专利名称：通过缺失或消除非必需基因而减毒的重组副流感病毒疫苗的制作方法人副流感病毒3型(HPIV3)是幼儿和1岁以下儿童严重下呼吸道感染的一般诱因。它是仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的、导致该年龄段儿童因病毒性下呼吸道疾病入院的诱因(Collins等，p1205-1243，于B.N.Fields(Knipe等编辑)Fields Virology，3rded.，vol.1.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996；Crowe等，Vaccine 13415-421，1995；Marx，J.Infect.Dis.1761423-1427，1997)。该病毒的感染使3岁以下儿童发生显著病症。HPIV1和HPIV2是喉气管支气管炎(哮吼)的主要病因，也能引起严重肺炎和细支气管炎(Collins等，3rded.In“Fields Virology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus，Eds.，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。在为期20年的长期性研究中，发现HPIV1、HPIV2和HPIV3分别占因呼吸道疾病入院总数的6.0、3.2和11.5％，三者的总和占入院总数的18％，因此，需要有效的疫苗。(Murphy等，Virus Res.111-15，1988)。也发现副流感病毒占儿童中并发中耳炎的、由病毒诱发的中耳积液诱因的很大比例(Heikkinen等，N.Engl.J.Med.340260-264，1999，在此引入作为参考)。因此，需要发展一种抗这些病毒的疫苗，以预防严重的下呼吸道疾病和伴随HPIV感染的中耳炎。尽管对发展抗HPIV的有效疫苗疗法进行了大量的研究，仍然没有获得任何HPIV株的被认可的疫苗制剂，以及改善HPIV相关疾病的被认可的疫苗制剂。目前，仅有两个活的减毒PIV候选疫苗受到了特别关注。其中之一是一种牛PIV(BPIV3)株，其与HPIV3抗原相关，并显示可保护动物免受HPIV3侵袭。BPIV3在人幼儿和儿童中减毒、遗传稳定，并且具有免疫原性(Karron等，J.Inf.Dis.1711107-14，(1995a)；Karron等，J.Inf.Dis.1721445-1450，(1995b))。第二个PIV3候选疫苗(JS cp45)是HPIV3 JS野生型(wt)株的冷适应突变体(Karron等，1995b，同上；和Belshe等，J.Med.Virol.10235-242，(1982))。这种活的、减毒的、冷传代(cp)的PIV3候选疫苗具有温度敏感(ts)、冷适应(ca)和减毒(att)的表型，在体内实验病毒复制后是稳定的。cp45病毒在实验动物中可保护性抵抗人PIV3的侵袭，并且在血清反应阴性的幼儿和儿童中是减毒、遗传上稳定并具有免疫原性的(Hall等，Virus Res.22173-184，1992；Karron等，1995b，同上)。近来，重组DNA技术促进PIV3候选疫苗的发展，使从cDNA中得到感染性负链RNA病毒成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-389，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-11358，1996)。文中报道了在必需病毒蛋白存在时，从cDNA编码的反基因组RNA中获得的一些重组病毒，这些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、猿猴病毒5(SV5)、新城疫病毒(NDV)和仙台病毒(SeV)(参见，如，Garcin等，EMBO J.146087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-4481，1995；Radecke等，EMBO J.145773-5784，1995；Schnell等，EMBOJ.134195-4203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-8392，1995；Hoffman等，J.Virol.714272-4277，1997；Kato等Genes toCells 1569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)1-6，1998；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；国际申请WO 97/06270；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；1997年7月15日的US专利申请08/892,403(相应于公布的国际申请WO 98/02530和之前的US临时申请1997年5月23日的60/047,634，1997年5月9日的60/046,141，1996年7月15日的60/021,773)；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Peeters等，J.Virol.735001-5009，1999；Jin等，Virology 251206-214，1998；Bucholz等，J.Virol.73251-259，1999；Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999；为各种目的在此分别全文引用作为参考)。在特别地有关于目前的发明的方面，近来发展了一种获得具有来自cDNA的wt表型的HPIV的方法，可回收感染性的重组PIV3 JS株(参见，如，Durbin等，Virology 235323-332，1997；1998年5月22目的美国专利申请09/083,793；1997年5月23日的美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO 98/53078)和1997年9月19日的美国临时专利申请60/059,385；在此分别引用作为参考)。此外，这些发现使可以进行cDNA克隆的遗传操作，以确定生物学突变体表型变化的遗传基础，如，在HPIV3 cp45中那些特定导致产生ts、ca和att表型的突变，以及BPIV3中那些特定导致产生其减毒表型的基因。此外，这些发现使可以构建新PIV候选疫苗，并估计其减毒、免疫原性和表型稳定性水平。因此，现在可从cDNA中获得感染性野生型重组PIV3(r)PIV3，以及其多种ts衍生物，并使用反向遗传系统产生具有确定的减毒突变的感染性病毒，以及研究现存疫苗病毒减毒的遗传基础。例如，发现在cp45 L基因中的三个氨基酸替代，单独或组合，特定导致产生ts和减毒的表型。其它ts和减毒突变存在于PIV3 cp45的其它区域。此外，利用PIV3 cDNA拯救系统，在L区带有这三个减毒突变的PIV3全长cDNA中，将PIV3 HN和F读码框(ORF)替换为PIV1的，产生一种嵌合PIV1候选疫苗。衍生自该cDNA的重组嵌合病毒定名为rPIV3-1.cp45L(Skiadopoulos等，J.Virol.721762-1768，1998；Tao等，J.Virol.722955-2961，1998；Tao等，Vaccine 171100-1108，1999，在此引用作为参考)。rPIV3-1.cp45L在仓鼠中是减毒的，并能诱导对PIV1攻击的高水平抗性。获得了一个定名为rPIV3-1.cp45的重组嵌合病毒，其具有cp45中15个突变的13个，即，不包括发生于HN和F的突变，并且在仓鼠上下呼吸道中高度减毒(Skiadopoulos等，Vaccine，在印，1999)。尽管在发展抗PIV不同组的有效疫苗中有许多进展，本领域仍然需要另外的工具和方法，工程化安全和有效疫苗以减轻PIV导致的严重的健康问题，特别是HPIV3感染导致幼儿和儿童的疾病。目前遗留的问题包括需要其它工具以产生用于不同临床背景的、适当减毒的、具免疫原性和遗传稳定性的候选疫苗。为达到这一目标，现存的检测并在重组疫苗毒株中引入减毒突变的方法需要扩展。本发明令人惊讶地满足这些需要，并提供了以下所述的其它优点。发明简述本发明提供了在感染性PIV中引入已定义的、预先确定的结构和表型改变的新工具和方法。