专利名称：从克隆的核苷酸序列制备减毒负链rna病毒疫苗的制作方法 负链RNA病毒包含有不同目的重要且高破坏性的病原体单负链病毒(Mononegavirales)。这个组中的人类病原体包括狂犬病病毒(RaV)、麻疹病毒(MeV)、腮腺炎病毒(MuV)、呼吸道合胞病毒(RSV)及数个基因型的副流感病毒(PIV)。以RSV为例，因为其在一岁以内的婴儿中导致肺炎及支气管炎疾病，该病原体危害位于其他所有微生物病原体之上。在因呼吸道疾病而入院治疗的儿童中，由RSV引起的占1/5以上，RSV在美国一年内导致估计有91,000名患者住院及4,500名死亡。人类PIV病毒(例如，HPIV1、HPW2及HPIV3)在人群中也导致很严重的疾病，其可导致支气管炎、哮喉及肺炎，尤其是在婴幼儿中。Karron等，J.Infect.Dis.1721445-50(1995)；Collins等，″副流感病毒″(Parainfluenza Viruses)，p.1205-1243。在B.N.Fields等编辑的Fields Virology，第三版，第一卷，Lippincott-Raven出版社，费城(1996)；Murphy等，病毒研究(Virus Res.)，111-15(1988)。人类PIV病毒所致感染在婴幼儿呼吸道感染而住院的群体中占据接近20％。尽管经过数十年的研究也研制出几种有效疫苗以对抗RSV及PIV，但是还没有获得既安全又有效的疫苗以降低严重RSV感染的发病率和死亡率。同样需要研制出有效的疫苗或改良疫苗来对抗另一些重要的单负链病毒。阻碍抗负链RNA病毒的活疫苗发展的障碍是在减毒及免疫原性之间取得平衡的困难性。减毒病毒的遗传稳定性同样是一个问题。在RSV疫苗的发展过程中也遇到RSV在细胞培养中生长性较差及病毒颗粒不稳定性等困难。RSV感染的另一特征是诱导产生的免疫性并不完全保护随后产生的感染。产生这种情况的原因很多，包括免疫系统在呼吸道的腔表面限制病毒感染方面相对低效，局部粘膜免疫的短期性，快速及广泛的病毒复制，婴幼儿中由于免疫系统不成熟所致减毒的免疫反应，由于母亲血清抗体经胎盘传输所致的免疫抑制，以及病毒的某些特征如G蛋白的高度糖基化。同样正如下面所讨论的那样，RSV以两个抗原亚型A及B的形式存在，对抗其中之一的免疫性对另一个亚型效力较低。在二十世纪60年代中叶，甲醛灭活的病毒疫苗作为抗RSV的疫苗被测试，但在抗RSV感染或疾病的保护上没有获得成功，且事实上随后的病毒感染呈现恶化的症状。(Kim等，Am.J.Epidemiol.，89422-434(1969)，Chin等，Am.J.Epidemiol.，89449-463(1969)；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.，89405-421(1969))。最近，RSV疫苗的开发已聚焦于减毒RSV突变株上。Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204690-694(1968)报道了RSV的一种冷传代突变株(cpRSV)，其被充分减毒成为候选疫苗。此突变株与野生型(wt)亲代病毒相比，显示出轻微增加的在26℃生长的能力，但其复制既没有温度敏感性也没有明显的冷适应性。然而，却将冷传代突变株减毒用于成年人。尽管对于已被RSV感染的婴幼儿(例如，血清反应阳性的个体)，cpRSV已令人满意地被减毒并且具有免疫原性，但cpRSV仍保留对于血清反应阴性婴儿上呼吸道的低水平毒性。类似的，Gharpure等人，病毒学杂志(J.Virol.)3414-421(1969)报道了作为有价值的候选疫苗的温度敏感性RSV(tsRSV)突变株。一种突变株ts-1，被广泛地用于实验室和自愿受试者中。突变体在成年自愿者中产生无症状感染且在致免疫45天后对野生型病毒攻击产生抗性。对比血清反应呈阳性的婴儿和遭受无症状感染的儿童，血清反应呈阴性的婴儿呈现鼻炎征兆和其它轻微的症状。此外，ts表型的稳定性被检测到，尽管表现出部分或全部温度敏感性缺失的病毒占可从疫苗重新获得的病毒的较小比例，且不与除轻微鼻炎疾病以外的疾病征兆相关联。这些和其它的研究显示特定的冷传代和温度敏感性RSV株被不充分减毒且在疫苗接种者导致轻微的疾病特征，尤其血清反应阴性的婴儿，而其它的被超减毒且不能充分的复制来引起保护性的免疫应答，(Wright等，Infect.Immun.，37397-400(1982))。此外，候选疫苗突变株的遗传不稳定性导致其温度敏感性表型的缺失，进一步阻碍了有效的RSV疫苗的开发。通常参见，Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164(1974)，McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696(1974)，以及Belshe等，J.Med.Virol.，3101-110(1978)。抛弃了通过不确定的生物学方法例如冷传代构建合适减毒RSV株的方法，研究者通过纯化的RSV包膜糖蛋白来测试亚型疫苗候选毒株。糖蛋白在棉鼠的肺中诱导对RSV感染的抗性，Walsh等，J.Infect.Dis.1551198-1204(1987)，但是抗体具有非常弱的中和活性，且用纯化的亚型疫苗免疫啮齿动物会导致疾病的加强，这使人联想到先前已处理过的RSV疫苗(Murphy等，Vaccine 8497-502(1990))。表达F或G包膜糖蛋白的基于疫苗病毒重组体的疫苗已被进行研究。这些重组体表达不能被从真正病毒对应物中区别开的RSV糖蛋白，用疫苗-RSV F和G重组体经皮感染的啮齿动物表现出高水平的中和病毒感染力的特异性抗体。事实上，棉鼠用疫苗F重组体感染可刺激出对RSV在下呼吸道复制的几乎完全的抗性以及在上呼吸道中的明显的抗性。Olmsted等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)837462-7466(1986)。然而，用疫苗F和G重组体免疫黑猩猩，在上呼吸道中几乎没有提供抗RSV攻击的保护(Collins等，Vaccine8164-168(1990))，其在下呼吸道中提供的保护前后不一(Crowe等，疫苗(Vaccine)111395-1404(1993))。针对RSV和其它负链RNA病毒的生物减毒疫苗株、亚型疫苗以及其它疫苗开发策略的不成功使得迫切需要一种新的方法来开发新的疫苗，特别是人工重组候选疫苗的方法来加入遗传变化，以生产具有新表型特性的活减毒RSV重组体。然而，对RSV和其它反义RNA病毒的基因组RNA的操纵处理至今仍是很难的。此方面的主要障碍包括这些病毒的裸露的基因组RNA的非感染性、病毒在组织培养物中的不良生长、冗长的复制循环、病毒体的不稳定性、染色体组复杂以及基因产物结构的难以控制。以PIV3为例，两个活减毒候选疫苗已经得到了特别的关注，这其中一个候选疫苗是牛PIV3(BPIV3)株其与HPIV3在抗原性上相关，且其已显示保护动物抵抗HPIV3。BPIV3是减毒的，遗传稳定的，且在人类婴幼儿中是具有免疫原性的(Karron等，J.Inf.Dis.1711107-14(1995a)；Karron等，J.Inf.Dis.1721445-1450，(1995b)).另一个PIV3候选疫苗JS cp45，是HPIV3的JS野生型(wt)株的冷适应性突变株(Karron等，(1995b)，同上；Belshe等，J.Med.Virol.10235-42(1982))。该活减毒、冷传代(cp)PIV3候选疫苗展示出温度敏感性(ts)、冷适应性(ca)及其在体内病毒复制后具有稳定性的减毒(att)表型。cp45病毒在实验动物中可以产生抗人类PIV3的活性且其是减毒的，遗传稳定的，且在血清反应阴性的人类婴幼儿中具有免疫原性(Hall等，病毒研究22173-184(1992)；Karron等，J.Infect.Dis.172(6)1445-1450(1995b)，同上)。
