一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株、疫苗及应用制作方法

沙门氏菌 抗性 伤寒 标记

本发明涉及一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株，同时还涉及一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗及该菌株在制备疫苗中的应用，属于动物细菌基因工程

本发明的目的在于获得一种遗传背景清晰、免疫原性好、安全性强、无抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株；本发明的第二个目的是利用鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株制备鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗；本发明的第三个目的是鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株在制备鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗中的应用为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株一鼠伤寒沙门氏菌(分类命名-.Salmonellai_F/^itfri)SL13441，于2010年11月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCCNOM2010301本发明的基本构建方法是利用基因工程技术缺失了鼠伤寒沙门氏菌强毒株SL1344(简称SL1344，下同；南京农业大学惠赠)的一个毒力调节基因cja基因，从而构建成新的突变株SL1344AC7a，将该新菌株命名为SL13441通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的基因缺失菌株SL13441可用于制备针对鸡沙门氏菌感染的弱毒活疫苗，包括下列步骤(a)鼠伤寒沙门氏菌SL1344cja基因缺失菌株的构建首先从鼠伤寒沙门氏菌SL1344基因组中扩增出因上下臂片段(1364bp和llllbp)，并经中间载体pBluescriptIISK将其克隆至自杀性质粒PRE112上，从而构建含缺失1182bpcya基因的重组自杀性质粒pREAcja运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术原理筛选SL1344的Lcya缺失菌株；(b)鼠伤寒沙门氏菌Cja基因缺失菌株SL13441的生物学特性通过表型鉴定、遗传稳定性、生长特性研究其生物学特性；(c)鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗的制备；(d)鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗的毒力测定通过感染1日龄雏鸡计算其LD50，从而评价缺失菌株SL13441疫苗的毒力情况；(e)鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗对雏鸡体的免疫效力检测4日龄雏鸡口服接种约IO8CFU疫苗SL13441于免疫后第3d、5d、7d、14d、21d、28d、35d各组随机剖杀5只鸡，剖杀前无菌采血并检测实验鸡日增重及免疫器官指数，观察该疫苗对鸡正常生长发育的影响通过MTT以初步评价免疫雏鸡细胞免疫水平和ELISA方法测定免疫鸡体液免疫水平同时通过细菌分离试验检测缺失菌株SL13441疫苗在体内部分组织中的数量；(f)鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡的保护性试验4日龄雏鸡口服免疫组IO8CFU疫苗SL13441，免疫两周后，使用约IO8CFU鼠伤寒沙门氏菌强毒株SL1344和IO9CFU鸡白痢沙门氏菌C79-13对雏鸡口服攻毒，观察雏鸡对沙门氏菌攻击的抵抗力本发明的主要效果和优点(1)本发明的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株毒力明显降低，不反强，安全性好，能从根本上阻断鼠伤寒沙门氏菌的传播免疫鸡后不影响其正常生长发育，无任何不良副作用，并且可作为一种有效的微生态制剂寄生于雏鸡肠内，更好的协调肠道菌群，从而促进饲料的消化吸收，提高日增重因此，用该亲本菌株构建的基因缺失突变菌株制成疫苗，具有广阔的市场应用前景；(2)本发明鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株具有良好的免疫保护性，保留了针对鼠伤寒沙门氏菌感染的免疫保护效力，针对鸡白痢沙门氏菌的感染亦有一定保护效力因此，可产生显著的经济和社会效益；(3)本发明鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株不含抗性标记，遗传背景清晰，性状稳定，完全符合疫苗生物安全性要求；(4)使用简单，通过口服进行接种，因此大大减少接种时的人工成本图1是基因片段扩增相关引物设计位置，图中数