本发明的一个实施方案中，提供了一种分离的多核苷酸分子，其具有一个可操作连接的转录启动子，一个编码PIV基因组或反基因组的多核苷酸序列和一个转录终止子。该基因组或反基因组含有一个降低或消除C、D和/或V ORF中一个或多个的表达的剔除突变，或使一个或多个C、D和/或V ORF的全部或部分缺失的突变。本发明优选的方面中，C、D和/或V ORF中一个或多个的表达的降低或消除，是通过修饰PIV基因组或反基因组，使其具有一个将C ORF起始密码子从M改为T，或一个或多个终止密码子的突变。或者，一个或多个C、D和/或V ORF被整体或部分的缺失，或通过如点突变被修饰，使相应的蛋白部分或完全无功能，或彻底破坏蛋白表达。或者，可以在编辑位点产生突变，阻止编辑并消除由RNA编辑产生的蛋白的表达(Kato等，EMBO 16578-587，1997和Schneider等，Virology227314-322，1997)。本发明在C、D和/或V有突变的重组PIV具有发展疫苗所期望的表型特征。以上所述在重组基因组或反基因组中的突变，在产生的病毒或亚病毒颗粒中特定导致一种或多种期望的表型改变。由此产生的候选疫苗表现一种或多种特征，表现为(i)细胞培养时生长性质的改变，(ii)在哺乳动物宿主的上下呼吸道中减毒，(iii)病毒噬菌斑大小的改变，(iv)细胞病理学效果的改变，以及(v)免疫原性的改变。
此处所述模式PIV重组体中，期望的表型变化包括，与相应的野生型或突变亲本PIV株相比，病毒在体外和/或哺乳动物宿主中生长的减弱。在更详细的方面，病毒在细胞培养中的生长可能因剔除或基因(或基因组区段)缺失突变而减弱约5-10倍。病毒在哺乳动物宿主的上下呼吸道中减毒优选约为10-100倍，有时100-1000倍或更高，以利于疫苗的发展。同时，本发明的重组PIV具有免疫原特性，可以在哺乳动物宿主的上下呼吸道中刺激抗wt PIV攻击的保护性免疫应答。
具有C、D和/或V剔除突变的PIV基因组或反基因组可以是人或非人PIV序列，或其被重组修饰的版本。一个实施方案中，该多核苷酸序列编码一个嵌合的基因组或反基因组，其具有重组地组合了一个非人PIV序列(如来自牛PIV(BPIV)的基因或基因组区段)的一个人PIV序列(参见，如，1999年7月9日由Bailey等人申请的案卷号为15280-399000US的美国临时专利申请，名为“减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作为参考)。其它实例中，该多核苷酸编码来自一个非人PIV和至少一个其它人或非人来源PIV序列的嵌合体。
另一些实施方案中，本发明提供了一种分离的感染性PIV颗粒，具有包含C、D和/或V剔除突变的重组PIV(rPIV)基因组或反基因组。该分离的感染性PIV颗粒可以是病毒或亚病毒颗粒。此处所述亚病毒颗粒指任何缺少完整病毒中存在的(如包括完整基因组或反基因组、核壳和包膜的装配了的毒粒)一个结构成分如一个基因组区段、基因、蛋白或蛋白功能结构域的感染性PIV颗粒。因此，本发明亚病毒颗粒的一个例子是具有一个基因组或反基因组、以及N、P和L基因产物的感染性核壳。其它亚病毒颗粒通过非必须基因、基因组区段和/或部分或完全的基因产物(如F，HN，M或C)及其它非必须基因组和结构成分的部分或完全的缺失或替代来产生。
除了具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV产生的表型效果外，也期望通过引入额外的增加或降低该重组病毒的减毒、和/或调整免疫原活性的突变，以调整其减毒和免疫原表型。因此，候选疫苗株可以由引入的至少一个，优选两个或多个不同的减毒突变进一步减毒，如生物学来源的PIV突变体中发现的突变，或利用重组微复制子、重组病毒或生物学来源病毒中经验地发现的突变。文中优选突变PIV株包括冷传代(cp)、冷适应(ca)、宿主范围限制(hr)、小噬菌斑(sp)和/或温度敏感(ts)突变体，例如JS HPIV3 cp45突变株。在模式实施方案中，一个或多个减毒突变发生于聚合酶L蛋白中，如在相应于JS cp45的Tyr 942、Leu 992、Thr 1558的位置上。或者，N蛋白的减毒突变可被选择并引入C、D和/或V缺失或剔除突变体中，如其编码在相应于JS cp45残基Val 96或Ser 389处的氨基酸替代。其它或附加突变可能编码C蛋白中的氨基酸替代，如在相应于JS cp45残基Ile96处。调节本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体减毒水平的其它突变也存在于F蛋白，如在相应于JS cp45残基Ile 420或Ala 450处，在HN蛋白，如在相应于JS cp45残基Val384处(Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381.1999；Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999，分别在此引用作为参考)。
引入本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体中的、来自生物学来源的PIV突变体的减毒突变也包括在PIV基因组或反基因组非编码部分的突变，例如在3’前导序列。文中的突变范例可在重组病毒3’前导序列(相应于JS cp45核苷酸23、24、28或45)工程化(Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999，在此引用作为参考)。其它的突变范例可在重组病毒N基因起始序列工程化，如通过改变N基因起始序列一个或多个核苷酸，如相应于JS cp45核苷酸62位置处。
从JS cp45和其它生物学来源的PIV突变体，得到了减毒突变的大“菜单”，其中每个突变都可以与其它突变组合，调节具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV的减毒水平。例如，本发明重组PIV内的突变包括一个或多个，优选两个或更多JS cp45突变。期望用于疫苗的本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体经常有至少两个，有时三个或更多减毒突变，以获得满意的可广泛用于临床的减毒。优选的，具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV包含一个或多个突变，由特定于该突变的密码子中的多个核苷酸替代使其稳定。
其它可以采用或转入本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体的突变可在非PIV非区段化负链RNA病毒中发现，并引入本发明PIV突变体。确定在异源负链RNA病毒中发现的的突变位于受体PIV基因组或反基因组的相应同源位点，使受体现存序列突变为该突变体基因型(通过相同或保守突变)，可以容易地获得，在1999年4月13日Murphy等的美国临时专利申请(案卷号17634-000600)名为“从克隆的核苷酸序列制备减毒的负链RNA病毒疫苗”中有说明，在此引用作为参考。
除了上述突变，感染性C、D和/或V缺失或剔除突变体被希望包含来自任何异源PIV或PIV类病毒(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、牛PIV(BPIV)或鼠PIV(MPIV))的异源编码或非编码核苷酸序列，从而形成一个嵌合的基因组或反基因组。例如，本发明的重组PIV可能包括来自两个或多个野生型或突变PIV株的序列，如HPIV1和HPIV3。或者，本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体可能包括来自一个人和一个非人PIV的序列，如HPIV和BPIV。优选的，“受体”或“背景”基因组或反基因组中的一个或多个人PIV编码或非编码多核苷酸，被来自异源PIV或非PIV病毒的对应序列，单独或与一个或多个选择的点突变(如cp和/或ts突变)组合地替代，产生新的减毒疫苗株。分离的感染性PIV颗粒优选人PIV，更优选HPIV3(参见，如，1999年7月9日Bailey等的(案卷号15280-399000US)美国临时专利申请，名为“减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作为参考)。