重组DNA技术使得从cDNA重新获得有感染力的负链RNA病毒、遗传操作病毒克隆来构建新的候选疫苗、以及快速估计其减毒和表型稳定性的水平成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-89(1996)；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-58，(1996))。在此文中，已报道了在必需病毒蛋白的存在下由cDNA编码的反基因组RNA来重组拯救传染性的呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒3(HPIV3)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、仙台病毒(Sev)、牛瘟病毒、S型猿猴病毒和牛RSV(参见，例如，Garcin等，EMBO J.146087-6094(1995)；Lawson等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.).924477-81(1995)；Radecke等，EMBO J.145773-5784(1995)；Schnell等，EMBO J.134195-203(1994)；Whelan等，美国国家科学院学报.928388-92(1995)；Hoffman等，病毒学杂志(JVirol.)714272-4277(1997)；Kato等，Genes to Cells 1569-579(1996)，Roberts等，病毒学(Virology)247(1)，1-6(1998)；Baron等，病毒学杂志(J Virol.).711265-1271(1997)；国际申请WO97/06270；Collins等，美国国家科学院学报9211563-11567(1995)；Durbin等，病毒学(Virology)235323-332(1997)；专利申请U.S.No.08/892,403,申请于1997年7月5日，(相应于国际申请WO 98/02530，优先权为美国临时申请60/047,634(申请于1997年5月23日)、60/046,141(申请于1997年5月9日)和60/021,773(申请于1996年7月15日))；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819(1997)；He等Virology237249-260(1997)；Whitehead等，病毒学247(2)232-9(1998a)；Whitehead等，病毒学杂志72(5)4467-4471(1998b)；Jin等，病毒学251206-214(1998)；Bucholz等，病毒学杂志73251-259(1999)；以及Whitehead等，病毒学杂志73(4)3438-3442(1999)，所述文献均引入本文作参考)。
尽管使用反求遗传学手段以回收和修饰重组、负链RNA病毒是可行的，本领域一个迫切的需要却仍是使用另外的工具及方法以产生安全且有效的疫苗以缓解因为单负链病毒如RSV、PIV及其他病原体对身体健康的严重损害。本文所述的其他挑战是获取适度减毒、免疫原性及遗传稳定的候选疫苗的困难性。为达到这个目的，现有的鉴别减毒突变及在重组病毒株中引入减毒突变的方法必须进一步提高及改进。令人惊奇的是，本发明实现了该目的且提供了如下文所述的另外的优点。
主题病毒的重组基因组及反基因组经过修饰以编码一个突变，其在一个重组病毒蛋白的一个或数个氨基酸位置发生改变，这些位点对应于在一个异源、突变负链RNA病毒的减毒突变位点。突变因此以可采用的或重复的方式“转移”，以赋予该重组病毒减毒表型。以这种方式，候选疫苗病毒被重组改造，以引发免疫反应，所述免疫反应在易于被主题病毒感染的宿主中可以抵抗所选择的负链RNA病毒。
在与本发明相关的一些方面，提供了分离的多核苷酸分子及载体，其可以编码一个减毒的、重组负链病毒基因组或反基因组。与上述方面相关，主题基因组或反基因组编码一个在选择的病毒重组蛋白中在相应于异源的、突变负链RNA病毒中的减毒突变位点的氨基酸位置上发生的突变。
同样本发明提供了包含如上进行突变的、减毒的、重组负链RNA病毒的方法及组合物，以预防及治疗由主题病毒所引起的感染。
在本发明的一个优选实施例中，重组负链RNA病毒可以是一个呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)或者麻疹病毒。与每一实施方案都相关联的是，异源性、突变负链RNA病毒可以是一个异源性RSV、人类副流感病毒(HPIV1、HPIV2、HP1V3)、牛PIV(BPIV)、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、腮腺炎病毒(MuV)、麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)或者水泡性口膜炎病毒(VSV)。
不同的目标蛋白应有益于在一个负链RNA病毒中的一个异源性蛋白的相应位点引入减毒突变，其与本发明所述方法相适应。在单负链病毒目中，五个目标蛋白都严格保守且在特定区域显示出适度至高度的序列同一性。特别是，该目所有成员都有五个蛋白的同源簇一个核壳蛋白(N)，一个核壳磷蛋白(P)，一个非糖基化基质(M)蛋白，至少一个表面糖蛋白(HN、H或者G)及一个大的聚合酶(L)蛋白。这些蛋白都是适用于在相应于异源性突变病毒株中鉴别的减毒突变位点的位点上在重组病毒的蛋白中改变一个或多个保守残基以引入减毒突变的目标蛋白。
在本发明更为详细的方面，可以靶向其他蛋白，其只可局限于由单负链病毒中特殊的科、亚科、属或种所具有的蛋白。例如，副粘病毒科的所有成员至少有两种表面糖蛋白，HN(或H或G)及F。在呼吸道病毒属、Rubulavirus及麻疹病毒属几乎所有的成员中都有一个富半胱氨酸蛋白V。呼吸道病毒及麻疹病毒同样编码一个同源性C蛋白。肺病毒属及Rubulaviruses的一个亚型(猿猴病毒5(SVS)及腮腺炎病毒(MuV))都具有同源性表面糖蛋白SH。在肺病毒属中(包括牛、绵羊及公山羊RSV及鼠肺病毒——在这儿也可称为鼠RSV)，几种其他蛋白，即NS1、NS2、M2(ORF1)及M2(ORF2)，都是保守性的。鸟类肺病毒缺乏NS1及NS2但具有M2(ORF1)、M2(ORF2)及SH蛋白。前述的每一蛋白提供一有用的目标，其可以在具有相同目标蛋白的分类群之间异源转移减毒突变。
在本说明书中，本发明所述的方法是基于对第一负链RNA病毒中减毒突变的识别。在标记突变位点的主题氨基酸位置上相对于野生型序列而被识别为突变体的这一突变，提供了和不同的病毒中的同源蛋白进行序列对比的标记，所述不同的病毒是用于重组减毒的目标病毒。减毒突变可以提前获知，也可以通过诱变及反求遗传学技术进行鉴别，这些技术用于产生及表征生物学上获得的突变病毒。作为一种选择，感兴趣的减毒突变可以例如通过定点诱变及传统的筛选方法被重新产生及表征。
每一在负链RNA病毒株中鉴别出的减毒突变都提供了与一个或多个异源负链病毒株中的同源性蛋白进行序列对比的标记。在本说明书中，可分析现有的序列对比，或者可将传统的序列对比方法用于进行序列对比分析，以鉴别出在携有减毒突变的蛋白及不同病毒同源性蛋白之间相应的蛋白区域及氨基酸位置，其中所述病毒是用于减毒的目标重组病毒。当一个或多个标记减毒突变的残基由野生型而改变，该野生型在目标病毒蛋白中的相应氨基酸位置是保守的，目标病毒的基因组及反基因组经过重组修饰为编码一氨基酸缺失、替换或插入，以改变目标病毒蛋白中的保守残基并因此在重组病毒中赋予同功的、减毒表型。