字12547为编码cya基因序列位置；图2是本发明制备的转移质粒pREAcja的物理图谱；图3是本发明制备的转移质粒pREAcja构建的流程图4是本发明中不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌cja基因缺失菌株zlC7aSL1344的PCR检测电泳图谱；图4A基因缺失菌株zlc7aSL1344的PCR鉴定图(pc5/pc6)，图中M为DNAmarker(11Λ);1为H2O对照；2为筛选的基因缺失菌株zlcjaSL1344(156^p);3为亲本菌株SL1344对照Q702bp)；图4B基因缺失菌株zlc7aSL1344的PCR鉴定图(pc7/pc6)，图中M为DNAmarker(Ikb)；1为H2O对照；2为pRE112质粒对照；3为筛选的基因缺失菌株zlcTaSL1344(1620bp)；4为亲本菌株SL1344对照(2857bp)；图5基因缺失菌株tscyaSL1344与亲本菌株SL1344在含和不含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上的生长情况，图中A为亲本菌株SL1344在麦康凯琼脂培养基上的生长情况；B为基因缺失菌株ScyaSL1344在麦康凯琼脂培养基上的生长情况；C为亲本菌株SL1344在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上的生长情况；D为基因缺失菌株AcjaSL1344在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上的生长情况；图6是本发明中的不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株ZlcjaSL1344的生长特性实验结果；图7是本发明中一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株ZlcjaSL1344的遗传稳定性实验结果图中M=DNAMarker(Ikb)；1为H2O对照；2为SL1344对照；37为15、30、45、60和75代缺失菌株zlcTaSL1344模板的扩增结果；图8雏鸡免疫后各个时间点淋巴细胞刺激指数；图9雏鸡免疫后各个时间点血清IgG抗体含量具体实施例方式以下结合说明书附图对本发明作进一步说明实施例1鼠伤寒沙门氏菌SL1344cya基因缺失菌株SL13441的构建Iw7a相关引物设计参照http//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2株的cja基因序列(GenBankNoAE006468.1)设计备cya相关引物(见图1、表1)，用于鼠伤寒沙门氏菌亲本菌株SL1344(南京农业大学惠赠)和基因缺失菌株zlcTaSL1344的构建与鉴定各引物均由上海生工生物公司合成表IPCR引物2、鼠伤寒沙门氏菌SL1344C7a基因上下游片段C7aI(上臂)与^州2(下臂)的克隆将鼠伤寒沙门氏菌SL1344在LB固体培养基(IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOg氯化钠，12g琼脂粉，超纯水定容至1000mL，12rC高压灭菌20min)上“之”字形划线，37°C培养24h0挑取单菌落接种于LB液体培养基(IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOg氯化钠，超纯水定容至100011^，1211高压灭菌201^11)中，37°C、200r/min振摇培养16h按细菌基因组提取试剂盒(购自大连TaKaRa公司)说明书提取基因组作为PCR模板首先从鼠伤寒沙门氏菌强毒株SL1344基因组中分别扩增C7a基因上下游片段cyaI(上臂)和(下臂)，扩增片段大小分别为1364bp和llllbp，在上臂两端分别引入BamYiI和I酶切位点，下臂两端分别引入命I和炀οI酶切位点增反应25μL体系为模板DNA1μL，10XPCR缓冲液2.5μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL,2mmol/LdNTPs1μL,2U/μLTaqase0.5μL,ddH2018μL(PCR相关试剂均购自大连TaKaRa公司)，再加入20μL石蜡扩增循环参数为95°C预变性5min，95°C变性lmin，56°C退火90sec，72°C延伸2min，30个循环后，72°C延伸lOminPCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳分析将得到的目的基因克隆至PMD18-T载体(购自大连TaKaRa公司)，阳性克隆送大连TaKaRa公司进行外源基因序列的测定3、自杀性质粒pREAcja的构建用损aI和及拙HI分别双酶切pMD18-T-cTal和中间转移载体pBluescriptSK(+)(购自美国Mratagene公司)，回收纯化后用T4DNAIigase(购自大连TaKaRa公司)连接，16°C水浴12h，转化JM109感受态细胞(购自大连TaKaRa公司)，涂布于LB固体平板，37°C培养12h，转接LB液体培养基，37°C、200r/min振摇培养12h，使用小量质粒提取试剂