专利名称：涉及减毒支原体的方法猪肺炎支原体为猪支原体肺炎的病源因素(也称为地方性肺炎(EP))。它是影响全世界猪生产的最常见的和具有经济显著性的呼吸道疾病之一。这种疾病通常会伴随着继发性感染，高发病率，低死亡率以及低饲料转化率，这种疾病所造成的全 球经济损失估计为约每年十亿美元。在EP中，猪肺炎支原体细菌粘附到猪肺部上皮细胞的纤毛上，损害健康的正常纤毛，同时造成机会性生物进入呼吸道组织中从而引起疾病。一旦定植，猪肺炎支原体将引起猪的肺部病变。这种疾病是高度传染性的，并且通常通过直接接触感染的呼吸道分泌物传播，例如打喷嚏或咳嗽时从鼻孔或嘴中喷出的液滴。目前存在几种抵抗猪肺炎支原体的疫苗。其中大多数疫苗由约十个公司的22个被注册为单价或二价/多价的疫苗商标所提供。所有的疫苗都是灭活或者失活的猪肺炎支原体制剂。全细胞灭活的猪肺炎支原体疫苗的例子包括RESPISURE 和STELLAMUNE (辉瑞)、SUVAXYN Μ. ΗΥ0 (富道)、HY0RESP (梅里亚)、M+PAC (先灵葆雅)和 P0RCILIS (英特威)。尽管一些疫苗可减轻EP的严重程度，但没有任何一种可用的全细胞灭活或失活的疫苗能够完全免除猪肺炎支原体的感染。作为W02010/132932 公开的相关申请(co-pending application),描述了一种温度敏感的活的减毒猪肺炎支原体菌株。在2004年5月13日将该菌株表示为ts-19，并作为NM 04/41259保藏在布达佩斯条约国家计量研究院。当将该菌株作为疫苗时，能够赋予接种疫苗的猪对猪肺炎支原体的防护性免疫。
第一方面，提供了一种鉴定减毒支原体细菌的方法，该方法包括分析支原体细菌，以确定在至少一种编码表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在；其中，突变的存在表明所述支原体是减毒的。减毒疫苗通常具有很多优越性，因为他们携带天然形式的与致病因子(infectious agent)有关的所有免疫原决定簇(immunogenic determinants),并将其带入宿主的免疫系统中，并且由于所述因子能够在接种疫苗的宿主中增殖,因此,需要的免疫因子的量相对少。减毒的方法包括将毒性菌株多次传代或暴露于放射线或化学药品。据推测，这些方法在基因组中引入了突变，致使微生物毒性降低但仍能复制。这些方法的缺点在于，引入了在分子水平上无法表征的随机突变。同样，筛选减毒的方法，如有关温度敏感性的筛选，常常是耗时的，会产生错误的结果，因为温度敏感的菌株可能不是减毒的，并且减毒菌株不需要是温度敏感的，以及需要大量的试验和错误。另夕卜，减毒菌株也可能进行进一步的突变并恢复为毒性菌株(virulence)。一种替代策略为产生不可逆的基因限定的减毒支原体。然而到目前为止，尚未确定支原体减毒影响的基因。与减毒支原体的亲本菌株(Parent strain)相比，本发明确定了在减毒支原体中的突变，并利用这方面的知识确定了应该突变哪些基因以提供减毒支原体。第一方面的方法能够促进减毒支原体菌株的筛选，以及鉴定减毒菌株是否已经恢复为毒性菌株。第二方面，提供了一种产生减毒支原体的方法，该方法包括将支原体细菌的初始群体(initial population)置于减毒条件下，从而产生假定的减毒细菌群，并分析假定的减毒细菌群的单克隆，以确定在至少一种编码表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在，其中，突变的存在表明所述支原体是减毒的。 第三方面，提供了一种由第一方面的方法筛选的或由第二方面的方法产生的减毒支原体细菌。第四方面，提供了一种含有第三方面的减毒支原体细菌的免疫原性组合物。第五方面，提供了一种含有第四方面的免疫原性组合物的支原体疫苗。第六方面，提供了一种诱导对个体(subject)中的支原体引起的疾病的防护性免疫的方法，该方法包括用安全剂量(protective amount)的第三方面的减毒支原体、第四方面的免疫原性组合物或第五方面的疫苗对个体进行给药。可选择的方面，提供了用于诱导对支原体引起的疾病的防护性免疫的第三方面的减毒支原体、第四方面的免疫原性组合物或第五方面的疫苗。进一步可选择的方面，提供了第三方面的减毒支原体、第四方面的免疫原性组合物或第五方面的疫苗在制备用于预防由支原体引起的疾病的药物中的应用。本发明的发明人确定了减毒猪肺炎支原体菌株(ts-19)(保藏在国家计量研究院，保藏号(accession number)为NM04/41259)的核酸序列，以及毒性菌株(通过NTG 突变(Mycoplasma hyopneumoniae isolate LKR, Lloyd&Etheridge(1981)J. Comp.Path. 91:77-83)从该毒性菌株中产生减毒菌株)的序列。利用序列比对和他们在本领域中的知识分析，本发明的发明人能够确定某些他们认为和减毒有关的突变。本发明的发明人将这些突变作为猪肺炎支原体中和其它支原体中减毒的标记，并且这些突变可以用来筛选减毒支原体菌株。