在这个构建减毒重组负链RNA病毒株的合理设计方法中，在一个负链RNA病毒中的标记减毒突变的氨基酸残基位点的野生型特性可能是严格保守的，也可能是在目标病毒蛋白的相应氨基酸残基位点进行了保守性替换。这样，相对于野生型残基来说，目标病毒蛋白的相应残基可以是同一性的，或者可能是在氨基酸侧链基团的结构及功能方面是保守性相关的，在异源突变病毒中所述野生型残基通过减毒突变而改变。在任一种情况下，重组病毒的同功性减毒可以通过修饰目标病毒的重组基因组或反基因组来编码氨基酸缺失、替换或插入以改变保守性残基等本发明所述方法来实现。在本说明书中，优选修饰基因组或反基因组以编码保守性残基的改变，其保守地对应于在异源突变病毒中标记有的减毒突变的改变。例如，如果与相应的野生型序列相比氨基酸替换在突变病毒株中标记突变位点，则在相应的重组病毒残基位点可以进行这样的替换。优选所述替换相对于突变病毒蛋白中的替换残基是同一性的或保守性的。然而，同样可能相对于突变蛋白的替换残基在非保守性突变的天然氨基酸残基位置上发生改变(例如，通过使用任一其他氨基酸来破坏或损害野生型残基的特性及功能)。在以缺失或插入标记的突变的情况下，这些可以以相应的缺失或插入转移到重组病毒中去。然而，缺失或插入的蛋白片段的氨基酸序列及具体大小可以改变。
在本发明的另一方面，除了预期的减毒表型外，引入重组负链病毒中去的突变还可以提供其他表型，这样，除了减毒表型以外，引入重组病毒蛋白中去的典型突变还可以赋予温度敏感性(ts)的、冷适应(ca)、小噬斑型的(sp)或宿主范围限制型的(hr)表型，或者生长或免疫原性的改变。
在本发明的一个典型实施方案中，一个ts或非ts突变发生在负链病毒大的聚合酶L蛋白，例如HPIV3。一个减毒突变在一个异源突变负链RNA病毒株中(例如，RSV)被发现，其也可以是任一病毒，其具有与有感兴趣突变的PIV3相关的保守性的蛋白结构。在更为详细的实施方案中，异源突变病毒株中的减毒突变包含有一个氨基酸替换，其是在人类RSV cpts530(ATCC VR 2452)L蛋白的521位点的苯丙氨酸上的替换。
在另一个典型实施方案中，一个ts或非ts减毒突变发生在副流感病毒(PIV)的重组蛋白中，例如人类PIV1(HPIV1)、人类PIV2(HPIV2)、人类PIV3(HPIV3)、牛PIV(BPIV)或鼠PIV(MPIV或仙台病毒)。重组基因组或反基因组被修饰以编码在重组病毒的N、P、C、D、V、M、F、HN或L蛋白中的氨基酸替换、缺失或插入。突变可以在重组病毒中产生一个ts或非ts减毒表型。优选的是，异源突变负链RNA病毒中的减毒突变相应于生物学上获得的突变HPIV3株JS cp45的突变，且其优选是在HPIV3 JS cp45的L蛋白中的氨基酸替换。在本说明书中典型的突变包括在HPIV3株JS cp45的L蛋白的942位酪氨酸的替换，HPIV3株JS cp45的L蛋白的992位亮氨酸的替换，和/或HPIV3株JS cp45的L蛋白的1558位苏氨酸上的氨基酸替换。
但是在用于构建本发明所述重组PIV的异源突变负链RNA病毒株中所发现的其他突变包含有一个HPIV3株JS cp45的F蛋白中的氨基酸替换。在一个实施方案中，异源病毒株中的减毒突变包含有HPIV3株JS cp45的F蛋白的420位的异亮氨酸的替换。作为一种选择，减毒突变也可包括HPIV3株JS cp45的F蛋白的450位的丙氨酸的替换。同样，重组PIV的减毒可以通过修饰重组PIV基因组或反基因组以编码一个在RSV中发生的减毒突变的同功突变来实现。在下面所述的这样的一个实施方案中，RSV中所发生的减毒突变包括有一个RSV的L蛋白的521位苯丙氨酸的替换。PIV基因组或反基因组已被修饰以编码一个保守地相应于在异源RSV突变株中标记减毒突变的残基改变的保守性残基的改变。在一个实施方案中，突变发生在重组HPIV3蛋白中且包括一个发生在HPIV3株JS cp45的L蛋白的456位苯丙氨酸上的氨基酸替换。
但是本发明另外的PIV候选疫苗可以通过修饰重组PIV基因组或反基因组以编码与仙台病毒(SeV)中发生的减毒突变来同功的突变完成。在下述的一个实施方案中，减毒突变包含有SeV的C蛋白170位苯丙氨酸的替换。PIV基因组或反基因组被修饰以编码一个保守性地相应于在异源SeV突变株中标记减毒突变的残基改变的保守性残基的改变。在一个实施方案中，突变在重组HPIV3蛋白中发生并包含有在HPIV3的C蛋白的164位点发生的苯丙氨酸的氨基酸。
在另一些典型实施方案中，一个ts或非ts减毒突变在麻疹病毒(MeV)的重组蛋白中发生。其中发生减毒突变的异源突变负链RNA病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒(HPIV)1、HPIV2、HPIV3、牛PIV(BPIV)、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、腮腺炎病毒(MuV)、麻疹病毒(MeV)、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)或者水泡性口膜炎病毒(VSV)。更为适宜的是，异源突变病毒是HPIV3 JS cp45。在更为详细的实施方案中，HPIV3 JS cp45中所发生的减毒突变包含有在L蛋白992位亮氨酸或在942位酪氨酸的氨基酸替换。
但是本发明所提供的另外的实施方案中，重组负链RNA病毒是一个嵌合病毒。更为详细的情况是，该病毒具有一个重组基因组或反基因组，其包含有与其他负链RNA病毒株、亚型或种的异源基因或基因片段结合的一个负链RNA病毒株、种或亚型的一部分或全部的基因组或反基因组。减毒突变可以任选地发生在由所述异源基因或基因片段所编码的蛋白或蛋白区域。在优选的方面，嵌合病毒是一个具有与异源PIV种、亚型或株的HN及F糖蛋白基因的至少一个基因或基因片段结合的一个PIV种、亚型或株的全部基因组或反基因组的PIV。在另一个实施方案中，嵌合病毒是一个RSV，其中重组基因组或反基因组有来自一个异源RSV种、亚型或株的F、G或SH糖蛋白基因的一个基因或基因片段。优选的情况是，人类RSV亚型A中F及G糖蛋白基因为在RSV的A亚型的背景条件下人类RSV亚型B中F及G糖蛋白基因所替换。
在本发明的其他方面，重组负链RNA病毒通过对重组基因组或反基因组的其他改变而进一步被修饰或者减毒。在一个实施方案中，基因组或反基因组进一步被修饰，以编码一个或多个附加的减毒突变，其已被生物学上获得的突变负链RNA病毒株所采用。例如，在一个重组RSV中，基因组或反基因组被修饰以编码存在于生物学上获得的突变RSV株的组中的至少一个直到全部的减毒突变。所谓小组包含有(ATCC VR 2450)、cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)、cpts RSV248/955(ATCC VR 2453)、cpts RSV 530(ATCC VR 2452)、cpts RSV530/1009(ATCC VR 2451)、cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)、RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1 cp-23(ATCC VR2579)。另外，在一个重组PIV中，重组基因组或反基因组编码至少一个直到全部存在于HPIV3 JS cp45中的减毒突变。优选的情况是，本文所述的至少一个减毒突变通过编码突变的专一性密码子中的多个核苷酸的变化来稳定。
在本发明的其他方面，重组负链RNA病毒通过专门针对一选自生长特征、减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑大小、宿主范围限制性或免疫原性的改变中的表型改变的核苷酸修饰而进一步被修饰或减毒。例如，在RSV中，重组基因组或反基因组可以包括SH、NS1、NS2或G基因的修饰，例如基因缺失或基因表达的消除。在RSV及其他的负链RNA病毒中的其他的核苷酸修饰包括在顺式作用调控序列或者重组基因组或反基因组当中的核苷酸缺失、插入、增加或重排。
在其它相关方面，本发明提供了一个分离的重组负链RNA病毒，其已被减毒且在对主题病毒感染易感的宿主中引发免疫反应。该病毒包含有重组基因组或反基因组及产生RNA病毒的感染性病毒颗粒所必需的病毒蛋白。重组基因组或反基因组已被修饰，以编码病毒重组蛋白中相应于异源突变负链RNA病毒中所鉴别的减毒突变的氨基酸位置的氨基酸位置上的突变。该突变，通过在重组蛋白中引入，对于该重组病毒来说提供了一个减毒表型。
