专利名称：一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株及由其制备的疫苗和应用的制作方法沙门氏菌(Salmonella)是寄生于人和动物体内的一种革兰氏阴性杆菌。在人、家畜、家禽、野生动物、啮齿动物体内常分离到沙门氏菌，本属细菌也常存在于水、乳、肉、蛋中及其他食品和饲料中。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。某些沙门氏菌是重要的人畜共患病原，有些是动物疾病病原，有些是人和动物食物中毒或饲料中毒常见病原性细菌，因而本属细菌在食品卫生、外贸出口、人畜疾病发生中均十分重要。据统计在世界各国的各种细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。细胞免疫在抗沙门氏菌感染中具有重要作用。细胞免疫反应性与大剂量沙门氏菌攻击动物的保护性通常呈现很好的相关性。但体液抗体可加速病原菌的排出。动物接触环境中的沙门氏菌或在注射疫苗后，其体液免疫应答主要是IgM抗体。在疾病康复或口服弱毒苗感染的动物肠道中，可出现特异性分泌型IgA。动物在感染沙门氏菌病愈后，可获得坚强的免疫力，能抵抗再次感染。目前应用的兽用疫苗多限于预防各种家畜特有的沙门氏菌病，例如猪霍乱沙门氏菌(S. choleraesuis)、马流产沙门氏菌(S. abortusequi)以及牛、羊都柏林沙门氏菌(S. dublin)等灭活疫苗，在国内外均已应用，两次接种即可预防孕畜流产或幼畜感染。据报道，用减毒或无毒活菌注射或口服免疫动物，效果优于灭活菌苗。人类感染的沙门氏菌主要来源于畜禽，而沙门氏菌感染家畜后可引起一系列的临床疾病并成为肉制品污染的一个重要来源。因此，国内外动物检疫规程均把沙门氏菌列为重要的卫生检出指标之一。伤寒沙门氏菌(S.typhi)是一种常见、重要的人畜共患肠道病原菌，不仅能导致鸡白痢、家畜流产等动物性疾病发生，还能使人类发生伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒等疾病。1877年几乎同时由德国细菌学家Karl Joseph Eberth和RobertKoch从伤寒病人粪便中发现伤寒沙门氏菌，1884年德国细菌学家Georg T. A. Gaffky从病人脾脏中再次分离到该病原菌，并鉴定出其抗原结构式为9，12，[Vi]:d:-，为革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，具周身鞭毛，能运动，不形成芽孢。伤寒沙门氏菌能引起人和动物全身性、急性、发热性的感染，致病菌主要侵入网状内皮系统、肠道淋巴结及胆囊，并导致广泛的全身性临床症状，主要表现为持续性高热、腹痛及小肠结肠炎等症状。在成人和年长儿童常出现便秘，而幼龄儿童则常出现腹泻。虽然随着社会卫生条件的改善，可降低伤寒的发病率，但由于耐药菌株的不断增多，应用免疫预防手段仍然是控制本病的有效措施，因此伤寒疫苗的研究对预防伤寒病的发生具有更实际的意义。目前在全世界各地获准使用的伤寒沙门氏菌疫苗主要有热灭活-酚防腐全菌体疫苗或经丙酮灭活冻干全菌体疫苗，纯化Vi多糖疫苗，口服减毒Ty21a减毒活疫苗。由于灭活苗具容易引起全身及局部反应、只能激发体液免疫、不能提供交叉保护、需多次加强免疫等缺点，此类疫苗的应用受到限制。多糖结合疫苗生产工艺较难、成本高，在发展中国家推广仍有一定困难。随后，人们发现弱毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活疫苗或亚单位疫苗更为有效。于是,尽管传统的灭活疫苗和亚单位疫苗一直在沿用，但由于免疫效果不佳，免疫途径不方便而逐渐被弱毒活疫苗所取代。各种沙门氏菌弱毒苗在世界范围内得到了广泛应用，取得了良好的预防效果(Curtiss R，III，Doggett T,Nayak A,Srinivasan J. 1996. Strategies for the use of live recombinantavirulent bacterial vaccines for mucosal immunization,p. 499-511. In H. Kiyono andM. F. Kagnoff (ed. ), Essentials of mucosal immunology. Academic Press, San Diego,Calif ；Sirard J C,Niedergang F,Kraehenbuhl J P. 1999. Live attenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Tmmunol. Rev. 171 :5_26)。Ty21a 是由野生型 Ty2 经化学剂亚硝基胍处理而获得的株，该株毒力明显降低，可提供67 79%的免疫保护力，因此许多国家生产并应用该型减毒活疫苗，使伤寒病得到有效控制。但该弱毒疫 苗菌株由野生强毒株经过化学致弱方法制得，遗传背景不清，存在毒力返强的风险。因此，仍然需要开发遗传背景清楚、性状稳定、更符合生物安全性的新型伤寒沙门氏菌弱毒疫苗。随着现代分子生物学和DNA重组技术的发展以及许多其他毒力或毒力相关基因的不断发现，许多研究者仍在不断以改进某些毒力或毒力相关基因来制备新的弱毒活疫苗。