专利名称：一种快速检测支原体的固体培养基及其制备方法解脲脲原体(UU)和人型支原体(MH)引起的泌尿生殖道感染占泌尿生殖道感染的 1/3以上，解脲脲原体和人型支原体的检测在临床上具有重要的意义。检测解脲脲原体和人型支原体的方法有特异性抗体检测法、PCR法、Southern Blot法和分离培养法等。免疫学检测方法容易出现交叉反应，PCR法容易出现假阴性和假阳性，而Southern Blot法对实验技术要求较高，不适合在医院内使用。临床上常用的检测方法是分离培养法。国内有关泌尿生殖道支原体培养的实际应用和研究显示，支原体的鉴定主要采用液体培养法。虽然液体培养法使用方便、快捷、容易判断，但是这种方法只能从液体颜色的改变来推断支原体是否存在，假阳性率高，准确性不高。而固体培养法则可以通过显微镜观察到人型支原体和解脲脲原体的菌落，从而确证支原体的存在，较好地解决临床标本假阳性率高的问题。但是固体培养法判读结果的时间较长，因而需要时间较长才能对UU和MH引起的泌尿道生殖道感染进行确诊，不利于疾病的诊断和治疗。
本发明的目的在于提供一种快速检测支原体的固体培养基及其制备方法。本发明所采用的技术方案是一种快速检测支原体的固体培养基，其配方如下3琼脂粉9g~12g蛋白胨18g~25gHEPES缓冲齐丨Jlg~3gL-半胱氨酸0.1g~0.5g精氨酸1.5g~2.5g脲1.5g~2.5g硫酸锰0.2g~0.5g葡萄糖lg~3g马血清150ml~300ml抗生素400,000IU-600,OOOIU酵母提取物2. 5g~7.5gRPMI1640细胞培养基 3g~5g蒸馏水300ml~600ml。优选地，上述培养基中的蛋白胨为大豆蛋白胨和酪蛋白胨。优选地，上述培养基中的抗生素为两性霉素B、多粘菌素B和青霉素钠的混合抗生ο优选地，上述培养基还添加有磷酸二氢钾。优选地，上述培养基中磷酸二氢钾的添加量为2g 6g/L蒸馏水。一种制备上述快速检测支原体的固体培养基的方法，包括以下步骤(1)将琼脂粉溶解于蒸馏水中，经高压灭菌后置于温水中，备用；(2)将特殊胨和葡萄糖加入水中，加热溶解后，冷却至室温，加入HEPES缓冲剂、 L-半胱氨酸、精氨酸、脲和RPMI1640细胞培养基，混勻，待溶解后，过滤杂质；(3)将上述溶液的PH值调至6. 0 士0. 2，过滤除菌，备用；(4)将马血清加入上述已除菌的溶液中，混勻，放入温水中复温；(5)将上述溶液与已灭菌的琼脂混合，加入硫酸锰和抗生素，摇勻，倾注于无菌平皿中，待其凝固。本发明的有益效果是使用本发明的固体培养基可选择性地培养解脲脲原体和人型支原体，通过菌落的形成确证支原体的存在，并能从菌落形态判断支原体的类型，因此，相对于液体培养基常出现假阳性的情况，本发明的固体培养基在诊断泌尿生殖道感染方面的准确性大大提高。使用本发明的固体培养基还可以通过菌落计数直接推断出标本中支原体的真实含量，从定量的角度准确判断出标本是处于带菌状态还是已经达到了致病浓度，而使用液体培养基只能定性地判断支原体的存在，因而本发明检测结果的准确性进一步得到提高。除此以外，在支原体菌落形成时间上，目前固体培养基的结果判读时间为M小时，而使用本发明的支原体培养基判读结果只需要18小时，大大缩短了检测时间，实现了解脲脲原体和人型支原体的快速检测，并且所形成的菌落比在市售培养基上形成的菌落要大得多，为医生制订合理的治疗方案提供了快速可靠的检验结果。

图1是解脲脲原体在本发明固体培养基培养上形成的菌落(放大400倍)；图2是人型支原体在本发明固体培养基上形成的菌落(放大400倍)；图3是解脲脲原体和人型支原体在本发明固体培养基上形成的菌落(放大400 倍)；图4是实施例5中解脲脲原体在市售培养基上形成的菌落(放大400倍)。