本发明同样也提供了分离的多核苷酸分子，其编码一个重组负链RNA病毒的重组基因组或反基因组。重组基因组或反基因组同样被修饰，以编码一个在病毒重组蛋白中发生在相应于异源突变负链RNA病毒中减毒突变的氨基酸位置的氨基酸位置上的突变。该突变，通过在重组蛋白中引入，对于该重组病毒来说提供了一个减毒表型。在相关的方面，所提供的表达载体包含有一个可操作性连接的转录启动子，一个编码上述重组负链RNA病毒的重组基因组或反基因组的多核苷酸分子及一个转录终止子。
本发明同样也提供了一种方法，其可以激发个体的免疫系统以诱导产生抗负链RNA病毒感染的免疫保护反应。该方法包括给予个体以免疫学上足够量的如上所述的减毒重组负链RNA病毒及一生理学上可以接受的载体。在其它相关方面，提供一免疫原性组合物，其诱导产生抗负链RNA病毒感染的免疫反应。该组合物包括免疫学上足够量的本发明所述的减毒重组负链病毒及一生理学上可以接受的载体。减毒重组负链病毒优选是RSV、PIV或者麻疹病毒。
图例的简要说明

图1中的A组提供了一个呼吸道合胞病毒(SEQ W NO.44)、副流感病毒3(SEQ ID NO.45)、麻疹病毒(SEQ ID NO.46)及仙台(SEQID NO.47)病毒等的横跨RSV Phe-521(以箭头注释)的L聚合酶蛋白的氨基酸序列对比。一个共有序列(SEQ ID NO.48)产生于每一位置至少三个残基的精确匹配。这儿已经标明所列举序列的首个氨基酸的位置编号。所有四个病毒中的保守性残基都以粗体标明。底下画横线的残基在PIV2、犬瘟热病毒、猿猴副流感病毒41、猿猴副流感病毒5、鸟肺病毒、新城疫病毒、Hendra病毒及牛瘟病毒L聚合酶蛋白中同样是保守的(登记号分别为P26676、P24658、P35341、Q88434、Y09630、U65312、X05399、AF017149、P41357)。PIV3的L聚合酶中456位氨基酸残基相应于在RSV cpts530中发生521位的苯丙氨酸至亮氨酸突变的位置。
图1中的B组提供了一个表示被引入到PIV3 rwt中的F456L突变及cp45突变的示意图。引入的cp45突变的相应位置以(*)标明，F456L突变的相应位置以(◆)标明。
图1中的C组显示了一个核苷酸序列(正义)，其编码F456L突变(SEQ ID NO.50)相比较于wt序列(SEQ ID NO.49)。针对wt病毒的按照完全的rwt的反基因组编号的PIV3核苷酸序列已显示，突变序列如下进行显示。核苷酸的改变以下划线表示，携有F456L突变的密码子以粗体表示。所引入的Xmnl限制性核酸内切酶识别位点在突变序列中以斜体表示。
图2描绘的是在黑猩猩上呼吸道中的rcp45及rcp45-456的复制。在鼻咽(NP)擦拭标本中平均的病毒滴度是在感染后指定的日期来自使用口，rcp45-456，n＝6；或者■，rcp45 n＝4感染的动物。在指定病毒之间的统计学显著差异分别为(a)P＜0.005；(b)p＜0.05；(c)p＜0.025；斯氏t检验。(d)检测限≤0.5log10TCID50/ml。
图3描绘的是HPIV3 P/C/D/V ORF的组织结构图(没有按照比例)。P mRNA的三个阅读框被显示为(+1、+2及+3)，同时，P、C、D及V ORF通过矩形来显示。RNA编辑位点被显示为一垂直线，且显示了其序列基元并按照其在完整HPIV3反基因组序列中的核苷酸位置进行编号。
图3中A组描绘的是未编辑的P mRNA的组织结构图。该含有P及C ORF的翻译起始位点的序列得以显示(SEQ ID NO.52)，且按照完整的反基因组序列对其进行了编号。在完整的反基因组序列中的P、C、D及V ORF核苷酸位点为P，1784-3595；C，1794-2393；D，2442-2903；V，2792-3066。相对于P mRNA，开放P之ORF的AUG在80-82位点。
图3中B组显示了一个在编辑位点(SEQ ID NO.51)含有两个非模板残基G(GG)(SEQ ID NO.53)插入的经编辑的P mRNA的组织结构图。这样就改变了阅读寄存器以致于P ORF在框+2处的上游末端与在框+3处的D ORF融合。所得的嵌合蛋白含有为P ORF所编码的N末端241个氨基酸，所述P ORF与为D ORF所编码的C末端131个氨基酸融合。
图4显示了证明C蛋白在rF164S中表达的放射免疫沉淀试验。路径(a)35S-标记的细胞溶解物使用多克隆C特异性兔抗血清进行免疫沉淀。一个相应于C蛋白(空心箭头)的22kD带清楚地存在于rJS及rF164S溶解物中。路径(b)细胞溶解物使用两个特异于HPIV3 HN蛋白的单克隆抗体的混合物进行免疫沉淀。相应于HN蛋白(实心箭头)的64kD带存在于每一病毒沉淀物中，这确定它们确实是HPIV3且表达类似水平的蛋白。模拟路径显示出获自未感染细胞的组织培养物的溶解物。
图5显示了与亲本病毒rJS相比较，重组突变病毒rF164S的多循环复制的结果。病毒滴度以TCID50/ml表示且其是平行两份样品的平均结果。
本发明所述方法提供了一个适于作为疫苗使用的减毒重组负链RNA病毒。重组负链RNA病毒产生自一个或多个分离的编码该病毒的多核苷酸分子。重组病毒的生产通过在细胞或无细胞体系中一个或多个编码下述物质的多核苷酸分子进行共表达而实现(i)病毒的重组基因组或反基因组及(ii)产生感染性病毒或亚病毒颗粒所必需的基本病毒蛋白。
主题重组病毒的重组基因组或反基因组被修饰，以编码在病毒重组蛋白的一个或多个氨基酸位置上的突变，其相应于在异源突变负链RNA病毒中的减毒突变位点。异源负链RNA病毒中的减毒突变因此被“转移”进入重组病毒的一个相应位点，从而赋予重组病毒减毒表型。转移的突变与在异源突变病毒中所鉴别的减毒突变相比较为同一性的或保守性的，尽管非保守型的替换也可以被使用。通过以这种方式在重组负链RNA病毒中引入转移的突变，设计出候选疫苗病毒，以引发一预期的在对该感染型病毒易感的宿主中抵抗主题病毒的免疫反应。
本发明提供了一个新的范例，用于基于在异源负链RNA病毒中减毒突变的鉴别合理性设计减毒疫苗病毒。在异源病毒中的减毒突变被定为一个或数个氨基酸在感兴趣的异源突变病毒蛋白中的缺失、替换或插入，例如，通过传统的在突变病毒及其非减毒亲本病毒之间的核苷酸或氨基酸比对。在本说明书中，亲本病毒一般为生物学上获得的株，其为野生型，至少对于减毒表型来说是这样的。然而，部分减毒突变病毒株也可以被使用，其中附加的减毒突变可以通过人工诱变或自然的多态现象等来实现。此外，其中减毒突变可以被引入且随后被作图的亲本病毒，其包括人工产生的病毒例如通过cDNA病毒克隆按照已知的反求遗传学方法所提供的病毒。
这样，在异源负链RNA病毒中鉴别的减毒突变可以是先前已知的或者可以通过传统的诱变和/或反求遗传学技术产生或鉴别。这些技术可以被用于产生或者表征生物学上获得的突变病毒，或重新产生及表征感兴趣的减毒突变，例如通过定点诱变野生型或者非减毒突变病毒cDNA克隆且结合传统的筛选方法一起，以鉴别减毒衍生物。用于感染性病毒克隆的回收和遗传学操作的反求遗传学方法对于整个单负链病毒(综述可以参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-89(1996)；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-58，(1996))的代表性的病毒群体来说是已知的。
例如，已报道了从cDNA-编码的反基因组RNA拯救针对狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)及仙台病毒(SeV)牛瘟(Baron等，J.Virol.711265-1271(1997))及猿猴病毒S(He等，Virology 237249-260(1997)，参见第5页)的感染型病毒克隆，所述cDNA-编码的反基因组RNA与基本病毒蛋白共表达以产生感染性，所述基本病毒蛋白即为核壳N、磷蛋白P、大的聚合酶亚基L(参见，例如，Garcin等，EMBO J.146087-6094(1995)；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-81(1995)；Radecke等，EMBO J.145773-5784(1995)；Schnell等，EMBO J.134195-203(1994)；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-92(1995)；及国际公开WO 97/06270，所述文献均引入本文作为参考)。