本发明的相关方面，提供了分离的感染性PIV颗粒，其包含来自HPIV3的核苷酸序列与至少一个来自异源PIV(如HPIV1、HPIV2、BPIV、MPIV)的序列的融合。例如，HPIV3的完全基因都可以被来自其它形式PIV的对应基因替代，如PIV1或PIV2的HN和/或F糖蛋白基因。或者，一个选择的基因组区段(如HPIV1或HPIV2 HN或F中胞质尾区、跨膜区或胞外域)可以被对应HPIV3基因中的基因组区段替代，产生编码嵌合蛋白的构建体，如具有PIV3的胞质尾区和/或跨膜区和PIV1或PIV2胞外域融合的融合蛋白。或者，来自一个PIV的基因或基因组区段可以被添加进(即，没有替代)一个异源PIV背景中，在得到的克隆中创造出新免疫原特性。
除了具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV，本发明还提供了相关的cDNA克隆、载体和粒子，均包含一个或多个此处所述的表型特异性突变。根据此处描述的方法，这些以选择性组合引入是重组cDNA基因组或反基因组的分离的多核苷酸，产生表达时适当减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒。这一过程，与常规表型评价一起，提供了具有期望特性(如减毒、温度敏感、改变的免疫原性、冷适应、小噬菌斑、宿主范围限制、遗传稳定性等)的C、D和/或V缺失或剔除突变体。特别的，候选疫苗选择那些减毒但仍然带有足以在被免疫的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫反应的免疫原性的。
本发明的另一些方面中，具有或没有采用额外的减毒突变(如来自生物学来源的突变病毒)的C、D和/或V缺失或剔除突变体，被构建使其具有额外的核苷酸修饰，以产生期望的表型、结构或功能的变化。典型的，这种选择的核苷酸修饰将特定导致表型变化，如生长特性、减毒、温度敏感、冷适应、噬菌斑大小、宿主范围限制或免疫原性的变化。文中的结构变化包括在PIV编码cDNA中引入或消除限制性位点，以利于操作和鉴定。
在优选的实施方案中，C、D和/或V缺失或剔除突变体基因组或反基因组的核苷酸改变包括，通过部分或完全缺失一个额外病毒基因，或降低或消除(剔除)其表达来修饰额外的病毒基因。文中突变的靶基因包括核壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亚单位L、基质蛋白M、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN、融合蛋白F。在重组病毒保持活性和感染性时，这些蛋白的任何一个可以被选择性缺失、替代或重排，整体或部分，单独或与其它期望的修饰组合，以获得新的C、D和/或V缺失或剔除突变体。例如，这些基因的一个或多个可能整体或部分缺失，或其表达降低或消除(如，引入终止密码子、RNA编辑位点突变、改变了起始密码子决定的氨基酸的突变、或移码突变)，以改变所产生的重组克隆的表型，改善了生长、减毒、免疫原性或其它期望表型特征。
本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体的其它核苷酸修饰包括，重组基因组或反基因组中的一个被选择基因的顺式作用调节序列的缺失、插入、添加或重排。一个范例中，一个PIV基因的顺式作用调节序列被改变为相应的异源调节序列，其可以是不同PIV相同基因的对应顺式作用调节序列，或不同PIV基因的顺式作用调节序列。例如，一个基因末端信号可以转化或替代为相同PIV株的不同基因末端信号。其它一些实施方案中，核苷酸修饰可能包括重组基因组或反基因组内转录起始位点的插入、缺失、替代或重排，如消除一种蛋白质所选择形式的转录起始位点。
此外，各种其它的遗传改变可以在具有C、D和/或V缺失或剔除突变的PIV基因组或反基因组中产生，单独或和一个或多个生物学来源的突变PIV的减毒突变组合。例如，非PIV来源的基因或基因组区段可以整体或部分插入。或者，可以改变基因排列顺序，或一个PIV基因组启动子用其反基因组的对应部分替代。在这种重组基因组或反基因组中的不同或额外的修饰有利于操作，如在各种基因间区域或其它位置插入唯一的限制性位点。不翻译的基因序列可以被去除以增加插入外源序列的能力。
在另一些方面，编码该重组PIV基因组或反基因组的多核苷酸或载体可以被修饰，使其编码可在目的宿主中诱导保护性免疫的非PIV序列(如细胞因子、T辅助表位、限制性位点标记)或微生物病原(如病毒、细菌、或真菌)。在一种这类实施方案中，构建了含有呼吸道合胞病毒(RSV)基因或基因组区段的C、D和/或V缺失或剔除突变体，例如含有编码RSV抗原蛋白(如F或G蛋白)、免疫原结构域或表位的基因。
本发明的相关方面，提供了产生具有C、D和/或V缺失或剔除突变的分离的感染性重组PIV的组合物(如具有PIV编码cDNA的分离的多核苷酸或载体)和方法。本发明的这些方面中包括了新的分离的多核苷酸分子和载体，其包含具有经C、D和/或V(ORF)部分或完全缺失或使其表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变而被修饰的PIV基因组或反基因组的分子。也提供了具有编码N、P、L蛋白的一个或多个的分离的多核苷酸分子的相同或不同的表达载体。这些蛋白也可以直接由基因组或反基因组cDNA表达。载体优选在细胞或无细胞裂解液中表达或共表达，从而产生感染性C、D和/或V缺失或剔除突变PIV病毒颗粒或亚病毒颗粒。
以上产生C、D和/或V缺失或剔除突变PIV的方法和组合物产生感染性病毒颗粒或亚病毒颗粒，或其衍生物。重组感染性病毒与天然的PIV毒粒相当，并有同样的感染性。可直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒典型的是病毒颗粒的一个亚成分，在适当条件下可引发感染。例如，具有基因组或反基因组RNA和N、P、L蛋白的核壳是亚病毒颗粒的一个范例，当其进入细胞质中，可以引发感染。本发明提供的亚病毒颗粒包括缺少一个或多个蛋白质、蛋白质区段或其它病毒成分的病毒颗粒。
其它实施方案中，本发明提供了含有一个具有包含上述C、D和/或V缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子的表达载体，和具有包含编码PIV N、P、L蛋白的一个或多个分离的多核苷酸分子的(与前一个相同或不同的)表达载体的细胞或无细胞裂解液。这些蛋白质的一个或多个也可以从基因组或反基因组cDNA表达。表达后，基因组或反基因组和N、P、L组合产生感染性PIV病毒或亚病毒颗粒。
本发明其它实施方案中，提供了一种细胞或无细胞表达系统(如无细胞裂解液)，其含有一个具有包含上述C、D和/或V缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子的表达载体，和具有包含编码PIV N、P、L蛋白的一个或多个的分离的多核苷酸分子的表达载体。这些蛋白质的一个或多个也可以从基因组或反基因组cDNA表达。表达后，基因组或反基因组和N、P、L组合产生感染性PIV颗粒，如病毒或亚病毒颗粒。
本发明的重组PIV以各种组合物形式用于在对PIV敏感的宿主中产生期望的抗PIV免疫反应。本发明减毒的C、D和/或V缺失或剔除突变体能在感染的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫应答，且足够地减毒，不会在免疫化宿主中引发不可接受的严重呼吸疾病的症状。减毒的病毒或亚病毒颗粒可能存在于细胞培养物的上清中，从培养物中分离，或经部分或完全纯化。病毒也可以冷冻干燥，根据需要与多种成分组合以储藏或给药宿主。
本发明进一步提供了新疫苗，其包含一种生理上可接受的载体和/或佐剂，以及经分离的减毒的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV病毒颗粒或亚病毒颗粒。优选实施方案中，该疫苗包含具有至少一个，优选两或多个额外的突变或以上所述的其它核苷酸修饰的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV，使其减毒和免疫原性达到合适的平衡。疫苗配制为每剂103-107PFU的减毒病毒。病毒可能具有诱导抗单PIV株或抗多PIV株或组的减毒C、D和/或V缺失或剔除突变PIV。这方面，C、D和/或V缺失或剔除突变PIV在疫苗制剂中可与其它PIV疫苗株或其它病毒疫苗病毒如RSV组合。
