、蟑螂和蚊类过敏原及膜翅目(hymenopthera)毒液过敏原)、动物毛发和皮屑过敏原(来自如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)以及食物过敏原。来自树木、禾本和草本植物的重要花粉过敏原来源于以下分类学的目山毛榉目(Fagales)、木樨目(Oleales)、松杉目(Pinales)及悬铃木科(platanaceae),包括桦树(桦木属(Betula))、赤杨(赤杨属(Alnus))、榛树(榛属(Corylus))、角树(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄树(榄属(Olea))、杉树(柳杉属和刺柏属(Cryptomeria and Juniperus))、悬铃树(悬铃木属(Platanus));禾本目(Poales),包括黑麦草属(Lolium)、猫尾草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、绒毛草属(Holcus)、鹬草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)及高粱属(Sorghum)的禾本植物；菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales),包括豚草属(Ambrosia)、艾属(Artemisia)及墙草属(Parietaria)的草本植物。其他重要的吸入性过敏原为源于尘螨属(Dermatophagoides)和螨属(Euroglyphus)的屋尘螨；储藏室尘螨(storage mite),如嗜鳞螨属(Lepidoglyphys)、食甜螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus);源于如小蠊属(Blatella)、大蠊属(Periplaneta)、摇蚊属(Chironomus)及蚤属(Ctenocepphalides)的蟑螂、蚊和蚤；源于如猫、狗、马的哺乳动物的那些过敏原；毒液过敏原，包括来自针昆虫或咬虫(stinging or biting insects)的此类过敏原,其源于分类学的膜翅目(Hymenoptera),包括蜜蜂(蜜蜂总科(superfamily Apidae))、胡蜂(胡蜂总科(superfamily Vespidea))及蚂蚁(蚁总科(superfamily Formicoidae))。来自真菌的重要吸入性过敏原为除了源于链格孢属(Alternaria)和枝孢属(Cladosporium)的那些真菌。本发明方法中所用的过敏原示例包括但不限于屋尘螨过敏原、禾本科植物花粉、树木花粉以及食物性过敏原。本发明中所用的过敏原可以为通过常规方法制备的纯化蛋白。可选地，其可以为所需过敏原天然原料制备的提取物。特别地，过敏原提取物包含一种或多种过敏原亚型。减毒LT突变体或所述减毒LT突变体与一种或多种过敏原的组合都可以被配制成药物组合物(如疫苗)，其可以进一步包含药学上可接受的载体如磷酸盐缓冲盐水或碳酸氢盐溶液。所述载体必须为“可接受的”，含义为其与组合物中的活性成分是相配的，特别是能稳定活性成分并且对待治疗个体是无毒害的。所述载体的选择基于给药的方式和途径以及药学实践的标准。《雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》中描述了合适的药用载体和稀释剂，及其所使用的药用必需品。制备疫苗的方法是本领域公知的，如美国专利4，601, 903,4, 599，231,4, 599，230和4，596，792的实例。疫苗可制成注射剂、液态溶液或乳剂。本文描述的LT突变体或其与过敏原的组合物可以和生理学上可接受的赋形剂进行混合，包括水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇及其混合物。疫苗还可以进一步包括少量的助剂如润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂来增强疫苗的效力。疫苗可以为非肠道(如皮下或肌肉注射、或经皮递送)给药或粘膜(如鼻内、舌下或口服)给药。可选地，其他给药方式包括栓剂(suppositories)、口服或局部制齐U。对栓剂而言，粘结剂和载体可以包括，例如聚烧撑乙二醇(polyalkalene glycols)或甘油三脂。