拯救呼吸道合胞病毒(RSV)已通过开发一新型的使用cDNA编码的反基因组RNA的系统来完成，所述反基因组RNA与核壳N、磷蛋白P、大的聚合酶亚基L及先前未表征的M2 ORF1基因产品共表达(参见，美国专利申请No.08/720,132(申请日为1996年9月27日，其是一个美国临时申请No.60/007,083(申请日为1995年9月27日))的继续申请，及美国专利申请No.08/892,403(申请日为1997年7月15日，其相应于公布的国际申请No.WO 98/02530且是美国临时申请No.60/047,634(申请日为1997年5月23日)，60/046,141(申请日为1997年5月9日)及60/021,773(申请日为1996年7月15日)等的部分继续申请，所述文献均引入本文作为参考)。这些发明包括对用于产生感染性重组RSV的代表性构建体的说明，所述重组RNV包括含有来自生物学上获得的RSV突变株的减毒突变的重组RSV克隆。其中一个这样的构建体是含有RSV突变株cpts530(被命名为D53-530-位点)的减毒突变的重组病毒克隆。用于RSV克隆回收及重组操作的组合物及方法的其他描述参见Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9211563-7(1995)；Juhasz等，疫苗171416-1424(1999)；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819(1997)；Whitehead等，Virology247(2)232-9(1998a)；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471(1998b)；及Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442(1999)，所述文献均引入本文作为参考。
在另一个重要的实施方案中，感染性副流感病毒(PIV)的拯救同样可以使用cDNA编码的与N、P及L蛋白共表达的反基因组RNA来实现(参见，美国专利申请No.09/083,793(申请日期1998年5月22日)，其相应于已公开出版的专利申请WO 98/53078且是美国临时申请No.60/047,575(申请日期1997年5月23日)及60/059,385的部分继续，所述文献均引入本文作为参考)。这些参考资料包括下述用于产生感染性PIV克隆的质粒p3/7(131)(ATCC 97990)；p3/7(131)2G(ATCC 97989)；及p218(131)(ATCC 97991)；每一个都按照布达佩斯条约的条款保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 Boulevard大学，Manassas，Virginia 20110-2209。
用于负链RNA病毒回收及操作的反求遗传学系统的发展允许对减毒突变具体的分析及作图，以开发专门针对主题病毒的有用的候选疫苗。迄今为止，在单负链病毒目中通过重组技术转移减毒突变，其并未被测试或完成。但是，所鉴别的减毒突变株较宽范围例如有代表性的种类如RSV、PIV、麻疹病毒及其它单负链病毒，其与通过反求遗传学手段所提供的有力工具一起在本发明方法中用作确定可用于异源的突变的丰富资源。
在异源负链RNA病毒中的减毒突变可以在生物学上获得的突变株中进行鉴别，其已被引入本发明所述的异源重组病毒中去了。通过已知的诱变程序，野生型或者部分减毒的亲本株中，该主题突变可以天然存在或者被引入。例如，减毒突变病毒株可以通过在病毒在细胞培养的过程中经过加入化学诱变剂化学诱变而产生，通过选择在亚适温下传代的病毒以引入生长限制性突变而产生，或者通过选择以诱变剂诱变的其可以在细胞培养物中产生小噬斑(sp)或温度敏感性(ts)病毒的病毒而产生(参见，例如，美国专利08/327,263，所述文献引入本文作为参考)。
“生物学上获得的突变株”这儿是指任何不经过重组手段所产生的突变病毒。这样，生物学上获得的突变株就包括具有与相关野生型序列在基因组不同的天然存在的突变株，例如，部分减毒突变PIV株。同样，生物学上获得的突变株也包括获自任一亲本病毒株且不经过重组手段尤其是人工诱变及选择技术的突变株。
一个众所周知的用于产生生物学上获得的负链RNA病毒的技术程序涉及使一野生型或部分减毒突变株以逐渐降低的温度在一细胞培养物中传代。例如以RSV为例，野生型病毒一般在将近34-37℃的温度下培养。部分减毒突变株则在亚适温例如20-26℃下在细胞培养物中经过传代而产生(例如，初级牛肾细胞)。这样，cp突变株或其他部分减毒株例如ts-l或者spRSV，在低温下通过在MRC-5或者Vero细胞中传代而有效生长，所述温度低至大约20-24℃，最好是20-22℃。所述在冷传代过程中选择的突变RSV，相比较部分减毒亲本株而言，充分地消除了在衍生株中残余的任何毒性。
作为一种选择，具体的突变可通过对野生型或部分减毒亲本株化学诱变而被引进生物学上获得的病毒中去，例如，引入ts突变或在病毒已经是ts的病毒中，引入其他ts突变，其足以增加减毒衍生株减毒的程度和/或稳定ts表型。将ts突变引入负链RNA病毒中去的方法包括在诱变物质例如5-氟尿苷或5-氟尿嘧啶在其浓度大约为10-3至10-5M，最好是大约10-4M的存在下进行病毒复制，将病毒暴露于浓度大约为100μg/ml的亚硝基胍中，按照普通的例如Gharpure等J Virol.3414-421(1969)及Richardson等，J.Med.Virol.391-100(1978)所述的步骤进行。其他的化学诱变剂也可以被用到。减毒可来自于一个几乎在所有病毒基因中的ts突变，尽管特别适用于此目的的目标已被发现为高度保守性聚合酶(L)基因。
在本发明所使用的典型减毒突变病毒株中复制的温度敏感性水平通过比较许可温度下的复制及极端限制性的温度下复制而确定。与许可温度下的复制相比较病毒复制减少100倍或者更多的最低温被定义为截止温度。在实验动物及人类中，典型突变RSV株的复制及毒性近似地与突变株的截止温度相关联。具有39℃的截止温度的突变株的复制被适度限制，而具有38℃的截止温度的突变株的复制明显较差且疾病的症状主要限于上呼吸道。而具有35至37℃截止温度的病毒在人类中一般是完全减毒的。这样，本发明所使用的减毒的生物学上获得的突变株RSV(为ts型)，其截止温度的范围大约为35至39℃，且优选是35至38℃。将ts突变加入到部分减毒突变株中可以产生数倍减毒的病毒，其可用于本发明的疫苗组合物。
许多作为候选疫苗的减毒的RSV株通过多次使用化学诱变剂以在其已经经过冷传代减毒的病毒中引入多重突变而得以开发(例如，Connors等，Virology 208478-484(1995)；Crowe等，Vaccine 12691-699(1994a)；及Crowe等，Vaccine 12783-790(1994b)，所述文献均引入本文作为参考)。在适宜的啮齿类动物或猩猩类动物模型中和在人类成人及婴儿中测定生物学上获得的突变株，显示这些候选疫苗株中的一些是遗传稳定的，高免疫原性的且减毒的。同样也有关于PIV及其他一些本发明所述的负链RNA病毒株类似的减毒突变病毒株的描述(参见美国专利08/892,403及其相应的国际申请WO98/02530；美国专利09/083,793及其相应的国际申请WO 98/53078,所述文献均引入本文作为参考)。
按照本发明所述的方法，减毒突变病毒株的核苷酸序列分析可被用于以具体的核苷酸及氨基酸改变绘制减毒突变图谱，所述分析涉及比较突变株与亲本病毒株如野生型或部分减毒株的DNA或氨基酸序列。经常是这些改变涉及到个别的氨基酸替换，但是按照本发明所述方法其他进行保守性转移的突变涉及多重氨基酸替换、氨基酸插入或缺失，同样也在目标蛋白的保守区发生大规模的改变。