在相关方面，本发明提供了在哺乳动物中刺激免疫系统以诱导抗PIV免疫应答的一种方法。该方法包含以足够的免疫量，给药存在于生理上可接受的载体和/或佐剂中的C、D和/或V缺失或剔除突变减毒PIV的制剂。一个实施方案中，免疫原组合物是包含具有至少一个，优选两或多个额外的突变或以上所述决定所希望表型的其它核苷酸修饰的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV疫苗。疫苗配制为每剂103-107PFU的减毒病毒。该疫苗可能具有减毒C、D和/或V缺失或剔除突变PIV病毒，其可诱导抗单PIV、抗多PIV(如HPIV1和HPIV3)或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的免疫反应。文中，C、D和/或V缺失或剔除突变PIV可诱导抗单PIV的单特异性免疫应答，或抗多PIV或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的多特异性免疫应答。或者，具有不同免疫原特性的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV可组合于疫苗混合物中，或在协同治疗方案中单独给药，以诱导抗单PIV、抗多PIV或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的更加有效的保护。优选的，免疫原组合物通过喷雾、滴入或气雾剂给药于上呼吸道。
图2显示放射免疫沉淀分析，表明C蛋白的表达在病毒rC-KO中被消除。(a)道35S-标记的细胞裂解液用多克隆C特异的兔抗血清免疫沉淀。在rJS中出现了相应于C蛋白的22kD条带(空心箭头)，但在rC-KO(a)道中没有出现。(b)道细胞裂解液被特异于HPIV3HN蛋白的两个单克隆抗体的混合物免疫沉淀。相应于HN蛋白的64kD条带(实心箭头)在二者细胞裂解液中都出现，确定它们确是HPIV3，且蛋白表达水平相似。
图3显示了模式的剔除突变rC-KO和rDV-KO与亲本病毒rJS相比的多循环复制的结果。病毒效价以TCID50/ml表示，是两次采样的平均。
HPIV3是单负链病毒目副粘病毒科中新命名的呼吸道病毒属的成员。其基因组为负义的单链RNA，长度为15462个核苷酸(Galinski等，Virology 165499-510，1988；Stokes等，Virus Res.2591-103，1992)。PIV3基因组至少编码8个蛋白质核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、非结构蛋白C、D蛋白、基质蛋白M、融合糖蛋白F、血凝素-神经氨酸酶糖蛋白HN和一个大聚合酶蛋白(L)(Collins等，p.1205-1243.于B.N.Fields(Kinpe等编辑)，Fields Virology，3rded，vol.1.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。
M、HN、F蛋白是包膜相关的，后两个是表面糖蛋白，和每个PIV蛋白一样，是主要的中和和保护性抗原(Collins等，3rded.于“FieldsVirology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus编辑，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。在各种PIV中可比较的HN或F蛋白的显著序列差异被认为是这种保护免疫特异性的基础(Collins等，3rded.于“Fields Virology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus编辑，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996；Cook等，Amer.Jour.Hyg.77150-159，1963；Ray等，J.Infect.Dis.162746-749，1990)。
除了包含4个ORF(即P、C、D、V)的P mRNA外(

图1)，HPIV3基因分别以编码单个蛋白的单mRNA转录(Galinski等，Virology186543-550，1992；和Spriggs等，J.Gen.Virol.672705-2719，1986)。在该mRNA中，P和C从独立但重叠的ORF中翻译(图1)。尽管所有的副粘病毒都编码P蛋白，只有呼吸道病毒和麻疹病毒属编码C蛋白。病毒个体在表达的C蛋白数量上和在体内和体外中该病毒的复制重要性上不同。仙台病毒(SeV)从C ORF不同位点启动，表达出四种蛋白C’、C、Y1、Y2，其翻译起始点在mRNA上以此顺序排列(Curran等，Enzyme 44244-249，1990；Lamb等，p.181-214，于D.Kingsbury(编辑)，The Paramyxoviruses，白金出版社，纽约，1991)，而HPIV3和麻疹病毒(MV)仅表达一个单独的C蛋白(Bellini等，J.Virol.53908-919，1985；Sanchez等，Virology 147177-186，1985；和Spriggs等，J.Gen.Virol.672705-2719，1986)。
全部的四个C衍生蛋白被消除的一个活性重组SeV在体外不能有效复制(Kurotani等，Genes Cells.3111-124，1998)，而单个C蛋白的消除有复杂的效果(Cadd等，J.Virol.705067-74，1996；Curran等，Virology 189647-56，1992；Latorre等，J.Virol.725984-93，1998)。具有使C蛋白170位置处苯丙氨酸(F)改为丝氨酸(S)的单点突变的重组SeV在小鼠中减毒，但其在细胞培养中的复制没有受到损害(Garcin等，Virology 238424-431，1997；Itoh等，J.Gen.Virol.783207-15，1997)。与SeV显著相反，一个C-负型(C-minus)的麻疹病毒(MV)在Vero细胞中有效复制(Radecke等，Virology 217418-21，1996)，尽管其复制在人外周血细胞中受到限制，且在体内表现一定的减毒(Escoffier等，J.Virol.731695-8，1999；Valsamakis等，J.Virol.727754-61，1998)。
除了P和C ORF外，PIV3的P mRNA另有两个ORF，即D和V。PIV3 D蛋白是P和D ORF的融合蛋白，通过转录编辑，或RNA编辑加工，从P基因中表达，其中在RNA编辑位点处将两个非模板G残基加入了P mRNA中(图1)(Galinski等，Virology 186543-550，1992；和Pelet等，EMBO J.10443-448，1991)。BPIV3是其它副粘病毒中唯一表达D蛋白的，其表达机制相同。
呼吸道病毒、麻疹病毒和Rubulavirus属的几乎所有成员都表达V蛋白。唯一确定不表达的是HPIV1，因其缺少V ORF(Matsuoka等，J.Virol.653406-3410，1991，在此引用作为参考)。V ORF的特征是存在高度保守的半胱氨基酸丰富区(Cattaneo等，Cell 56759-764，1989；Park等，J.Virol.667033-7039，1992；Thomas等，Cell 54891-902，1988；和Vidal等，J.Virol.64239-246，1990；分别在此引用作为参考)。对存在于各HPIV3病毒的V ORF测序结果表明该ORF的表达是维持病毒功能所须的(Galinski等，Virology 15546-60，1986；Spriggs等，J.Gen.Virol.672705-2719，1986；Stokes等，Virus Res.2591-103，1992).
一个非模板G残基加入RNA编辑位点后，BPIV3 V蛋白表达(Pelet等，EMBO J.10443-8，1991，在此引用作为参考)。但HPIV3中，2-4个翻译终止子存在于编辑位点和V ORF之间，仍不清楚是否HPIV3是该ORF不表达的另一个例子，或是否其以另一种机制表达。一种可能性是HPIV3编辑还发生在P基因下游的第二处，尽管在细胞培养中没有发现(Galinski等，Virology 186543-550，1992，在此引用作为参考)。或者，可能核糖体通过移码接近V ORF。这类似MV P位点的情况。MV表达C、P、V蛋白，但也表达从P ORF到V ORF的移码所合成的一个新的R蛋白(Liston等，J.Virol.696742-6750，1995，在此引用作为参考)。