口服剂型可以包括常用的辅料(incipients)，如医药级的糖精、纤维素、碳酸镁等。所述组合物可为溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂或散剂的形式。以与剂型(dosage formulation)相匹配的方式和以治疗有效的、预防的及致免疫的量进行疫苗给药。特别地，疫苗中减毒LT突变体的量必须足够用于降低Th2型免疫应答。给药的量取决于待治疗的个体，包括，例如个体免疫系统合成抗体的能力，以及如需要，产生细胞介导的免疫应答的能力。有效成分的精确给药量取决于执业医师的判断。然而，本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量范围，本发明的多肽可达到微克的程度。初始给药(initial administration)和加强剂量(booster doses)的适当配置(regimes)也是可变的，但可以包括初始给药及其后的后续给药。疫苗的剂量还可以取决于给药途径以及宿主(host)大小的变化。无须进一步详细阐述，本领域技术人员相信基于以上描述可以最大程度地利用本发明。因此，以下应被理解为仅说明性的，而非对其余无论以何种方式公开的内容的限制。本文弓I用的所有出版物均以参阅的方式并入于此。实施例I :单独的或与Der p过敏原结合的LTS61K对哮喘小鼠中Th2型免疫应答的抑制·本研究中使用雌性BALB/c小鼠(6_8周龄)。这些小鼠处于无特异性病原体和标准饲料/水的条件下。采用图I所示的下面的预防或治疗方案处理所述小鼠。预防方案将小鼠随机分成四组，在第0、7、14天，每组小鼠分别用(i)生理盐水(每只小鼠10 μ I )、( ii )屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus) (Der p 来自 Allergon,每只小鼠 20yg)、(iii)LT(S61K)(每只小鼠 10 μ g)或(iv)与 Der p (20 μ g)混合的 LT(S61K)(IOyg)进行处理。两周后,采用Der p致敏(sensitized)小鼠两次(第28和35天),然后在第42天进行呼吸道激发(airway challenge)。三天之后处死小鼠。检验由此处理的小鼠来确定其AHR水平。更具体地，在处死之前通过非约束式全身呼吸测量系统(Unrestrained Whole Body Plethysmography) (Buxco)测量用不同浓度氯化乙酰-β-甲基胆碱(乙酰甲胆碱)(Sigma-Aldrich)处理的小鼠中代表动态呼吸道阻力的Penh值。如图2所示，与用生理盐水和Der ρ处理的小鼠相比，用LTS61K或LTS61K和Der ρ组合物处理的小鼠显示出较低的Penh值。该结果表明单独的或与过敏原Der ρ 结合的LTS61K降低了哮喘小鼠的AHR。收集小鼠的支气管肺泡灌洗(BAL)液。台盼蓝染色后计数BAL液中的总细胞数。所得的结果表明LTS61K和LTS61K/Der ρ处理小鼠的BAL液中存在的细胞少于生理盐水和Der ρ处理小鼠的BAL液中存在的细胞。采用购自e-Bioscience和R&D DuoSet的分析试剂盒通过夹心ELISA法测定了BAL液中某些细胞因子如IL-2、IL-5、TNF_a、嗜酸性粒细胞趋化因子及TARC的水平。在LTS61K或LTS61K/Der ρ处理的小鼠与生理盐水或Der ρ处理的小鼠之间，所检测Thl型细胞因子诸如IL-2没有差异。另一方面，LTS61K-或LTS61K/Der ρ处理的小鼠中Th2型细胞因子即IL-5、嗜酸性粒细胞趋化因子和TARC的水平低于生理盐水或Der ρ处理的小鼠。进一步地，从处理后的小鼠中分离出淋巴细胞，并以I X IO6细胞/孔的密度在24孔板中于补充了 10%(v/v)FBS、lmM 丙酮酸钠、50mM 2-疏基乙醇(2_mecaptoethanol)、2mML-谷氨酸、ImM非必需氨基酸、100U/ml盘尼西林和100 μ g/ml链霉素的cRPMI中培养。然后用IOygDer ρ激发淋巴细胞2_3天，之后收集上清液。使用R&DDuoSet提供的夹心ELISA试剂盒检测上清液中IFN- Y、IL-4和IL-IO水平。此外，在I μ gDer ρ和O. I μ g或I μ gPEA-L(Sigma-Aldrich)存在下，将IX IO5个淋巴细胞接种到96孔板的一个孔中。