通过使用上述反求遗传学手段，减毒突变病毒株中核苷酸和氨基酸的改变可被引入一个先前已被描述的cDNA编码的病毒，这样就允许技术人员区别无记载的偶然发生的突变及用于目标表型改变的突变。在这点上，主题突变被个别引入和以不同的组合方式进入感染性RSV克隆的基因组或反基因组中去。这个过程结合亲本及衍生性病毒表型特征的测定进一步鉴别出用于减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑尺寸、宿主范围限制性等目标特征的突变。
这样，所鉴别及作图的突变提供了一个用于使用本文所述的异源转移方法设计重组负链RNA病毒的候选突变的丰富源泉。鉴别及描述负链RNA病毒中该减毒突变的典型的说明参见美国专利08/892,403及其相应的国际申请WO 98/02530；及美国专利申请08/083,793及其相应的国际申请WO 98/53078。这些及其他一些引入本文的参考资料提供了一个减毒突变的“目录”，所述减毒突变候选用于按照本发明所述方法转移进入异源病毒克隆中去。
例如，美国专利申请08/892,403及其相应的国际申请WO 98/02530描述了RSV的冷传代(cp)及温度敏感性(ts)突变株(肺病毒亚科；肺病毒属)，包括命名为cpts RSV 248(ATCC VR 2450)、cpts RSV248/404(ATCC VR 2454)、cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)、cptsRSV 530(ATCC VR 2452)、cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)、cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)、RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR2542)及RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)的典型突变株。在这些生物学上获得的突变株中减毒突变的一个典型组已被作图且描述，包括在大的聚合酶基因L中的具体的核苷酸改变，其结果在于亲本残基/序列位置Phe521、Gln831、Met1169及Tyr1321等处氨基酸的替换，正如减毒替换Leu替换Phe521，Leu替换Gln831，Val替换Met1169，Asn替换Tyr1321。每一个这样的突变发生在高度保守的L蛋白中且在突变病毒中赋予一个ts表型。然而，其他突变已在RSV及其他的一些负链RNA病毒和其他的一些保守性蛋白中得以鉴别，其赋予了一些减毒表型，包括ts或非ts减毒表型，如本文所列举的冷传代(cp)、小噬斑(sp)、冷适应性(ca)或宿主范围限制性(hr)突变病毒株。
这样，按照本发明所述方法用于引入重组负链病毒的其他典型性突变已被鉴别为不很相关的副粘病毒、人类PIV3(副粘病毒亚科；呼吸道病毒属)。生物学上获得的(冷传代型)HPIV3突变病毒株JS cp45(参见美国专利08/083,793及其相应的国际申请WO 98/53078，所述文献引入本文作为参考)中，这样一组突变已被鉴别且表征。在这株中作图且已表征的突变为编码在减毒突变聚合酶L基因的亲本残基/序列位点Tyr942、Leu992、和/或Thr1558处ts减毒氨基酸替换的核苷酸的改变。在典型的JS cp45突变L蛋白中，Tyr942为Ile所替换，Leu992为Phe所替换，Thr1558为lie所替换。这些突变都已被成功引入不同的PIV重组体中，包括命名为r942、r992、r1558、r942/992、r992/1558、r942/1558及r942/992/1558，其中用数字表示单一和组合突变。
在HPIV3 JS cp45中另一个典型的突变已作图且表征为在HPIV3中的F及C蛋白中编码氨基酸替换。这些包括编码非ts减毒氨基酸替换的突变，所述替换位于P基因的C蛋白的JS HPIV3亲本残基/位点Ile96上，例如Ile96为Thr所替换。HPIV3的F蛋白中所鉴别的其他典型突变编码在亲本残基/位点Ile420和Ala450处的氨基酸替换，例如Ile420为Val替换，Ala450为Thr所替换。
以这种方法同样可被确认的是在一个负链病毒基因中非编码区的减毒突变。例如，减毒突变可以包括基因起始序列中的单一或数个碱基的改变，例如在RSV M2基因起始序列中在7605位核苷酸处的减毒碱基替换。当这些突变位于异源负链RNA病毒中的保守性核苷酸位点时，其按照本发明所述方法也可适于在异源群之间进行转移。
这样，在负链RNA病毒中鉴别的每一减毒突变提供了一个对同源蛋白在一个或数个异源负链病毒中进行序列对比的一个指标。为了实践本发明的这一方面，可以分析已有的序列对比，或者应用传统的序列对比方法以进行序列比较，以鉴别在一个负链RNA病毒中携有已鉴别减毒突变的蛋白及一个在不同的且为用于重组减毒的目标病毒的病毒的同源蛋白之间的相应蛋白区域及氨基酸位置。该技术的焦点在于鉴别一个或多个与第一(异源)病毒减毒突变相关的残基，也就是说，其是已被从一个亲本序列改变的残基，其中亲本缺乏突变表型。经过序列对比其已被确定是否突变株的亲本序列是保守性的，这通过鉴别在目标(重组)病毒蛋白中在相应氨基酸位置相同或保守性氨基酸残基的存在来进行确定。一般情况下，这样保守性的野生型序列元件将在蛋白的保守性区域出现，但分离的残基及氨基酸残基结构在不同的单负链病毒分类群中也是广泛保守的且能提供同样可用于在异源RNA病毒之间异源性转移减毒突变的目标(其中全部或部分携有突变改变的保守性序列元件被复制或输入重组病毒，以产生一新型的减毒衍生体)。
单负链病毒中不同的保守性蛋白在本发明中对于将在一个异源负链RNA病毒中发现或产生的减毒突变引入一个不同的重组病毒株中提供了一个有益的目标。这些可归功于单负链病毒中不同分类群之间特别突出的功能及结构的保守性。在此目中，五个目标蛋白是普遍保守的，其为公认的获自关系较远的祖辈普通病毒的同源蛋白。这些蛋白一般显示出中等至高等的序列同一性，尤其是在具有共同功能特征的具体的区域或结构域。明确一点地说，所有已知的负链RNA病毒都有含有核壳蛋白(N)、一个核壳磷蛋白(P)、一个非糖基化基质(M)蛋白、至少一个表面附着糖蛋白(HN、H或G)及一个大的聚合酶(L)蛋白的同源蛋白群。这些蛋白每一个都展示出保守性的序列元件，其为通过改造在目标病毒及异源亲本病毒之间相同的一个或数个保守性残基进行转移减毒突变的有用的目标，对此突变衍生物或构建体已被鉴别，已显示出影响某一减毒表型的氨基酸的改变。此外的蛋白也被以此种方式靶定，其仅在单负链病毒的一定的科、亚科、属或者种之间是共有的。
单负链病毒目包括线状病毒科、副粘病毒科、博纳病毒科(Bornaviridae)科及棒状病毒科，其均包含具有单分裂(monopartite)负链RNA基因组的病毒，参见Pringle，Arch Virol.117137-140(1991)。该组中分类学的一个概要包括科/亚科/属的鉴别且每一组中具体的类型由Pringle，Arch Virol.142(11)2321-2326(1997)提供。单负链病毒的一个代表性的分类及副粘病毒科的一个扩展型的分类列于表1中。这三科病毒与线性负链RNA基因组中所出现的基因结构的共同特征证明了其作为一个目的合理性，尤其是考虑到这样的事实，遗传重组很少发生，毕竟在这些病毒中及随后出现的表型关系中都反映出遗传上的连续性。表1.非节段化的负链RNA动物病毒单负链病毒目-棒状病毒科水疱病毒属(水泡性口膜炎病毒)狂犬病毒属(狂犬病病毒)Ephemerovirus属(牛短暂热病毒)其他属-线状病毒科(埃博拉病毒，马尔堡病毒)-博纳病毒科(博纳疾病病毒)-副粘病毒科在副粘病毒科及指定分类群的成员中的呼吸道合胞病毒分类副粘病毒亚科呼吸道病毒属-仙台病毒(鼠副流感病毒1型)-人类副流感病毒1型-人类副流感病毒3型-牛副流感病毒3型麻疹病毒属-麻疹病毒-犬瘟热病毒-牛瘟病毒-鲸(海豚)麻疹病毒-海豹瘟热病毒-pest-des-petits-反刍动物病毒-Hendra病毒(新鉴定的澳大利亚病原体)Rubulavirus属-腮腺炎病毒-猿猴病毒5(犬副流感病毒2型)-人类副流感病毒2型-人类副流感病毒4型-鸟类副流感病毒(包括新城疫病毒)-猪Rubulavirus-猿猴病毒41型-Mapuera病毒肺病毒亚科肺病毒属-人类呼吸道合胞病毒(亚型A及B)-牛呼吸道合胞病毒-绵羊及公山羊呼吸道合胞病毒-鼠肺炎病毒鸟类肺病毒属1-鸟类肺病毒(先前为火鸡鼻气管炎病毒)1准备分配一独立的属，尚未命名博纳病毒科及线状病毒科以单一的属表示。