使用基因工程手段致弱沙门氏菌从而筛选获得弱毒疫苗株已经成为国际上的研究热点。这主要是因为新型弱毒沙门氏菌疫苗不仅能用于沙门氏菌病的防制，而且能作为开发其它多种传染病疫苗的载体(Sirard J C, Niedergang F, Kraehenbuhl J P. 1999. Liveattenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Tmmunol. Rev. 171 5~26 ；Spreng S, Dietrich G. Weidinger G. . 2006. Rational design of Salmonella-basedvaccination strategies. Methods 38 :133-143)。与致病性密切相关的沙门氏菌毒力因子主要包括脂多糖、肠毒素、细胞毒素、侵袭力与毒力基因及毒力调节基因等。人们尝试通过各种基因工程手段缺失其中的某些毒力相关基因，致使沙门氏菌毒力降低，但仍保留其免疫原性，最终筛选获得沙门氏菌基因缺失弱毒疫苗株。研制中的减毒伤寒沙门氏菌口服疫苗主要有以下几种aroA (编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)和purA (编码嘌呤的生物合成)株541Ty、aroA和aroD株CVD906、cya (编码环化腺苷酸合成酶)和crp (编码cAMP受体蛋白)株X 3927、cya、crp和cdt (编码深部组织的繁殖)株x 4073、phoP/phoQ基因(编码转录激活因子/传感器激酶)株Ty800 (Hohmann E L，Oletta C A7MillerS I.1996.Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonellatyphi vaccine strain in human volunteers. Vaccine, 14(1) :19-24)等等。理想的弱毒活疫苗应具备下列条件(I)完全无毒力株的残余毒性一般不被接受。(2)对后代无害疫苗所诱导的保护性免疫应能传给下一代，而疫苗本身不应垂直传播。(3)不能回复防止回复的发生，降低毒力返强的风险。(4)高度免疫原性活疫苗应能够有效的刺激机体产生特异性免疫反应。(5)对环境不造成污染疫苗应在体内存留特定的时间，诱导免疫反应后被某种机制清除并不滞留于环境。(6)经济且方便使用诸如口服、滴鼻、肌肉注射等免疫方法比较简单、方便。沙门氏菌活疫苗可以侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主的体液和细胞免疫，并通过自然感染途径如口服或鼻内接种，激发系统和粘膜免疫反应(Curtiss R, III, Doggett T, Nayak A, Srinivasan J. 1996. Strategiesfor the use of live recombinant avirulent bacterial vaccines for mucosalimmunization,p. 499-511. In H. Kiyono and M. R Kagnoff (ed.)，Essentials of mucosalimmunology. Academic Press，San Diego, Calif ；Sirard J C，Niedergang F，KraehenbuhlJ P. 1999. Live attenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Immunol.Rev. 171 :5-26) 0这样，弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。已有的构建沙门氏菌基因缺失弱毒疫苗株的基因工程手段仍存在不少缺陷。例如，利用转座子介导的方法存在随机性，只适合于表型发生明显变化子的筛选，而不导致明显表型变化的菌株就不能够通过这些方法获得；传统的利用同源重组导致靶基因方法虽然精确，但获得的菌株最后往往含有抗性标记，由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。
本发明的一个目的在于提供一种免疫原性更好和安全性更强的伤寒沙门氏菌基 因缺失菌株。进一步地，本发明的第二个目的在于提供了一种利用伤寒沙门氏菌基因缺失菌株制备的伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗。更进一步地，本发明的第三个目的在于提供一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株在制备伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗中的应用。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种不含抗性标记的伤寒沙门氏菌(分类命名Salmonella typhi) crp基因缺失菌株AcrpST-I (简称AcrpST-l,下同)，于2011年11月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号=CCTCC NO M2011373。