专利名称：活的减毒的细小病毒的制作方法活的减毒的细小病毒 本发明涉及活的减毒的细小病毒，它们的用途，包含这种活的减毒的细小病毒的疫苗以及它们的生产方法。细小病毒属于单链DNA病毒科。在各种动物如猫、狗和猪中，细小病毒可引起疾病。因为病毒需要活跃分裂的细胞以便复制，感染的组织的类型随动物的年龄而变化。在任何年龄都可以影响胃肠道和淋巴系统，导致呕吐、腹泻和免疫抑制，但是在子宫内或在小于两周龄时被感染的猫中仅看到小脑发育不全，在3周和8周龄之间被感染的小狗中看到心肌疾病。犬细小病毒(CPV)是在小狗中尤其致命的疾病，约80%致死，在非常年幼的小狗中引起胃肠道损伤和脱水以及心脏综合症。它是通过与被感染的狗的粪便接触而传播的。症状包括嗜睡、严重腹泻、发烧、呕吐、食欲不振和脱水。猪细小病毒在猪中引起被称为SMEDI的生殖疾病，其代表为死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕。猫泛白细胞减少症，通常被 称为猫瘟热，是一种影响猫的病毒感染，由犬细小病毒的近亲猫细小病毒(FPV)引起。猫泛白细胞减少症在小猫中常见，并引起发烧、低白细胞数、腹泻和死亡。小于两周的猫胎儿和小猫的感染引起小脑发育不全。水貂肠炎病毒在对猫泛白细胞减少症的作用中是相似的，除了它不会引起小脑发育不全。不同的细小病毒在水貂和其它鼬科动物中引起阿留申病(Aleutian Disease)，其特征在于淋巴结病、脾肿大、肾小球性肾炎、贫血和死亡。细小病毒的最准确的诊断方法是通过ELISA。通常对猫、狗和猪进行针对细小病毒的免疫。在DNA水平上，已知犬、猫和猪细小病毒具有高度同源的基因组。犬细小病毒CPV2是一种在狗中引起急性、且有时是致命的肠炎的病毒(Kelly，Aust. Vet. J. 54 ；593,1978;Appel等，Vet. Rec. 105 ；156-159, 1979)。1977年左右首先出现的该病毒可能通过单个衣壳蛋白中少数突变而从在猫中非常密切相关的病毒(即猫泛白细胞减少症病毒(FPLV))产生的；物种跳跃可能涉及在其它食肉动物(如水貂或浣熊)的中间传递(Truyen等，Virology 215，186-189，1996)。早在1979年，出现了 CPV2的第一种变异体，被称为CPV2a，随后很快在1984年出现了 CPV2b (Parrish 等，Science 230，1046-1048, 1985，和 J. Virol. 65 ;6544_6552，1991)。最初的2型病毒现在已经从野外(field)消失，被2a和2b型所替代，尽管这两种类型的相对比例在国与国间有变化(前面的Truyen等；Chinchkar等，Arch. Virol. 151,1881-1887，2006 ;Pereira 等，Infect. Genet. Evol. 3，399-409，2007)。在衣壳蛋白(VP2)中的氨基酸变化，其特征为从2至2a以及至2b的转变，是非常有限的。在87 (Met至 Leu) >300 (Ala 至 Gly) >305 (Asp 至 Tyr)和 555 (Val 至 He)位的替换发生在 2 至 2a的进化中，在426 (Asn至Asp)和555 (lie至Val)的替换发生在从2a出现2b中(前面的Parrish 等；Truyen 等，J. Virol. 69，4702-4710, 1995)。最近，报道了在 555 位缺乏Val 至 Ile 替换的 2a株(Wang 等，Virus Genes 31, 171-174，2005 ;Martella 等，VirusGenes 33，11-13，2006)。似乎单一的氨基酸改变可以区分CPV2a和CPV2b VP2序列。新近，在意大利出现了病毒株，其中426位的氨基酸(2a中为Asn，2b中为Asp)已经变为谷氨酸(Glu)残基(Buonavoglia 等，J. Gen. Virol. 82，3021-3025，2001 ；Martella 等，J. Clin. Microbiol. 42，1333-1336，2004)。这些被称为 CPV2c 病毒的Glu 426变异体是在意大利和其他欧洲国家传播的(circulating)并与其它CPV类型共存(Decaro 等，J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472，2006),并且也已经在地理上多样的国家如越南和苏格兰分离得到(Nakamura等，ArchVirol. 