博纳病毒属仍然含有一个单一的种(博纳疾病病毒)。根据病毒核苷酸序列及抗原性差别及附着(G)蛋白的差异表达，在线状病毒属(典型种为马尔堡病毒)属中鉴别出四个种。棒状病毒科包括5个属水疱病毒属、狂犬病毒属、Ephemerovirus、Cytorhabdovirus及Nucleorhabdovirus，除了序列及抗原性差异，其还通过宿主范围、补加基因的存在及胞内增殖位点而被鉴别。副粘病毒科具有两个亚科；有三个属的副粘病毒亚科，所述三个属为呼吸道病毒属(HPIV 1为典型株)、麻疹病毒属(典型种为MeV)及Rubulavirus属(MuV为典型种)，及肺病毒亚科(人类RSV为典型种)及一个计划中的附加的种，其包括鸟类肺病毒。
在该目的所有成员中，其中有5-10个基因，且转录起始于一个单一的假定的3’末端启动子，其通过一病毒RNA依赖性的RNA聚合酶启动。除了一些肺病毒的例外情况以外，基因次序都是严格保守的。在Pringle，Arch Virol.142(11)2321-2326(1997)的图1中，对单负链病毒中代表不同科、亚科及属的16种病毒进行基因对比，其中所述基因在所述不同分类群中被划分且分组为具有同源性。这样，VSV展示了最低限度的5个基因；核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、附着蛋白(G)及聚合酶蛋白(L)。博纳病毒科中的博纳疾病病毒、线状病属科中的埃博拉病毒及棒状病毒科中的8个成员展示了基本的五基因模式(N-P-M-G-L)，在埃博拉病毒及八个棒状病毒中的四个病毒中，该模式通过在G及L之间插入一个或多个基因而增加，或者在剩余的四个棒状病毒中的三个中，通过在P及M之间插入一个或多个基因而增加。副粘病毒亚科中的副粘病毒展示的更为复杂，基本的5基因模式通过P基因中遗传信息的多重编码及在M及附着蛋白(H或者HN)之间插入附加的包膜蛋白基因F而增加，在某些Rubulaviruses中还通过SH而使得其提高。所有的副粘病毒都至少有两个表面糖蛋白HN(或H或G)及F。几乎所有的呼吸道病毒、Rubulavirus及麻疹病毒属成员都有一个富半胱苷酸蛋白V。呼吸道病毒及麻疹病毒还编码同源性C蛋白。肺病毒及Rubulaviruses亚群(猿猴病毒5(SV5)及腮腺炎病毒(MuV))都具有同源性表面糖蛋白SH。在肺病毒属中(包括牛、绵羊及公山羊RSV及鼠肺炎病毒----这儿还称为鼠RSV)几种附加蛋白，NS1、NS2、M2(ORF1)及M2(ORF2)都是保守性的。肺病毒亚科的副粘病毒展示出与基本模式的唯一的不同之处，最明显的是拥有附加的基因。在鸟类、人及鼠肺病毒中，M2基因在不同的阅读框中编码两个蛋白，两者都对在体外合成RNA产生明显的效果。在人类及鼠肺病毒中，两个编码未知功能的非结构性蛋白NS1及NS2的两个基因定位于3’前导区及N之间。鸟类肺病毒接近于基本模式，缺乏两个独特的3’末端NS基因并保留有标准的副粘病毒基因次序，除了有M2基因插入以外。该基因组结构的保守性模式提示通过基因间隔区的扩张及通过基因复制而不是从外部引入遗传信息来进行演变。Pringle，Semin.Virol.849-57，1997。
如上所述，本发明所述的方法是基于减毒突变在第一负链RNA病毒中的鉴别，该突变通过比较突变株及野生株的序列进行定位，以进行对标记突变位点的主题氨基酸位置的鉴别。优选的是，这些突变被引入非减毒或部分减毒的重组病毒克隆中，以证明事实上的主题改变产生了一个减毒表型。典型减毒突变的宿主在本文中也将被提供，其他一些减毒突变按照本说明书所述的已知的诱变及反求遗传学技术都是很容易鉴别的。在一个负链RNA病毒中每一个所鉴别的减毒突变提供了一个进行序列对比的指标，该对比是指在一个或多个异源负链病毒株中同源蛋白的序列比较。
为了实现本发明上述的几个方面，可以分析已有的序列对比，也可使用传统的序列对比方法以进行序列对比分析，以鉴别在减毒突变蛋白与另外的减毒的目标重组病毒的同源性蛋白之间的相应的蛋白区域及氨基酸位置。当一个或多个标记减毒突变的残基已在目标病毒蛋白的相应氨基酸位置从亲本例如野生型保守性特征(即，同一性的或表现为保守性相关氨基酸残基)进行了改变，靶病毒基因组或反基因组经过重组修饰以编码一个相同的或保守性的氨基酸的缺失、替换或插入，以改变靶病毒蛋白中的保守性残基并因此在重组病毒中产生一个同源减毒表型。
通过序列对比及分析以实现本发明的几个方面，其聚焦于同源性“对应”基因、基因片段、蛋白和/或蛋白结构域，其中多核苷酸或氨基酸参照序列被用作一个已定义的序列以提供一个统计性序列对比的基础。例如，该序列可以是一个已定义的cDNA或基因片段、一个全部的cDNA或基因序列或一个蛋白或其中一部分的序列。
一般来讲，一个参照序列，用于确定对应基因或者基因片段，其一般在长度上都有至少20个核苷酸，最为常见的是至少25个核苷酸，经常是在50个核苷酸的长度，而对于蛋白质和蛋白片段来说至少有20个氨基酸的长度。既然两个多核苷酸或氨基酸序列均可以(1)含有一个序列(也就是说，全部多核苷酸或蛋白序列的一部分)，其在两个多核苷酸或蛋白之间是相似的，且(2)可以进一步包括一个序列，其在两个(或更多)多核苷酸或蛋白序列之间是不同的，那么两个(或更多)的多核苷酸或蛋白序列之间的对比一般通过比较两个主题序列的“比较窗口”来实现，以鉴别和比较具有同一性或相似性的序列区域。本文作用的“比较窗口”，意指一个概念意义上的至少20个连续的核苷酸或者氨基酸位置的片段，其中一个序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参照序列相比较，在进行两个序列的最为理想的比对时，其中的多核苷酸或氨基酸序列的一部分在比较窗口中可以包括其与参照序列(其并不包括增加或缺失)相比较有20％或更低的比例的序列增加或缺失(即缺口)。
用于对比比较窗口的序列的理想比对可以通过Smith&WatermanAdv.Appl.Math.2482(1981)的区域同源性运算法则来进行操作，或者Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性对比运算法则来进行操作，或者通过Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性搜索方法来进行操作(所述文献均引入本文作为参考)，或者通过这些运算法则的计算机化实施(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA(在7.0版威斯康星遗传学软件包中，遗传学计算机集团，575 Science Dr.，Madison，WI)，其引入本文作为参考)来进行，或者经过检查来进行，然后选择通过不同的方法所产生的最好的比对(也就是说，使比较窗口的序列相似性百分比最高)。
这里所使用的词组“序列同一性”意指两个多核苷酸或者蛋白序列在比较窗口中是相同的(也就是说，基于核苷酸—核苷酸或残基—残基的比对)。“序列同一性百分比”通过以下步骤计算得出比较在比较窗口中两个最佳对比的序列，确定两个序列中相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或者I)或氨基酸残基的位置数目以得出匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(也就是窗口的大小)，结果乘以100就得出序列同一性百分比。