尽管仍不清楚HPIV3表达V的方式，其V ORF在不同株之间的极度保守暗示其确实是表达的。V蛋白的功能不十分明确，但V-负型MV和SeV重组体在体外可以有效复制，但在体内复制降低(Delenda等，Virology 22855-62，1997；Delenda等，Virology 242327-337，1998；Kato等，EMBO J.16578-587，1997；Kato等，J.Virol.717266-7272，1997；和Valsamakis等，J.Virol.727754-7761，1998)。
PIV的病毒基因组也具有基因外前导序列和非转录尾序列，包含病毒复制和转录所必须的启动子。因此，PIV遗传图以3’前导序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5’非转录尾序列表示。转录从3’起始，并通过基因边缘处短的保守基元指导下的顺序终止-起始机制进行。每个基因的上游末端具有一个基因起始信号(GS)，指导其各自mRNA的起始。每个基因的下游末端具有一个基因终止信号(GE)，指导多腺苷酸化和终止。对人PIV3 JS株(Genbank接入号Z11575，在此引用作为参考)和Washington株(Galinski M.S.，The Paremyxoviruses，Kingsbury，D.W.编辑，pp.537-568，白金出版社，纽约，1991；在此引用作为参考)，牛PIV3 910N株(Genbank接入号D80487，在此引用作为参考)的模式序列进行了描述。
此处所用术语“PIV基因”一般指PIV基因组编码mRNA的部分，典型地，以基因起始信号(GS)开始于上游末端，以基因终止信号(GE)结束于下游末端。术语PIV基因也称为“翻译读码框”或ORF。除了基因外，PIV病毒基因组也包含非编码基因间隔序列，以及具有病毒复制和转录所必须启动子的基因外前导区和尾区。因此，PIV遗传图部分以3’-前导序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5’非转录尾序列表示。转录从3’起始，并通过基因边缘处短的保守基元指导下的顺序终止-起始机制进行。为构建本发明C、D、和/或V缺失突变体，必须对一个或多个PIV基因整体或部分缺失。这意味着可以在任何一个或多个PIV基因内的读码框和/或顺式作用调节序列制造部分或全部的缺失。“基因组区段”是指PIV基因组上任意长度的连续核苷酸，可以是ORF、基因或基因外区域的一部分或其组合。
其它构建本发明C、D、和/或V突变体的方式包括构建“剔除”病毒，在不缺失大部分PIV基因组情况下降低或消除基因表达。特别的，C、D和/或V ORF表达的降低或消除，优选通过修饰PIV基因组或反基因组进行，通过引入一个终止密码子、RNA编辑位点突变、改变起始密码子所决定的氨基酸的突变，或在靶ORF内产生移码突变。一个实施方案中，突变发生在编辑位点，阻止编辑并消除蛋白的表达，所述蛋白的mRNA由RNA编辑产生(Kato等，EMBO 16578-587，1997和Schneider等，Virology 227314-322，1997，在此引用作为参考)。
本发明的其它方面中，PIV基因组或反基因组经诱变在C、D和/或V ORF内产生一个或多个终止密码子。一个实例中，C ORF中的一个甲硫氨酸起始密码子转为苏氨酸。另一个实例中，在基因组或反基因组中突变(在核苷酸(nt)1795处(由T改为C)和nt 1813处(由C改为A))，引入两个终止密码子，终止密码子相应于C ORF的7和26处。由此产生了一个C剔除突变病毒，命名为rC-KO。本发明的三个其它模式突变病毒中，D和V ORF单独和组合地受到干扰。在单独的D剔除突变体中，其命名为rD-KO，引入在全长反基因组nt 2692、2695和2698处由C改为A的突变干扰D ORF的表达。这些点突变在公认的D ORF处创造出三个连续的终止密码子，导致D蛋白在372个氨基酸的嵌合D蛋白中在303密码子后提前终止。在其它更详细的方面，构建了一个单独的V剔除突变体，rV-KO，在全长反基因组nt2845(A到T)和2854(C到T)处引入两个点突变。这些点突变在可能的V ORF处创造提前的终止密码子(氨基酸17和20处)。将rD-KO和rV-KO中的改变同时引入一个单克隆中，创造一个组合DV剔除突变体，rDV-KO。
如上所述，本发明在C、D和/或V ORF内具有一个或多个突变的重组PIV具有发展疫苗所非常期望的表型特征。此处所述C、D和/或V ORF整体或部分缺失，或降低或消除C、D和/或V ORF表达的修饰，在得到的病毒或亚病毒颗粒中特定导致多种期望的表型改变。在优选的实施方案中，C、D和/或V剔除或缺失突变体与相应的野生型或突变亲本RSV株相比，表现减弱的病毒生长。与相应的野生型或突变亲本RSV株相比，生长(如在细胞培养时)可能降低约2倍，更可能是约5倍，优选约10倍或更高(如在培养的7天时期内)。在更详细的方面，本发明的重组RSV表现改变的病毒生长动力学。
具有C、D和/或V ORF缺失和剔除突变的重组疫苗病毒也优选的在体内表现减毒表型。例如在认可的人体内PIV复制的动物模型(如仓鼠和非洲绿猴(AGM))的下和/或上呼吸道中，复制与相应的野生型或突变亲本PIV株的生长相比，降低约2倍，经常是约5、10、20倍，优选约100倍-1000倍，或更高(如，感染后连续3-8天中的一天或每天检测)。除了上述减毒表型之外，或与之同时存在，具有C、D和/或V ORF缺失和剔除突变的重组PIV可能也表现在病毒噬菌斑大小、细胞病理学效果和/或免疫原性的改变。
本发明重组疫苗病毒的特别优选的特征在于，尽管如上所述其是减毒的，但仍然具有感染性，并可以在接种了的宿主中诱导所希望水平的抗PIV免疫应答。特别的，本发明候选疫苗重组体有足够的免疫原性，可诱导对后来wt病毒攻击的保护性免疫应答。如此处范例所示，从前感染C、D和/或V ORF剔除突变病毒，可在仓鼠和AGM中诱导抗HPIV3的显著的HAI抗体，这表明，这些模式重组体是具有保护性的，并因此代表了有前途的候选疫苗。在本发明其它优选的疫苗重组体中，免疫原活性用来平衡减毒的水平，以获得有用的候选疫苗，典型的标志为攻击病毒(如rJS HPIV3)在模型宿主(如仓鼠和非人灵长类)下和/上呼吸道中复制的降低，降低倍数约50-100倍，100-500倍，优选约500-2000倍，多至3000倍或更高(如，攻击后3-8天检测)。因此，本发明的重组疫苗病毒保持免疫原活性的同时，也表现复制和生长的降低。这种令人惊讶的表型特征对疫苗的发展是非常有利的。
本发明提供了发展具有C、D和/或V ORF缺失或剔除突变的活的减毒RSV候选疫苗。这些重组病毒通过cDNA中间体和基于cDNA的回收系统构建。来自cDNA的重组病毒独立复制，并以与生物学来源病毒相同的方式增殖。C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体可以被进一步修饰，包含特定的减毒突变，以及多种其它突变和核苷酸修饰，产生期望的结构和表型效果。从cDNA获得重组PIV的材料和方法的详细描述，以及制造和检测此处作为本发明附加方面所述的突变和核苷酸修饰，在以下文献中有详细说明Durbin等，Virology 235323-332，1997；1998年5月22日美国专利申请09/083,793；1997年5月23日美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO98/53078)；1997年9月19日美国临时专利申请60/059,385；分别在此引用作为参考。特别的，这些文件说明了诱变、分离和定性PIV以获得减毒突变株(如温度敏感(ts)、冷传代(cp)、冷适应(ca)、小斑(sp)和宿主范围限制(hr)突变株)和鉴定决定该减毒表型的遗传变化的方法和步骤。与这些方法一致，上述文件详细说明了，在认可的模型系统中(包括鼠和非人灵长类动物模型系统)，确定生物学来源的和重组产生的减毒人PIV的复制、免疫原性、遗传稳定性和有效保护性的方法。此外，这些文件说明发展和检测用于预防和治疗PIV感染的免疫原组合物(包括单价和二价疫苗)的一般方法。以上引用的文件中也说明了产生感染重组PIV的方法，即，构建和表达编码PIV基因组或反基因组的cDNA并与必须PIV蛋白基因共表达，还包括可用于产生感染PIV病毒克隆的以下模式质粒p3/7(131)(ATCC97990)，p3/7(131)2G(ATCC97889)，p218(131)(ATCC97991)，依据布达佩斯协议，分别保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801，UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA)，以上提供了保藏号。