所述的不含抗性标记的伤寒沙门氏菌基因缺失了伤寒沙门氏菌的主要毒力调节基因crp，缺失后伤寒沙门氏菌株毒力显著减弱，但仍具有很好免疫原性。本发明的不含抗性标记伤寒沙门氏菌基因缺失菌株AcrpST-l，其基因工程菌株衍生于伤寒沙门氏菌ST-I (简称ST-1，下同)。其中，ST-I为分离自猪的野生型伤寒沙门氏菌强毒菌株，血清型为9，12，[Vi] :d:-，于2011年11月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO M2011372o所述的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株AcrpST-l，其主要毒力调节基因crp缺失了320bp的DNA片段，导致该细菌不能从哺乳动物中摄取cAMP，生长比较缓慢，且毒力大大降低，因而具有很高的安全性。但经动物试验证实，该基因缺失菌株具有很好的免疫保护力。本发明的基本构建方法是利用基因工程技术缺失了伤寒沙门氏菌野生型强毒株ST-I的毒力调节基因crp，从而构建成新的株AcrpST-l。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的基因缺失菌株AcrpST-I可用于制备针对伤寒沙门氏菌感染的弱毒活疫苗。本发明的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株具有很好的免疫保护性，且毒力较弱，对免疫猪无任何不良副作用，跟传统该类疫苗相比更安全。因此，用该亲本菌株构建的基因缺失菌株制成疫苗，具有广阔的市场应用前景。另外，本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株保留了针对伤寒沙门氏菌感染的免疫保护效力，而且遗传背景清晰，性状稳定，因而具有更好的生物安全性。本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。序列I是本发明构建伤寒沙门氏菌crp基因缺失株所用的上游同源臂的序列(1048bp)；序列2是本发明的来源菌株伤寒沙门氏菌野生菌ST-I中缺失的部分crp基因序列(32Ibp)；序列3是本发明构建伤寒沙门氏菌crp基因缺失株所用的下游同源臂的序列 (1743bp)；图I为本发明制备的转移质粒pREcrpl2的物理图谱；图2为本发明制备的转移质粒pREcrpl2构建的流程图；图3为本发明所使用的基因同源重组原理示意图；图4为本发明中不含抗性标记的伤寒沙门氏菌crp基因缺失菌株Λ crpST-1的PCR检测电泳图谱；图4A : Λ crpST-1 株 PCR 鉴定图(Pr5/Pr6)，图中 M 为 DNAmarker (DL 2，000) ； I 和2为筛选的Δ crpST-Ι株(599bp) ；3为H2O对照；4和5为亲本菌株ST-I对照(918bp)；图 4B : Λ crpST-1 株 PCR 鉴定图(Pr7/Pr6)，图中 M 为 DNAmarker (DL 2，000) ; I、2和3为筛选的Λ crpST-1株(1412bp) ；4为H2O对照；5为pRE112质粒对照；6和7为亲本菌株 ST-I 对照(1731bp)；图5为本发明中的不含抗性标记的伤寒沙门氏菌株AcrpST-I在加I %麦芽糖的麦康凯琼脂上的菌落形态；图5中的A和A’分别为亲本菌株ST-I和缺失菌株Λ crpST-1在LB培养基上的菌落形态和B’分别为亲本菌株ST-I (无色)和缺失菌株△ crpST-Ι (无色)在麦康凯琼脂上的菌落形态；C和C’分别为亲本菌株ST-I (红色)和缺失菌株Λ crpST-1 (无色)在含有I %麦芽糖的麦康凯琼脂上的菌落形态；图6 :是本发明中的伤寒沙门氏菌株Λ crpST-1的生长特性试验结果；图7 :是本发明中一种伤寒沙门氏菌株Λ crpST-1的遗传稳定性实验结果。注是引物Pr5/Pr6对缺失菌株Λ crpST-1遗传稳定性的PCR鉴定图，图中M =DNAmarker (DL 2，000) ；1为H2O对照;2 7为I、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的扩增结果O


本发明涉及一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株及由其制备的疫苗和应用，该菌株是伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)ΔcrpST-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NOM2011373。本发明的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株具有很好的免疫保护性，且毒力较弱，对免疫猪无任何不良副作用，跟传统该类疫苗相比更安全。因此，用该亲本菌株构建的基因缺失菌株制成疫苗，具有广阔的市场应用前景。另外，本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株保留了针对伤寒沙门氏菌感染的免疫保护效力，而且遗传背景清晰，性状稳定，因而具有更好的生物安全性。本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。