本文所使用的词组“基本同一性”表示两个多聚核苷酸或氨基酸序列在至少有20个，经常是至少25-50个核苷酸或氨基酸位置的比较窗口中具有至少85％，优选90-95％，有时在99％或者更高的序列同一性百分比的特征，其中序列同一性百分比可以通过在比较窗口之上比较参照序列与可以包含有缺失或增加其一共是参照序列的20％或更少的比较序列计算得出。参照序列可以是一个大序列的一部分。
当应用于蛋白及蛋白中的结构元件，词组“序列同一性”意指在相应位点具有一个或更多的相同氨基酸的序列。词组″序列相似性″意指两个序列在相应位点例如在保守性替换位点具有相同的一个或更多的保守性相关氨基酸。词组“基本序列同一性”意指两个肽序列，当进行最适对比时，例如使用程序GAP或BESTFIT并使用默认的缺口重量，至少有85％的序列同一性，优选是在90％的序列同一性，更好是在95％或者更高的序列同一性(例如有99％的序列同一性)。词组“基本相似性”意指两个多肽序列具有相应的序列相似性百分比。
保守性的序列关系甚至当氨基酸残基在两个序列的相应位点并不是同一性但是区别在一个保守性氨基酸的结构关系时存在。在本说明书中，保守性氨基酸替换指的是具有相似侧链的氨基酸残基通用互换性。例如，一组具有脂肪侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸及苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺及谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸及组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸替换组是缬氨酸—亮氨酸—异亮氨酸、苯丙氨酸—酪氨酸、赖氨酸—精氨酸、丙氨酸—缬氨酸及天冬酰胺—谷氨酰胺。二十个传统氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然的氨基酸例如α，α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他的非传统性氨基酸也可以是本发明多肽的适宜成分。非传统性的氨基酸的例子包括4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸及其他一些相似的氨基酸及亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。而且，氨基酸可以通过糖基化、磷酸化等进行修饰。
为了促进实施本发明上述各个方面，参考了一些已知的在单负链病毒目中的保守性病毒蛋白的分子发展史，在这一点，进行了更为广泛的研究，其详细评估了在更为精确的分子水平上的蛋白相关性。这些研究包括对于在单负链病毒中的保守性蛋白的序列的逐条比较，作出了更为广泛接受的这些蛋白的保守性结构域、序列元件及限制的分离残基的图谱。这些保守性蛋白结构域、序列元件及限制性残基的每一个通过提供从一个异源减毒突变病毒株中保守性转移减毒突变至一个不同的按照本发明所述方法进行重组的病毒中去的有益的目标而促进了本发明的实施。
例如，Poch等，J.Gen.Virol.51153-62，(1990)(引入本文作为参考)提供了一个详细的单负链病毒的5个L蛋白的推导的氨基酸序列的比较，其包括棒状病毒(V.SV及RaV)及副粘病毒(SeV，NDV及MeV)的L蛋白。常规的对比方法(引入本文作为参考)揭示了来自不同病毒科的L蛋白沿着其长度的绝大多数展示了一个很高程度的同源性——其在保守区域中有着始终不变的氨基酸，其为一些相对保守的区域所分离。这样，这些来自异源负链RNA病毒的不同L蛋白占据了一个连接功能区的保守性的结构。例如，L蛋白包括一个高度保守性的中心区域，其被认为含有RNA合成的活性位点。其他的保守性结构区、基序及序列元件，包括严格保守的分离的残基，同样也被鉴别，其中一些沿着保守性中心区进行分布且被认为对于聚合酶活性是至关重要的。在L蛋白中所鉴别的这些保守性的序列元件(参见，Poch等，J.Gen.Virol.51153-62，(1990)及Poch等EMBO J.8(12)3867-3874，(1989)，特别是图1，所述文献引入本文作为参考)，所提供的详细信息与其中减毒突变已产生且作图的异源亲本株L蛋白序列相比较。这样，使用这些及其他的测序列方法及数据，包括本文所引用的出版物中的测序列方法及数据，其可以很容易地测定是否一个标有减毒突变的残基从亲本株如野生株中已被改变，在目的病毒L蛋白的相应氨基酸位置是保守性的同一性(也就是说，同一性或者为保守性相关氨基酸残基所代表)其指出了在异源病毒中所鉴别的减毒突变成功发生在重组目标病毒的基因组或反基因组中去的极高的可能性。
关于在单负链病毒中不同L蛋白的同源体的结构保守性的进一步详细的描述为Stec等，Virology 183273-287(1991)(所述文献引入本文作为参考)所提供。这些序列分析是基于已公布的3个副粘病毒(来自呼吸道病毒属中的两个(PIV3及SeV)，Rubulavirus(NDV)病毒中的一个)、麻疹病毒属(MeV)病毒属的一个副粘病毒及两个来自棒状病毒(RaV和VSV)科的病毒(参见，例如Schubert等，1985；Shioda等，1986；Yusoff等，1987；Blumberg等，1988；Galinski等，1988；及Teart等，1988，所述文献均引入本文作为参考)的L基因及蛋白的序列且提供了针对RSV的另外的序列信息及比对。这些结果都证实了Poch等(同上)关于在副粘病毒及棒状病毒科中有重大意义的序列保守性的描述，此外其还鉴别出另外的保守性结构域、基序及序列元件。
简而言之，Stec等的发现赖于传统的对比方法，在其它相似的方法中其在本发明中是非常有用的。具体来讲，Stec等对比异源性负链RNA病毒序列，其中使用Wilbur及Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA80726-730(1983)等已接受的方法，使用缺失及12及6的缺口惩罚和在“蛋白序列及结构图谱”(M.O.Dayhoff编辑)，Vol.5，Suppl.3，pp.345-352 Natl.Biomed.Res.Found.，Silver Spring，MD(1978)中的Dayhoff等的相似性得分矩阵(所述文献均引入本文作为参考)。相似性得分系统被用于在RSV及其他一些列于表1的负链RNA病毒L蛋白之间构建配对的球形点矩阵对比。通过这些方法，明确的序列相关区域在RSV的L蛋白及并不甚相关的副粘病毒及棒状病毒的L蛋白之间被发现。正如图3所示那样，在RSV的L蛋白与其他一些L蛋白之间的序列相关区域是在同一直线上且集中在最接近氨基的区域，可能占据了分子的大约1/5。这些序列相似性的同一模式在其它一些副粘病毒及棒状病毒中的L蛋白中序列对比中也记载过(Blumberg等，1988，Galinski等，1988；Teart等，1988，所述文献均引入本文作为参考)，包括SeV、MeV、NDV、RaV及VSV L蛋白的五路对比，其由Poch等(1989，同上)完成。
在Stec等(同上)的七路对比方法中，RSV L蛋白被确定与其他负链RNA病毒相比较含有一个大约有70个氨基酸残基的氨基末端延伸及一个大约100个氨基酸残基的羧基末端平头。然而，这一变化并不影响对比方法鉴别保守性结构元件的可靠性且被认为可以归于这样的事实，RSV的L蛋白被L基因与其上游相邻部分，即M2基因(以前称为22K)(Collins等，1987，所述文献引入本文作为参考)的重叠部分所部分编码。
Stec等的发明(同上)证明了异源负链RNA病毒的L蛋白中一部分短片段的存在，这些片段几乎可以被确定在不同分类群之间是保守的。这些近于同一的片段在RSV的L蛋白中同样也显示出保守性，且其位于显示于图4(Stec等，所述文献引入本文作为参考，参见装入盒中的序列)的高度保守性区域。在这六个片段中氨基酸的同一性在七种蛋白中由30％至80％进行变化。所鉴别的片段中的大量残基在进行对比的七种不同的负链RNA病毒中是稳定不变的。此外，值得注意的是当替换在这些保守性片段中发生时，很多是保守性替换。正如先前所述那样，在两个病毒科的每一