当利用引起随机突变的减毒条件产生减毒支原体时，这特别适用。突变的筛选提供了一种简单的确定支原体菌株是否为减毒的菌株的方法，因此适于配制成疫苗。第七方面，提供了一种确定动物是否被减毒或毒性支原体菌株感染的方法，该方法包括分析来自动物的含有支原体的样品，以确定在至少一种编码表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在，其中，不存在突变表明所述动物被毒性支原体感染了。第八方面，提供了一种区分接种减毒支原体菌株的动物和感染支原体的动物的方法，该方法包括分析含有支原体的样品，以确定在至少一种编码表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在；其中，样品中突变的存在表明所述样品来源的动物接种了减毒的支原体疫苗。猪肺炎支原体是在猪中引起地方性肺炎的高度传染性和慢性的疾病。这种疾病是在世界范围内流行的。第七方面和第八方面的方法使得能够将已接种减毒菌株的猪和感染的猪或疫苗菌株已转化为毒性菌株的猪区分开。第九方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括对一种或多种编码表I列出的蛋白的基因中的突变或者表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中的突变具有特异性的引物或探针。第十方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括对图I中显示的至少一种突变具有特异性的引物或探针。第九方面和第十方面的试剂盒可以用于第一、第七或第八方面的方法中。图IA-C显示了与作为NC 007295. I保藏的M. hto J和M.hyo LKR菌株相比，Μ· hyo ts-19疫苗菌株(第一代(master)和P12)中突变的确切性质和位置。图2A-D显示了在标准图形模式中基因组靶MHP2的高分辨率溶解曲线(HRM)图。(A)Vaxsafe MHP 菌株、Vaxsafe MHP 的亲本菌株和 M. hyo 的野外分离株(field isolatedstrain)的 HRM ； (B)VaxsafeeMHP 菌株和Vaxsaf^MHP 亲本菌株的 HRM ； (C)Vaxsafe MHP菌株和野外分离株的HRM ； (D)野生型菌株已经被标准化的差异图，以便能够观察到野生型的任何偏差。图3A和B显示了 Vaxsafe MHP菌株和亲本菌株在标准图形模式中基因组革巴MHP9/10的高分辨率溶解曲线(HRM)图。(B)疫苗菌株已经被标准化的差异图，以便能够观察到疫苗的任何偏差。图4A和B显示了 Vaxsafe —菌株、亲本菌株和这两种菌株的混合在标准图形模式中基因组靶MHP9/10的高分辨率溶解曲线(HRM)图。(B)疫苗菌株已经被标准化的差异图，以便能够观察到疫苗菌株的任何偏差。

10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 种
或全部突变，单独或与表2、3、4或5中列出的至少一种突变结合。在一种实施方式中，所述减毒菌株包括一个或各个毒性因子；和/或一个或各个参与碳水化合物代谢的基因，和/或参与磷脂代谢的基因；和/或参与辅助因子代谢的基因；和/或一个或各个参与转录或翻译的基因；和/或一个或各个参与膜转运的基因；和/或一个或各个参与DNA复制、修复或代谢的基因；和/或表I中列出的转座酶基因。在一种实施方式中，所述减毒菌株具有各个毒性因子的突变。在P95、P69、P216、P146基因以及脂蛋白基因内发现的突变最可能对减毒具有影响，因为已经记载了这些基因与毒性有关(Ferreira and de Castroet al. , (2007).Genetic and Molecular Biology 30:p245-255)o在另一种实施方式中,所述减毒菌株具有表2中列出的至少1、2、4、5、6、7、8、9、10
种或全部突变，单独或与表1、3、4或5中列出的至少一种突变结合。
在另一种实施方式中，所述减毒菌株具有表3中列出的至少1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44种或全部突变，单独或与表1、2、4或5中列出的至少一种
突变结合。在另一种实施方式中,所述减毒菌株具有表4中列出的至少1、2、4、5、6、7、8、9、10种或全部突变，单独或与表1、2、4或5中列出的至少一种突变结合。在另一种实施方式中，所述减毒菌株具有表5中列出的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 种或全部突变，单独或与表I、2、3或4中列出的至少一种突变结合。表I :猪肺炎支原体疫苗菌株ts-19基因中的减毒突变。


本发明提供了一种鉴定或产生减毒支原体细菌的方法，所述细菌具有至少一种所列出的基因中的突变，以及所述细菌在用于诱导对支原体的防护性免疫的疫苗中的应用或检测被所述细菌感染中的应用。