5琼脂粉9g~12g蛋白胨18g~25gHEPES缓冲齐丨Jlg~3gL-半胱氨酸0.1g~0.5g精氨酸1.5g~2.5g脲1.5g~2.5g硫酸锰0.2g~0.5g葡萄糖lg~3g马血清150ml~300ml抗生素400,OOOIU 600,OOOIU
酵母提取物 2.5g-7Jg RPMI1640细胞培养基 3g~5g
蒸馏水300ml~600ml优选地，该培养基中的蛋白胨为大豆蛋白胨和酪蛋白胨。优选地，该培养基中的抗生素为两性霉素B、多粘菌素B和青霉素钠的混合抗生
ο优选地，该培养基还添加有磷酸二氢钾。优选地，该培养基中磷酸二氢钾的添加量为2g 6g/L蒸馏水。国内常用的检测支原体的方法为液体培养，只能从液体颜色的改变来推断支原体存在与否，假阳性率高，准确性不高。本发明支原体固体培养基能选择性地培养解脲脲原体和人型支原体，用于诊断泌尿生殖道感染，准确性高。通过显微镜可以观察到固体培养基上解脲脲原体的棕黑色海胆状菌落(如图1所示)和人型支原体的煎蛋状菌落(如图2所示)，从而确证支原体的存在。另外，该培养基含有丰富的营养物质、混合抗生素和显色剂。 解脲脲原体会令培养基内的硫酸锰氧化，从而使其菌落颜色变成咖啡至黑色；而人型支原体则不会使硫酸锰氧化，因而其菌落不显色。通过菌落形态和颜色的不同(如图3所示)， 可以准确清晰地鉴别支原体类型。同时，通过菌落计数可以推断出标本中支原体的真实含量(CFU)，准确判断标本是带菌状态还是已达到了致病浓度。该培养基解决了临床标本假阳性率高的问题，也从以前的定性检测升级成为定量检测。同时，检测时间也大大缩短，一般来说，使用固体培养基的判读时间为M小时，而使用本发明的支原体培养基判读结果只需要18小时。因此，本发明的固体培养基具有快速检测和结果准确可靠的特点。
一种制备上述快速检测支原体的固体培养基的方法，包括以下步骤(1)将琼脂粉溶解于蒸馏水中，经高压灭菌后置于温水中，备用；(2)将蛋白胨和葡萄糖加入营养液中，加热溶解后，冷却至室温，加入HEPES缓冲剂、L-半胱氨酸、精氨酸、脲和RPMI1640细胞培养基，混勻，待溶解后，过滤杂质；(3)将上述溶液的PH值调至6. 0 士0. 2，过滤除菌，备用；(4)将马血清加入上述已除菌的溶液中，混勻，放入温水中复温；(5)将上述溶液与已灭菌的琼脂混合，加入硫酸锰和抗生素，摇勻，倾注于无菌平皿中，待其凝固。以下结合实施例进一步说明本发明实施例1一种快速检测支原体的固体培养基，其组分如下
琼脂粉IOg
蛋白胨(含大豆蛋白胨、酪蛋白胨)21g
磷酸二氢钾 2g
HEPES缓冲剂祁
L-半胱氨酸 0.2g
精氨酸祁
脲招
硫酸锰04g
葡萄糖祁
马血清200ml
混合抗生素(两性霉素B、多粘菌素B、青霉素钠) 500,000IU 酵母提取物 2.5g RPMI1640细胞培养基 4g 蒸馏水500ml。实施例2一种快速检测支原体的固体培养基，其组分如下琼脂粉9g
蛋白胨(含大豆蛋白胨、酪蛋白胨)18g
HEPES缓冲剂 Ig
L-半胱氨酸 O.lg
精氨酸1.5g
脲1.5g
硫酸锰0.2g
葡萄糖Ig
马血清150ml
混合抗生素(两性霉素B、多粘菌素B、青霉素钠) 400,000IU 酵母提取物 2.5g RPMI1640细胞培养基 3g
蒸馏水300ml。实施例3一种快速检测支原体的固体培养基，其组分如下
琼脂粉1
蛋白胨(含大豆蛋白胨、酪蛋白胨)25g
磷酸二氢钾 2.5g HEPES缓冲剂相L-半胱氨酸 0.5g 精氨酸2.5g
脲
硫酸锰0.
葡萄糖相
马血清300ml
混合抗生素(两性霉素B、多粘菌素B、青霉素钠) 600,000IU 酵母提取物 7. RPMI1640细胞培养基 5g
蒸馏水600ml。实施例4一种制备实施例1的固体培养基的方法，包括以下步骤(1)将琼脂粉溶解于蒸馏水中，经高压蒸汽121°C灭菌15min，降温后保持在50°C 的温水中，备用；(2)将蛋白胨、葡萄糖和磷酸二氢钾加入水中，加热溶解后，冷却至室温，加入 HEPES缓冲剂、L-半胱氨酸、精氨酸、脲和RPMI1640细胞培养基，混勻，待溶解后，用滤纸过滤杂质；(3)将上述溶液的PH值调至6. 0，经0. 22 μ m过滤除菌，备用；(4)在无菌操作条件下将血清加入上述已除菌的溶液中，混勻，放入50°C的温水中复温；(5)待溶液复温至50°C后，将所述溶液与已灭菌的琼脂在无菌条件下混合在一起，加入硫酸锰和混合抗生素，摇勻，倾注于无菌平皿中，待其凝固；(6)凝固后放置4°C冷藏保存备用。实施例5将相同浓度的阳性标本接种在实施例4中制得的固体培养基和市售培养基上进行培养和观察，结果如下表所示


本发明公开了一种快速检测支原体的固体培养基及其制备方法。使用本发明的固体培养基能够准确地检测解脲脲原体和人型支原体的存在，并通过菌落计数定量推断支原体的含量，大大提高了准确度和可靠性。同时，使用本发明的培养基检测支原体仅需18h即可判读结果，实现了支原体检测的快速化，对解脲脲原体和人型支原体引起的泌尿生殖道感染进行最终确诊。