149, 2261-2269，2004，Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)，这些事实表明它们在至少一定比例的狗群体中具有优势。犬细小病毒的相对快速进化已经导致猫宿主范围的丢失以及然后重新获得(前面的Truyen等，1996)，这种重新获得的在猫中复制的能力可以很好地解释2a、2b和2c变异体对最初的2型病毒的替代。在二十世纪七十年代末期和二十世纪八十年代早期，由于刺激交叉保护的共享抗原，活的和灭活的FPL疫苗用于保护狗免于CPV疾病，然而它们提供的保护水平较差，免疫持续时间较短。这些疫苗被活的减毒CPV疫苗所替代，其提供了良好的保护和更长的免疫持续时间。目前活的减毒疫苗来自CPV2b分离物或最初的2型病毒。 由于2型病毒已经在该野外中被2a、2b以及现在的2c病毒完全替代，已经考虑到对于减毒的 2 型疫苗提供的保护水平(Pratelli 等，Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615，2001 ；Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50，1999)。然而，基于现有的单克隆抗体的研究，与以前的变异体相比，每种新的抗原变异体已经失去至少一个中和表位(Strassheim等，Virology 198, 175-184，1994 ;前面的Pereira等)。以前已经表明，即使用针对各种抗原类型产生的血清在体外进行的交叉中和研究的确显示出显著差异(前面的Pratelli等)，活的减毒的CPV2疫苗能够保护狗免于2a 和 2b 野外攻击(Greenwood 等，Vet. Record. 136, 63-67，1995)。最近显示，活的减毒的2型疫苗(Nobivac-Intervet)能够保护狗免于用最近的CPV 变异体 CPV2C 的攻击(Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)。尽管如此，在疫苗领域中存在着诱导动物、尤其是猫、狗和猪中足够水平的免疫以免于感染和具有高度减毒行为的细小病毒的疫苗相组合的需求。高水平的减毒与安全性是同义的，尤其在年幼和年老的动物中。本发明的一个目的是提供减毒的同时仍然免疫原性的新的活细小病毒。这种病毒提供了用于安全的疫苗的基础。在这个方面，本发明的一个实施方案涉及活的减毒的细小病毒(PV)，其包括在衣壳蛋白的219位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和/或在衣壳蛋白的386位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨基酸(条件是，PV不是犬细小病毒疫苗Nobivac Parvo C中存在的CPV0在这种CPV(犬细小病毒疫苗Nobivac Parvo C的CPV)中包含的序列如SEQ ID NO: I中所示。令人惊讶地发现，在衣壳基因的219和386位氨基酸这两个位点，在病毒的减毒中起着重要作用。直到现在，假设衣壳区域之外的氨基酸主要参与病毒的毒力/减毒。在犬和猫细小病毒中，无论血清型，衣壳蛋白的219位氨基酸处的异亮氨酸和衣壳蛋白的386位氨基酸处的谷氨酰胺的位置是相同的。这意味着，本发明可以至少普遍地适用于猫细小病毒和犬细小病毒。本发明也可以应用于例如猪细小病毒，所述猪细小病毒具有衣壳蛋白的219位氨基酸处的异亮氨酸和衣壳蛋白的386位氨基酸处的谷氨酰胺。具体而言，从本发明排除要求保护的是，犬细小病毒疫苗Nobivac ParvoC(Intervet Schering-Plough Animal Health)中存在的 CPV,其包含如 SEQ ID NO: I 所不的序列。因此，本发明的第一个实施方案涉及活的减毒的细小病毒(PV)，其包括编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和/或在衣壳蛋白的386位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣壳基因，条件是，PV不包含SEQ ID N0:1所示的序列。仅仅是为了表示219位氨基酸处的异亮氨酸和386位氨基酸处的谷氨酰胺的位置，下面显示了在大多数CPV和FPV毒株中发现的序列背景的例子中这两个氨基酸(以粗体字符表示)。本发明涉及活的减毒的细小病毒，它们的用途，包含这种活的减毒的细小病毒的疫苗以及它们的生产方法。