盒(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)制备质粒，通过PCR和酶切鉴定质粒pSfcjal然后用ZAoI和命I分别双酶切质粒pMD18-T-CTa2与质粒pSKcjal回收纯化后连接，转化JM109感受态细菌，37°C培养12h，转接LB液体培养基，37°C、200r/min振摇培养12h，小量制备质粒，通过PCR和酶切鉴定含Cjwl和的中间转移质粒pSKAcja再用损aI和幻wI分别双酶切转移质粒pSKAcja和自杀性质粒PRE112(由美国华盛顿大学Dr.RoyCurtissIII教授惠赠)，回收纯化后连接，16°C水浴18h，转化大肠杆菌χ7213感受态细胞(由美国华盛顿大学Dr.RoyCurtissIII教授惠赠)，37°C培养18h，转接于LB液体培养基，37°C,200r/min振摇培养1后提取质粒，通过PCR和酶切鉴定质粒pREAcja，构建重组菌株χ7213(m/^cya)，pREAcja物理图谱见图2，构建流程如图3所示4、鼠伤寒沙门氏菌SL1344Cya基因缺失菌株SL13441的构建以χ7213(m^cya)为供体菌，SL1344为受体菌进行接合转移，两步法筛选缺失菌株供体菌和受体菌分别在相应LB液体培养基中37°C培养过夜，无菌磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl8.Og,KCl0.2g,Na2HPO4‘12H202.9g,KH2PO40.2g，超纯水定容至lOOOmL，121°C高压灭菌30min)洗两遍，调整菌浓度至0D_为0.8，各取100μL菌悬液混合将无菌硝酸纤维滤膜贴于固体LB平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37°C培养12h，同时做供体和受体对照用无菌PBS将滤膜菌液洗下，取100μL涂布含氯霉素(Cm，终浓度3(^g/mL)的固体LB平板，37°C培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5%蔗糖的LB平板，筛选Cm抗性(Cnf)接合子，提取基因组，用引物pc5/pc6扩增鉴定(见图4A)阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中37°C培养12h，连续10倍稀释，涂布含5%蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5%蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感(Cms)菌落提取基因组，再次用引物pc5/pc6扩增鉴定，缺失菌株zlC7aSL1344进一步用引物pc7/pc6鉴定(见图4B)，同时将扩增产物送大连TaKaRa公司进行序列测定PCR鉴定和测序结果表明，缺失菌株zlC7aSL1344构建成功，将此缺失菌株命名为SL13441实施例2鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441的生物学特性1、基因缺失菌株SL13441的表型鉴定根据沙门氏菌单因子血清(购自浙江宁波天润生物药业有限公司)说明书鉴定缺失菌株SL13441的血清型将基因缺失菌株SL13441(实验编号缺失菌株zlcTaSL1344)与亲本菌株SL1344划线接种含和不含1%麦芽糖的麦康凯琼脂平板，然后转接葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇等碳源及H2S等生化鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有限公司)研究其生化特性情况结果表明基因缺失菌株SL13441血清型与亲本菌株SL1344一致，仍为1，4，5，12il，2基因缺失菌株SL13441的生化特性与亲本株SL1344并不完全一致(见图5)与亲本菌株SL1344相比，基因缺失菌株SL13441的个别生化特性发生了明显改变(见表2)基因缺失菌株SL13441失去了利用果糖、木糖、甘露醇、山梨醇等的能力，但保留了利用葡萄糖的能力表2缺失菌株zlcTaSL1344与亲本菌株SL1344的生化特性比较MM菌株-GluAraGiyMaiSueLacFraXylSorManKhaH^SMRVP注=Glu-葡萄糖；Mal-麦芽糖；Ara-阿拉伯糖；Gly-丙三醇；Suc-蔗糖；Lac-乳糖；Fru-果糖；Xyl-木糖；Sor-山梨醇；Man-甘露醇；I^ha-鼠李糖；H2S用三糖铁生化鉴定管2、基因缺失菌株SL13441的生长特性检测基因缺失菌株SL13441(实验编号缺失菌株zlcTaSL1344)在LB固体培养基37°C培养12h，其菌落直径约为0.36mm，较亲本菌株SL1344(0.78mm)明显较小缺失菌株SL13441与亲本菌株SL1344在LB液体培养基中37°C培养过夜，无菌生理盐水连续10倍稀释，取100μL适当稀释度菌液均勻涂布于LB固体平板上，每个稀释度做3个重复，37°C培养过夜，计数，取平均值计算原液的CFU然后以终浓度约为106CFU/mL转接于相同液体培养基，37°C,200r/min培养，每Ih取样平板计数及测0D_值，绘制生长曲线结