专利名称：减毒沙门氏菌及其应用的制作方法动物性食品安全问题不仅关系到消费者的健康问题，也影响着社会公共卫生安全。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，沙门氏菌不但引起禽类感染，也会引起人的细菌性感染，进而导致食物中毒和急性肠胃炎等疾病。沙门氏菌在鸡、鸭、猪、牛、羊等各种动物肉类中都有存在，特别是鸡的沙门氏菌的携带率高达50%。据统计，在世界各国细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位，沙门氏菌已经变成了食品中毒的同义词。在 20世纪80年代早期到晚期，有五分之一的传染病是在家禽中产生，而一半以上零售的禽肉被沙门氏菌污染。据世界卫生组织报告，1985年以来，在世界范围内，由沙门氏菌引起的已确诊的人类患病人数显著增加，在一些欧洲国家已增加五倍以上。在美国，1983至1987年之间，有超过三分之一的人类沙门氏菌病的爆发与家禽肉和蛋有关。1985至1996年之间， 可归因于特定食品媒介所致的肠炎沙门氏菌病的爆发中，有79%的病例与鸡蛋有关。每年因食物源性沙门氏菌感染人所造成的损失高达35亿美元，单纯由肠炎沙门氏菌一个血清型所致的损失也有8. 7亿美元之多，尤其是2010年8月份美国召回沙门氏菌污染的3. 8亿枚鸡蛋，更凸显了沙门氏菌在食品安全方面的重要性。因此，研制安全有效的疫苗被认为是控制和减少禽沙门氏菌污染的最有效和安全的方法。与常规的灭活疫苗或亚单位疫苗相比，减毒活疫苗具有使用方便及免疫原性好等优点。在减毒活疫苗的研究方面，国外已经做了很多工作。最早的减毒沙门菌活疫苗是鸡伤寒沙门菌9R突变株，该株是野生型鸡伤寒沙门菌9R株的粗糙型突变体，该突变株可诱导成年鸡对鸡伤寒沙门菌野生型感染的保护性免疫反应，但具残余毒性，可致肝、脾损害， 并可在体内滞留数周、数月并经蛋进行传播。Barr00w等进一步将野生型9R株的毒力质粒消除，肌注免疫后可诱导对野生型菌株的口服攻击，但效果不如9R株。Cooper等对肠炎沙门菌aroA突变株对家禽的免疫效果进行了系统的试验研究，aroA突变株经口感染1日龄雏鸡后可在小肠定居，并可在盲肠繁殖，但不引起病症，同时诱导抗野生型的保护性免疫反应。Tan等以鼠伤寒沙门菌的aroA突变活疫苗免疫鸡，然后再以野生型鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌攻毒，发现疫苗株在粪便中存活不超过26d，但免疫后不能减少粪便中野生型鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌的排出量。Parker等以aroA鼠伤寒沙门菌疫苗接种鸡，然后以致病性肠炎沙门菌攻毒，免疫鸡与未免疫鸡相比，免疫鸡的卵巢、输卵管和盲肠内容物中的细菌数更少，但差异不显著。目前研制出的Megan Vac I疫苗是cya和crp基因突变的鼠伤寒沙门菌，家禽口服接种疫苗后，可以特异性地降低沙门菌感染，产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，显著降低野生型菌株在禽体内的重新定殖，而且还可以产生交叉保护。种鸡群接种Megan Vac I疫苗后，可产生持久的、具有保护性的母源抗体，大大降低了沙门菌污染鸡蛋的可能性。X3985是cya/crp基因缺失的菌株，这种突变株已被美国农业部做为抗鸡的沙门菌感染的疫苗。鼠伤寒的PurE株在家禽表现出良好的免疫效果，目前在德国较为广泛地使用。现有的这些疫苗株均能够在宿主体内定植，这仍对环境和食品安全造成一定的影响。因此，研制和开发一种在宿主体内定植时间短、免疫原性好的安全活疫苗是非常重要的。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一株在宿主体内定植时间短、免疫原性好的减毒沙门氏菌；本发明所要解决的另一个技术问题是将构建得到的减毒沙门氏菌作为疫苗株应用于预防禽沙门氏菌病。