48或72小时之后使用CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所(Dojindo))检测细胞增殖。四组小鼠之间观察到的淋巴细胞增殖情况没有差异，相对于生理盐水处理的小鼠，LT(S61K)或LT(S61K)/Der ρ处理的小鼠中观察到的Thl和Th2型细胞因子水平均更低。总之，上述讨论的结果显示当按照所述预防方案向哮喘小鼠给药时，单独的或与Der ρ结合的LTS61K抑制了 TARC及Th2型免疫应答。治疗方案首先使用与等量弗氏不完全佐剂(IFA, Sigma-Aldrich)混合的Der P按如下所述致敏小鼠。每只小鼠在第O天和第7天皮内注射40 μ g Der ρ,第14天在舒泰50(Zoletil)和隆朋(Rompun)的轻微麻醉下气管内注射50 μ g Der ρ。将致敏后的小鼠随机分为四组，在第16、18和20天，在轻微麻醉下，每组小鼠分别用(i )生理盐水(每只小鼠10 μ I )、( ii )Der ρ (每只小鼠 20yg)、(iii)LT(S61K)(每只小鼠 10 μ g)及(iv)与 Der ρ (20 μ g) M合的LT(S61K) (IOyg)鼻内给药三次。第21天，小鼠气管内注射50 μ g Der p，三天后处死小鼠(第24天)。如上述方法检测AHR和渗入BALFs中的总细胞数。与(i )组和(iii )组小鼠相比，在(ii )组和(iv)组小鼠中观查到较低的呼吸道阻力水平。进一步地，来自(iii )组和(iv)组小鼠的BALFs中的细胞数少于来自(i )组和(ii )组小鼠的BALFs中的细胞数。通过前述夹心ELISA法检测BALFs中各种细胞因子的水平。来自分别用LTS61K和其与Der ρ的组合处理的(iii)组和(iv)组小鼠的BALFs中，细胞因子尤其是Th2型细胞因子IL-5、TARC和嗜酸性粒细胞趋化因子的水平显著低于分别用生理盐水和Der ρ处理的(i )组和(i i )组小鼠的BALFs中的水平。参见图3。从处理后的小鼠中分离出淋巴细胞，按照前述方法确定其增殖以及细胞因子的产·生。全部四组小鼠中观察到的淋巴细胞增殖没有显著性差异。另一方面，相对于(i)组和
(ii)组小鼠，(iii)组和(iv)组小鼠中IFN-Y、IL-4及IL-10的水平明显较低。总之，上述讨论的结果显示当按照图I所示的治疗方案向哮喘小鼠给药时，单独的或与Der ρ结合的LTS61K抑制了 TARC及Th2型免疫应答。实施例2 :单独的或与Der ρ结合的LTS61K的鼻内治疗对哮喘小鼠中过敏原特异性IgA的局部和全身性(Systemic)诱导已有报道，过敏原特异性IgA在过敏性哮喘中起着重要的作用。按如下所述检测经预防方案处理的小鼠和经治疗方案处理的小鼠的Der P-特异性IgA水平(参见图I)。用包被缓冲液(15mM Na2CO3和35mM NaHCO3, pH=9. 6)中的Der ρ涂覆(10 μ g/孔)多孔板，4°C下过夜，然后用 PBST (O. 05%Tween 20 于 PBS 中)洗涤，并用 O. 5%BSA (Sigma-Aldrich)阻断(blocked)。将小鼠的血清或BAL液进行稀释并在4°C下于涂覆的孔板中孵育过夜。然后向所述孔板中加入HRP结合的羊抗鼠IgA抗体(HRP-conjugated goat anti-mouse)(I 10000，罗福斯生物制剂(Novus Biologicals))。用PBST洗涤所述孔板后，向其中加入四甲基联苯胺(TMB, Clinical Science Products)用于形成标记(signal development)。如图4和图5所示，在按照预防方案或治疗方案处理的小鼠的血液和BALFs中，LTS61K与Der ρ的结合诱导了抗Der p IgA的产生。其他实施方式本说明书公开的所有特征可以以任意组合方式进行组合。本说明书公开的各个特征可以被出于相同、等同或相似目的的可替换特征替换。因此，除非另有特别说明，所公开的各个特征只是一系列等同或相似特征中的一种实例。通过以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的必要特征，在不偏离本发明精神和范围的基础上，可以对本发明做出各种改变和修饰以使其适应多种用途和情况，因此，其他实施方式也包含于权利要求中。


本发明涉及使用含有减毒大肠杆菌不耐热肠毒素以及任选地过敏原的药物组合物治疗过敏症的方法。