果显示，缺失菌株SL13441生长速度显著慢于亲本菌株SL1344(见图6)3、基因缺失菌株SL13441的遗传稳定性测定将基因缺失菌株SL13441(实验编号缺失菌株zlcTaSL1344)在固体LB平板上划线培养，挑取单菌落到LB固体培养基中，37°C培养36h，随机挑取单菌落转接到LB固体培养基中，连续传代75次利用基因引物pc6/pc7进行PCR检测，鉴定基因缺失菌株SL13441的Cja缺失基因的遗传稳定性从图7可以看出，基因缺失菌株SL13441的15、30、45、60和75代模板均能扩增出缺失型的1632bp的kya片段，亲本菌株SL1344扩增出野生型的2857bp的cja片段，表明本发明制备的基因缺失菌株SL13441能够稳定遗传缺失了1182bp的基因片段实施例3鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株SL13441疫苗的制备将基因缺失菌株SL13441(实验编号缺失菌株AcyaSL1344)在LB固体培养基上划线培养Mh，用无菌生理盐水刮洗下培养物，10000r/min离心5min，弃上清，再加适量的灭菌生理盐水悬浮菌液lOOOOr/min离心5min，洗涤12次再用灭菌生理盐水悬浮细菌后，连续10倍稀释以平板计数法测定活菌数，最终根据试验需要用灭菌生理盐水调整适当细菌浓度，得到试验用的备用疫苗实施例4鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株SL13441疫苗的毒力测定为测定基因缺失菌株SL13441(实验编号缺失菌株zlC7aSL1344)对雏鸡的毒力情况，将100只雏鸡(沙门氏菌检测均为阴性)平均分为2个大组，每大组分为5小组，另做空白和无菌生理盐水对照组(每组10只雏鸡)第1大组雏鸡口服感染基因缺失菌株SL13441，每小组每只分另Ij口服感染4.18XIO9CFU,8.34XIO8CFUU.67XIO8CFU,3.34XIO7CFU和6.68XIO6CFU；第2大组雏鸡口服感染亲本菌SL1!344，每小组每只分别口服感染1.23XIO7CFU,2.46XIO6CFU,4.93XIO5CFU,9.86XIO4CFU禾口1.97XIO4CFU0记录死亡情况，并按照ReedandMuench法(ReedLJ,MuenchH.1938.Asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints.AmJHygf27493—497)计算半数致死剂量(medianlethaldose,LD5tl)，以评价基因缺失菌株SL13441与亲本菌株SL1344相比毒力减弱程度结果表明，空白和无菌生理盐水对照组均无鸡只死亡，而浓度为1.97XIO4CFU亲本株SL1344就可使个别雏鸡发生死亡，最高浓度(1.23XIO7CFU)可使8只雏鸡死亡；而本发明的基因缺失菌株SL13441(实验编号缺失菌株zlcTaSL1344)口服感染的雏鸡，在最高剂量4.18XIO9CFU时有4只雏鸡死亡计算结果表明亲本株SL1344LD5tl为3.43XIO5CFU,基因缺失菌株SL13441口服攻毒LD5tl为5.73XIO9CFU,基因缺失菌株SL13441的毒力较亲本菌株SL1344约降低了16706倍(见表3)这表明本发明的基因缺失菌株SL13441与亲本菌株SLl344相比毒力明显降低表3本发明的基因缺失疫苗菌株与亲本株毒力比较试验权利要求1.一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株，其特征在于，该菌株是鼠伤寒沙门氏菌SLi;3441ja/MweWatyphimuriumSLΠ441，其保藏号为CCTCCNOM20103012.根据权利要求1所述的不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株，其特征在于，该菌株缺失了鼠伤寒沙门氏菌一个重要毒力调节基因C7a基因3.根据权利要求2所述的不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株，其特征在于，Cja基因缺失菌株的构建从鼠伤寒沙门氏菌亲本菌株基因组中扩增出哪基因上下臂片段，并经中间载体PBluescriptIISK将其克隆至自杀性质粒pRE112上，从而构建含缺失1182bpcja基因的重组自杀性质粒pREAcja；再运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术原理筛选鼠伤寒沙门氏菌SLi;3441-.SalmonellatyphimuriumSL1!M414.包含权利要求1或2所述的一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗5.权利要求1或2所述的不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株在制备鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗中的应用全文摘要本发明涉及一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株、疫苗及应用，属于动物细菌基因工程