以上引用的文献中也揭示了构建和评估经修饰的感染性重组PIV的方法，其引入了在生物学来源的PIV突变体(如冷传代(cp)、冷适应(ca)、宿主范围限制(hr)、小噬斑(sp)和温度敏感(ts)突变株)(如JS HPIV3 cp45突变株)中发现的表型特异性突变。在这些突变株中发现的突变可以容易地用于具有C、D和/或V剔除突变的重组PIV中。在模式实施方案中，聚合酶L蛋白上有一个或多个减毒突变，如在相应于JS cp45的Tyr942、Leu992、Thr1558。优选的，这些突变通过生物突变体的相同或保守的氨基酸替代，引入本发明人-牛嵌合PIV中。因此，PIV重组体可能包括一个Tyr942被His替代、Leu992被Phe替代和/或Thr1558被Ile替代的突变。与这些被替代氨基酸保守的替代物可用于产生期望的突变表型。
来自生物学来源的PIV突变体的其它模式突变包括N蛋白的一个或多个突变，包括在相应于JS cp45残基Val96、Ser389处的氨基酸替代。在详细的方面，这些突变代表了Val96到Ala，或Ser389到Ala，或与之保守的替代。本发明重组PIV中有用的氨基酸替代还发生在C蛋白上，如在相应于JS cp45的Ile96上，优选与由Ile96到Thr的相同或保守的替代。来自生物学来源的PIV突变体的其它模式突变包括F蛋白的一个或多个突变，包括在JS cp45上相应于JS cp45残基Ile420或Ala450处，优选由Ile420到Val、Ala450到Thr的替代或与之保守的替代。本发明其它PIV重组体采用HN蛋白的一个或多个氨基酸替代，以下为范例，重组PIV采用了相应于JS cp45残基Val384处的一个突变，优选由Val384到Ala的替代。
本发明这方面的其它例子包括这种重组PIV，其在PIV基因组或反基因组非编码部分(如3’端前导区)具有一个或多个突变。文中的突变范例可在重组病毒3’前导序列中(相应于JS cp45核苷酸23、24、28或45)的一个位置上工程化。其它的突变范例可在重组病毒N基因起始序列中工程化，如通过改变N基因起始序列一个或多个核苷酸，如在相应于JS cp45核苷酸62位置处。更详细的方面，C、D和/或V剔除突变体在核苷酸23处由T变为C，在核苷酸24处由C变为T，在核苷酸28处由G变为T，和/或在核苷酸45处由T变为A。在基因外序列中的其它突变的例子是N基因起始序列相应于JS cp45核苷酸62位置处由A变为T。
可在C、D和/或V剔除突变中工程化的突变范例成功地被工程化，并在重组PIV中回收，如以下重组PIV克隆rcp45、rcp45 L、rcp45F、rcp45 M、rcp45 HN、rcp45 C、rcp45 F、rcp45 3’N、3’NL和rcp45 3’NCMFHN(Durbin等，Virology 235323-332，1997；Skiadopolos等，J.Virol.721762-8；1998年5月22日美国专利申请09/083,793；1997年5月23日美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO98/53078)；1997年9月19日美国临时专利申请60/059,385；分别在此引用作为参考)。
从JS cp45和其它生物学来源的PIV突变体，得到了减毒突变的大“菜单”，其中每个突变都可以与其它突变组合，调节带有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组体PIV的减毒、免疫原性和遗传稳定性的水平。文中，本发明许多重组PIV包括一个或多个，优选两个或更多来自生物学来源的PIV突变体的突变，如JS cp45中发现的突变之一或组合。优选的本发明重组体PIV具有多个并直至全部在JS cp45或其它生物学来源的PIV突变体中发现的突变。优选的，由于在决定每个突变的密码子处有多个核苷酸替代，这些突变在具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组体PIV中稳定地抗回复突变。
其它可引入本发明C、D和/或V缺失或剔除突变PIV的突变是存在于异源PIV或更远源的非区段化负链RNA病毒的突变，如减毒突变。特别的，负链RNA病毒中的减毒或其它期望的突变可被“转移”，如被拷贝到C、D和/或V缺失或剔除突变体基因组或反基因组中的相应位置。简要的说，异源负链RNA病毒中期望的突变被转移到PIV受体。包括在异源病毒中定位该突变，经序列对比识别受体PIV中相应位点，将RSV受体的天然序列突变为该突变基因型(相同或保守突变)，在以下文献中进行了表述1999年4月13日Murphy等(案卷号17634-000600)的美国临时专利申请，名为“从克隆的核苷酸序列制备减毒的负链RNA病毒疫苗”，在此引用作为参考。如这些文献所述，优选修饰受体基因组或反基因组以在突变位点编码一个变化，其保守地相应于异源突变病毒中的变化。例如，如果突变病毒中相应于野生型序列的一个氨基酸替代标志突变的一个位点，则重组病毒相应残基处可工程化产生一个相似的替代。优选，该替代应包括一个与突变病毒蛋白中替代残基相似或保守的氨基酸。但对于突变蛋白中的替代残基，也可能非保守地改变突变位点的天然氨基酸(如利用其它氨基酸破坏或消弱野生型残基的功能)。在其中鉴别模式突变并转移于本发明人-牛嵌合PIV中的负链RNA病毒包括其它PIV(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、BPIV或MPIV)、RSV、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)等。本发明使用的多种突变范例在以上引用的文献中做了说明，包括但不限于相应于的HPIV3 L蛋白456处苯丙氨酸(或保守性相关的氨基酸)并由此可转移的RSV L的521处苯丙氨酸。在标志为缺失或插入的突变中，这些可以作为相应的缺失或插入被引入背景基因组或反基因组中，但缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列不一。
在前述引用的文献中表述了多种其它类型的突变，它们可以容易地工程化引入本发明重组PIV中，调节生长、减毒、免疫原性、遗传稳定性，或提供其它有利的结构和/或表型效果。例如，限制性标记可常规地引入C、D和/或V ORF缺失或剔除突变体反基因组或基因组中，以利于cDNA的构建和操作。
本发明中也可用的是使C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV疫苗病毒作为嵌合人-牛PIV产生的方法和组合物。这些重组体可通过用人或牛PIV的异源基因、基因组区段或单个或多个核苷酸，替代或附加于部分或完整的牛或人PIV基因组或反基因组，产生一种人-牛嵌合PIV基因组或反基因组(参见，1999年7月9日案卷号为15280-399000US)Bailey等的美国临时专利申请，名为“减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作为参考)。本发明的一个方面，人-牛嵌合PIV包含一个部分或完整的牛背景PIV基因组或反基因组，其组合了来自一个或多个人PIV的一个或多个异源基因或基因组区段。或者，人-牛嵌合PIV可包含部分或完整的人背景PIV基因组或反基因组，其组合了来自一个或多个牛PIV的一个或多个异源基因或基因组区段。选择用于异源插入或添加到背景基因组或反基因组中的基因和基因组区段包括N、P、C、D、V、M、F、HN、或L的任何野生型或突变基因或基因组区段。在一个模式实施方案中，HPIV3受体或背景基因组的N基因的ORF被BPIV3 N基因的ORF所替代，产生了在非人灵长类宿主中表现与亲本BPIV病毒类似的宿主范围限制表型的感染性重组子。优选的，该异源人或牛基因编码一个或多个PIV的保护性抗原，优选一个或多个HN和/或F糖蛋白或其免疫原结构域或表位，尽管其它蛋白可能也有助于保护性免疫应答，其因此也是优选的目标用于构建用于本发明的人-牛PIV嵌合病毒。
或者，具有C、D和/或V缺失或剔除突变的人-牛嵌合PIV可能包含编码一个PIV抗原蛋白的胞质结构域、跨膜结构域、胞外域或免疫原性表位的一个或多个基因组区段。这些免疫原蛋白、结构域和表位在免疫化的宿主中产生新的免疫应答。例如，来自人PIV的一个或多个免疫原基因或基因组区段，对牛背景基因组或反基因组的添加或替代，产生一种重组的、嵌合的病毒或亚病毒颗粒，其能产生针对一种或多种特定人“供体”PIV株的免疫应答，而该牛骨架提供了减毒表型，使该嵌合体成为疫苗发展中有用的候选疫苗。