本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的本发明以禽白痢沙门氏菌为研究对象，应用基因敲除技术，删除掉沙门氏菌的体内定植基因和主要毒力基因，获得了减毒沙门氏菌(Salmonella pullorum) SM091-DED 株，其微生物保藏号是CGMCC NO. 4604 ；其分类命名是鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2011年2月23 曰。本发明通过试验发现，该沙门氏菌(Salmonella pullorum) SM091-DED株毒力显著降低，接种后在宿主体内定植时间短，为10天左右，远低于国外报道；同群感染试验表明无水平传播能力，达到或超过国外的同类产品水平；对同型和异型强毒力沙门氏菌提供完全的交叉保护作用，SPF雏鸡免疫后可有效清除强毒力菌株感染，而且不能够引起同群感染， 为预防禽沙门氏菌病，提供安全、免疫原性好、低毒力的禽沙门氏菌病的减毒活疫苗。将本发明减毒禽沙门氏菌(Salmonella pullorum) SM091-DED株经过LB培养基 37°C后，收集细菌，冻干后得到减毒禽沙门氏菌疫苗。此外，本发明所制备的疫苗不需要进行浓缩即可应用。而且，本发明制备疫苗可以使用发酵罐，经过程序的设定，可以完全达到自动化和规模化生产。安全性实验结果表明，本发明所制备的禽减毒沙门氏菌疫苗安全性好，接种后的各鸡只无不良反应。免疫保护试验结果表明，接种本发明禽减毒沙门氏菌疫苗后，可显著提高各免疫雏鸡体内的抗体含量，能有效保护各免疫雏鸡不受禽沙门氏菌的攻击，说明本发明禽沙门氏菌减毒疫苗具有良好的免疫保护效果。图1禽减毒沙门氏菌(Salmonella pullorum) SM091-DED株的生化试验观察结果； A 突变株；B 亲本株；C 对照管；1.葡萄糖；2.赖氨酸；3.鸟氨酸；4.氨对；5.硫化氢； 6.乳酸；7.卫矛醇；8.枸橼酸盐；9.甲基红；10. VP。图2禽减毒沙门氏菌(Salmonella pullorum) SM091-DED株的生长曲线观察结果； 每隔30min取样一次，进行0D600的测定，突变株与亲本株相比变化不大。图3融合PCR扩增产物的电泳鉴定；(A)，重组菌(SM091 Δ Cpxr: cat)的PCR鉴定(B)第一次同源重组菌(SM091 ACpxr: cat)的PCR鉴定；(C)第二次位点特异性重组菌 SM091 ACpxr 的鉴定；Al 阴性对照，A2 :PCR 产物；Bl 重组(SM091 Δ Cpxr cat)菌株；B2 野生菌株SM091 ；B3 阴性对照；Cl 野生型SM091, C2 重组菌株(SM091 Δ Cpxr cat)，C3 SM091 Δ Cpxr 突变株，M :DL2000。图4免疫后第2天细菌的分离情况亲本株的肝脏和脾脏都分离到菌，基因缺失株的肝脏、脾脏和盲肠也分离到菌。图5免疫后第4天细菌的分离情况亲本株的肝脏和脾脏都分离到菌，基因缺失株的只在脾脏分离到菌。图6免疫后第6天细菌的分离情况亲本株的脾脏分离到菌，基因缺失株的肝脏和脾脏分离到菌。图7免疫后第8天细菌的分离情况亲本株的脾脏分离到菌，基因缺失株也是脾脏也分离到菌。图8免疫后第10天细菌的分离情况亲本株的脾脏和盲肠分离到菌，基因缺失株已经分离不到菌。图9免疫后第12天细菌的分离情况亲本株的脾脏和盲肠分离到菌，基因缺失株没有分离到菌。


本发明公开了减毒沙门氏菌及其应用。本发明应用基因敲除技术，删除掉沙门氏菌(Salmonella pullorum)的体内定植基因和主要毒力基因，获得了双基因缺失的减毒沙门氏菌SM091-DED株，其微生物保藏号是CGMCC NO.4604。本发明减毒沙门氏菌毒力呈显著降低，接种后在宿主体内定植时间短；同群感染试验表明其无水平传播能力；对同型和异型强毒力沙门氏菌提供完全的交叉保护作用，SPF雏鸡免疫后可有效清除强毒力菌株感染，而且不引起同群感染，本发明为预防禽沙门氏菌病提供了安全、免疫原性好、低毒力的禽沙门氏菌病的减毒活疫苗。