在C、D和/或V ORF中具有突变的人-牛嵌合PIV的构建，是通过将部分PIV背景基因组或反基因组中对应的基因或基因组区段替代为异源基因或基因组区段。或者，该异源基因或基因组区段可以被添加到例如一个基因的3’或5’非编码区，作为一个额外的基因或基因组区段组合一个完整的PIV背景基因组或反基因组(或部分背景基因组或反基因组，当缺失其它基因或基因组区段时)。该异源基因或基因组区段可以被添加到部分或完整PIV背景基因组或反基因组的基因间隔区，从而不破坏该背景基因组或反基因组中的读码框。或者，该异源基因或基因组区段可以在相应于其相应基因或基因组区段的野生型基因位置上被加入或替代到部分或完整PIV背景基因组或反基因组中，其对应的基因或基因组区段由此被替代或移位(如到更加远离启动子的位置)。其它一些实施方案中，部分或完整PIV背景基因组或反基因组中，异源基因或基因组区段可以在比其对应的基因或基因组区段的野生型基因位置更加接近或远离启动子的位置加入或替代，分别可以增强或降低该异源基因或基因组区段的表达。这些和所引用参考文献中所述的修饰可以引入本发明C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体中。
产生嵌合PIV的异源免疫原蛋白、结构域或表位的引入尤其适用于在免疫化宿主中产生新的免疫应答。来自一个供体PIV的免疫原基因或基因组区段，对不同株的PIV受体基因组或反基因组的添加或替代所产生的免疫应答针对供体亚型或株、受体亚型或株、或针对二者。为达到这一目的，构建表达嵌合蛋白的C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV，如表达免疫原蛋白，其特异于一种PIV的细胞质尾和/或跨膜区与特异于另一种PIV胞外域融合，产生人-牛融合蛋白，或具有两种不同人PIV结构域的融合蛋白。优选实施方案中，C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组在重组病毒颗粒或亚病毒颗粒中编码同时具有人和牛二者的糖蛋白结构域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如，编码人PIV HN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的异源基因组区段，可以与编码相应牛PIV3 HN或F糖蛋白的胞质结构域和/或跨膜结构域的多核苷酸序列(即，基因组区段)相连，形成人-牛嵌合PIV基因组或反基因组。
其它一些实施方案中，用于疫苗制剂中的C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体可容易地被修饰，以适应循环病毒的抗原漂移。典型的，修饰发生在HN和/或F蛋白中。一种PIV株的完整HN或F基因，或编码其特定免疫原区的一个基因区段，通过替代不同PIV株或亚型受体克隆中的相应区段，或通过添加该基因的一个或多个拷贝，引入嵌合PIV基因组或反基因组cDNA，产生多种抗原形式。修饰后的PIV克隆的子代病毒可以用于抗一些PIV株的疫苗制剂。
人PIV的编码和非编码序列(如启动子、基因末端、基因起始、基因间区或其它顺式作用元件)经对应的异源部分如另一种人PIV或牛或鼠PIV的序列替代后，产生具有多种可能的减毒或其它表型效果的嵌合PIV。特别的，宿主范围和其它期望表型来自用牛或鼠PIV基因引入人PIV背景中，其中牛或鼠基因在人细胞中不能有效作用(如，由于异源序列或蛋白与生物交互作用的人PIV序列或蛋白(即通常与被替代序列或蛋白协作，参与病毒转运、翻译、装配等的序列或蛋白)不相容，或更典型的，与在许可和许可程度低的宿主之间存在宿主范围限制差异的一种细胞蛋白或细胞环境的其它方面不相容)。在模式实施方案中，基于已知的牛和人PIV结构和功能方面，选择牛PIV序列引入人PIV。
本发明其它方面中，产生了C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV，其中嵌合基因组或反基因组进一步通过引入一个或多个在产生的嵌合病毒或亚病毒颗粒中特定导致产生减毒或其它期望表型的突变被修饰。这些突变可以重新产生，并根据合理设计的诱变方式检测其减毒效果。或者，这些突变可以从现存的生物学来源突变PIV中鉴定，并引入本发明C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV中。这些重组PIV提供了疫苗制剂所须的上述改善的减毒和免疫原特性。文中，以上引用的文献说明了具有替代到部分HPIV3背景反基因组中的HPIV1HN和F基因的嵌合PIV重组体的构建，其进一步被修饰，以包含在HPIV3 JS cp45中发现的一个或多个减毒突变。一个这种嵌合重组体包含cp45 L基因中发现的所有减毒突变。也曾发现显示异源(HPIV1)HN和F基因外的所有cp45突变都可以引入HPIV3-1重组体中，以产生一个减毒的嵌合候选疫苗。
引入C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体的来自生物学来源PIV的减毒突变，可以天然存在或可以通过已知的诱变方法引入野生型PIV。例如，不完全减毒的亲本PIV株可能通过病毒在细胞培养时添加化学诱变剂而产生，通过选择亚适温度时传代的病毒以诱导生长限制突变，或通过选择在细胞培养中产生小噬菌斑的被诱变病毒，方法在以上的引用文献中有述。
“生物学来源的PIV”是指任何不通过重组方式产生的PIV。因此生物学来源的PIV包括所有天然存在的PIV，包括如具有野生型基因组序列的天然存在的PIV，和具有与参照野生型RSV序列相比有等位基因差异或突变基因组差异的PIV，例如具有特异导致产生减毒表型的突变的PIV。同样，生物学来源的PIV包括亲本PIV经人工诱变和选择方法产生的PIV突变株。
如上所述，可以几种方式产生足够减毒的生物学来源的PIV。其中之一包括细胞培养中部分减毒的病毒在渐低的减毒温度中传代。例如，部分减毒的突变体在细胞培养中低于最适温度下的传代而产生。因此采用cp突变体或其它部分减毒PIV突变株，以使其在低温培养时通过传代而有效生长。与部分减毒的亲本相比，选择冷传代突变PIV显著降低了衍生株的任何残存毒性。
另外，特定突变可以通过对部分减毒亲本病毒进行化学诱变引入生物学来源的PIV中，如引入ts突变，或当该病毒已是ts突变时，引入额外的ts突变使足以产生比该减毒衍生物ts表型更加强的减毒和/或稳定性。ts突变引入PIV的方法包括，根据已知方法使病毒在诱变剂(如5-氟尿苷)存在时复制。也可以使用其它化学诱变剂。产生减毒的ts突变可产生在任何PIV基因内，尽管其特别可能的靶是聚合酶(L)基因。
在本发明使用的模式减毒PIV中，复制温度敏感性的水平，是通过比较其在许可温度和在几种限制性温度时的复制来确定。将与其在许可温度时相比复制下降100倍或更多倍的最低温度作为其截止温度。在实验动物和人中，PIV的复制和毒性都与该突变体截止温度相关。
JS cp45 HPIV3被认为是相对遗传稳定、高免疫原性和具有满意的减毒性。对这种包含多种所述单个突变和组合突变的生物学来源和重组病毒的核苷酸序列分析显示，减毒增加的每个水平都与特定核苷酸和氨基酸替代相关。上述引用文献也公布了如何常规地区分沉默的偶发突变和以下突变，它们因感染性PIV克隆基因组或反基因组中引入的独立或组合形式突变产生表型差异。该过程还包括对亲本和衍生病毒的表型特征进行评估，检测出导致如减毒、温度敏感、冷适应、小噬菌斑和宿主范围限制等这些期望性状的突变。
这样发现的突变被集结成一个“菜单”，可以按需要以单独或组合形式引入，以调整C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体的相关性状，如减毒、免疫原性、对减毒表型回复突变的遗传抗性等。与以上所述相符，从cDNA中得到感染性PIV的能力使可以在C、D和/或VORF缺失和剔除突变体中引入具体的工程化变化。特别的，用感染性重组PIV来检测生物学来源减毒PIV株中具体的突变，如特定导致产生ts、ca、att和其它表型的突变。由此产生需要的突变，并引入重组的、C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV疫苗株中。从cDNA中得到PIV的能力使能够将突变单独或以各种选择的组合，常规地引入全长cDNA克隆中，随后可以容易地确定具有这些所引入突变的被援救重组病毒的表型。
通过在感染性PIV克隆中鉴定并引入与期望表型(如cp或ts表型)有关的特定的生物学来源突变，本发明提供了在鉴定的突变处，或位于其紧邻处的其它位点特异性修饰。多数生物学来源PIV中的减毒突变是单核苷酸位点改变，但也可利用重组技术将其它“位点特异性”突变引入生物学来源的或重组PIV中。此处所述位点特异性突变包括1-3直到约5-15或更多已变核苷酸(如变自野生型PIV序列，或选择的突变PIV株序列，或经诱变的亲本重组PIV克隆)的插入、替代、缺失或重排。这类位点特异性突变可被引入选择的生物学来源的点突变处，或其区域内。或者，突变可以引入PIV克隆的其它区域，如顺式作用调控区或编码蛋白活性位点、结合位点、免疫原性表位等的核苷酸序列或其附近。位点特异性PIV突变体典型的具有一个期望的减毒突变，但可能还表现与减毒无关的其它表型变化，如增强或扩大的免疫原性和/或改善的生长。位点特异性突变的进一步范例包括在决定减毒点突变的密码子处引入额外的稳定的核苷酸改变的重组PIV。如可行，在亲本突变PIV或重组PIV克隆中决定减毒氨基酸变化的密码子处，引入两个或更多核苷酸替代，产生对减毒表型的回复具有遗传抗性的生物学来源或重组PIV。其它一些实施方案中，位点特异性的核苷酸替代、插入、缺失或重排被引入靶核苷酸位置的上游(N末端方向)或下游(C末端方向)(如从1到3，5-10，直到15核苷酸或更靠近5’或3’端)，以例如构建或消除现有的顺式作用元件。
除了单和多点突变和位点特异性突变，此处公布的C、D和/或VORF缺失和剔除突变PIV的变化包括除缺失或消除的C、D和/或V ORF或基因组区段以外的整个基因或基因组区段的缺失、插入、替代或重排。基于变化的特点(即，少量碱基可能被改变以插入或消除一个免疫原性表位或改变一个小基因组区段，而大量碱基参与基因或大的基因组区段的添加、替代、缺失或重排)，这些突变可以改动供体或受体基因组或反基因组中少量碱基(如，从15-30碱基，到35-50碱基或更多)，大量核苷酸(如，50-100，100-300，300-500，500-1000个碱基或更多)，或几乎全部或全部基因(如，1000-1500，1500-2500，2500-5000个，500-65000个核苷酸或更多)。
在其它方面，本发明提供了来自生物学来源PIV的突变(如cp和ts突变)附加于重组PIV克隆中，在这进一步修饰的PIV克隆中伴随有涉及相同或不同基因的其它突变类型。每个PIV基因的表达水平可被选择性地改变，或整体或部分，单独或组合，被添加、缺失、替代或重排，以获得表现新的疫苗特征的C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV。因此，除了来自生物学来源PIV突变体的减毒突变外，或与之组合，本发明也提供了基于对感染性PIV克隆遗传工程化的多种使之减毒或改变C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV表型的其它方法。编码靶基因或基因组区段(包括嵌合PIV基因组或反基因组中用于引入感染性克隆的供体或受体基因或基因组区段)的分离的多核苷酸序列上可产生多种改变。更特定的，本发明为了在重组PIV中获得期望的结构和表型改变，许可引入使一个或多个来自亲本基因组或反基因组的核苷酸缺失、替代、引入或重排的突变，以及缺失、替代、引入或重排整个基因或基因组区段的突变，到C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV克隆内。
因此提供了C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV中的修饰方法，其中除了缺失或去除的C、D和/或V ORF或基因组区段外，仅改变或消除了选定基因的表达，例如，在选定PIV的编码序列中引入终止子，改变与一个PIV基因与可操作连接启动子的相对位置，引入上游起始密码子以改变其表达速率，修饰(如，通过改变位置、变动现有序列或用一个异源序列替代现有序列)GS和/或GE转录信号以改变其表型(如生长和转录时的温度限制等)，和其它决定病毒复制、选定基因的转录或选定RNA的翻译的变化程度和性质的缺失、替代、添加和重排。文中，任何非生长所必须的PIV基因都可以在重组PIV中被消除或修饰，以在毒性、病原性、免疫原性和其它表型特征方面产生期望的效果。
此外，PIV基因组或反基因组中也可产生许多其它遗传改变，以单独或与生物学来源突变PIV来源的一个或多个减毒突变一起，引入人-牛嵌合PIV，例如用以调整其生长、减毒、免疫原性、遗传稳定性或其它有利的结构和/或表性效果。前述的引用文献中也公布了这些附加类型的突变，且其可容易地工程化引入本发明人-牛嵌合PIV。例如，可以在人-牛嵌合PIV反基因组或基因组中常规地引入限制性位点标记，以促进cDNA的构建和操作。
本发明也提供了在C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV中的遗传修饰，其改变或消除了靶C、D和/或V ORF外所选择的基因或基因组区段的表达，且不从PIV克隆中去除该基因或基因组区段。例如，这可以通过引入改变一个起始密码子编码排列或在选择的编码序列中引入终止密码子的突变，改变基因位置或引入上游起始密码子以改变其表达，改变GS和/或GE转录信号以改变表型(如生长，转录中的温度限制等)来实现。本发明更详细的方面中，提供C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV，其除靶C、D和/或V ORF外的基因的表达在翻译水平被消除，该基因或其区段没有缺失，例如通过如在翻译读码框(ORF)中引入多个翻译终止子。这产生了活的病毒，其一个选择的基因在翻译水平沉默，但该基因未缺失。其它实施方案中，多个终止子被引入靶ORF中。或者，一个突变被引入RNA编辑位点，或引入改变起始密码子所决定的氨基酸的突变。这些剔除病毒形式在组织培养中常表现生长速率降低和小噬菌斑。因此，这些方法提供了其它的新型的减毒突变，其消除非主要病毒保护性抗原的病毒基因的表达。文中在未缺失基因或基因组区段产生的剔除病毒表型，也可以通过此处所述缺失诱变的方法获得，以有效地排除可能恢复靶蛋白合成的纠正性突变。C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体的几种其它基因剔除可以利用本领域已知的其它设计和方法获得(例如，Kretschmer等，Virology 216309-316，1996；Radicle等，Virology 217418-412，1996；Kato等，EMBOSS J.16178-587，1987；Schneider等，Virology 277314-322，1996；在此分别引用作为参考)引入本发明C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV中的其它突变包括直接作用于顺式作用信号的突变，这可以利用PIV微基因组突变分析检测出。例如对前导序列、非转录尾序列和侧翼序列的插入和缺失分析检测出病毒的启动子和转录信号，并提供了一系列与RNA复制或转录下降的各种水平相关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(每个位点轮流改为各种核苷酸)也检测出许多降低(或一种情况是增加)RNA复制或转录的突变。此处所述任何突变都可插入C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组中。以上引用文献中描述的PIV微基因组可辅助完整的反基因组cDNA对反式作用蛋白和顺式作用RNA序列的评价和操作。
C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV中的其它突变包括基因组3’末端被其反基因组的对应部分替代，随之改变了RNA复制和转录。一个模式实施方案中，特定PIV蛋白(如保护性HN和/或F抗原)的表达水平可因其天然序列被所合成并设计的符合有效翻译的序列替代而增加。文中显示，密码子的使用是哺乳动物病毒蛋白翻译水平的主要影响因素(Haas等，Current Biol.6315-324，1996，在此引用作为参考)。通过重组，使编码PIV HN和/或F蛋白(二者是主要保护性抗原)的mRNA中使用的密码子最适合，可使这些基因的表达增加。
另一个模