专利名称：快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法背景技木葡萄(Vitis vinifera L.)，葡萄属(Vitis)落叶藤本植物，几乎占全世界水果产量的四分之一，其营养价值很高，可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒。近年来，“法国悖论”的科学发现引起人们对葡萄中生物活性物质的广泛关注。研究表明，葡萄中富含白藜芦醇、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸等酚类和类酚类生物活性物质，具有 重要药理功能和生物活性，具有良好的保健作用，尤其是白藜芦醇具有抗癌的活性而受到市场的青睐。随着市场需求的不断扩大，原有的从葡萄或其他替代植物中来源的生物活性物质已不能满足需要。植物细胞培养是生物技术领域里的ー个重要分支，因其具有生长速度快、周期短、不受季节影响、产物均一可控、药效成分高于天然植物等优点，采用大規模植物细胞培养是解决药用植物资源匮乏及药效成分低的药用植物满足需求的重要途径。近年来，植物细胞培养进行有效成分的生产已经取得了令人瞩目的成就，而葡萄细胞培养生产次生代谢产物(如白藜芦醇)的研究还处在实验室的研究阶段，进入中试和大規模培养还亟待解决如细胞株的筛选、细胞系的长期继代保持、悬浮细胞系的建立和诱导子调控效率等诸多问题。为了解决这些问题，目前最关键的技术是建立快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法，但目前葡萄自然来源的外植体由于容易受到污染率和消毒剂的影响，存在愈伤组织诱导效率低，形成愈伤组织质量差，不能长期继代保持等问题，导致葡萄细胞培养生产次生代谢产物的研究进行缓慢。直至目前，以葡萄叶片、叶柄、茎段等为外植体进行愈伤组织诱导取得了一定的进展，但以无菌株系小苗茎段和叶片诱导愈伤组织，并进行继代增殖以获得松散型愈伤组织、及对该松散型愈伤组织长期继代保持的方法还鲜有报道。
0.2mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 琼脂粉 6g/L。 进ー步地，步骤(3)中所述继代增殖培养基为MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。进ー步地，揭露了上述所获得的葡萄松散型愈伤组织长期继代保持的方法，其操作如下取上述步骤(3)所获得的葡萄松散型愈伤组织，并接于第一种培养基中继代保持至少2代后，转接到第二种培养基中继代保持I代，如此反复交替继代培养，即可长期继代保持葡萄松散型愈伤组织，且继代保持时的该第一种培养基、第二种培养基均置于培养室中进行；其中，所述第一种培养基为MS+2，4-D I. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L ;所述第ニ种培养基为MS+2，4-D I. Omg/L+KT 0. 5mg/L+AgN03 5. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6g/L ；所述培养室中的条件为温度设置23 25°C，光照强度150(T20001x，每天光照12h。本发明快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法的有益效果在干通过本发明所揭露的方法不仅能够快速获得大量松散型葡萄愈伤组织，且过程中所获得的葡萄愈伤组织具有高诱导效率及高质量的优点，同时可长期继代保持获得的葡萄松散型愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为葡萄细胞培养生产次生代谢产物和生物技术等研究奠定了良好的基础。0.5cmX0. 5cm见方大小的叶片作为外植体，接着将该外植体接种至诱导愈伤组织的培养基中，并将该培养基置于培养室中培养，7天后可见愈伤组织形成，25 30天后长成初代愈伤组织；4.制备葡萄松散型愈伤组织将步骤3培养得到的初代愈伤组织转接到继代増殖培养基中，并将该继代增殖培养基置于培养室中进行继代増殖培养，以获得葡萄松散型愈伤组织。ニ、葡萄愈伤组织诱导中各影响因素的筛选I.不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响取制备葡萄松散型愈伤组织过程中所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0. 5cm茎段与0. 5cmX0. 5cm见方大小的叶片并分别接种到下表I中的Gl培养基(即MS+BA2. Omg/L+NAAO. 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L)中，且在光照下培养，接种7d后，茎段、及叶片切ロ处均可观察到愈伤组织形成，以后愈伤组织块会不断膨大，25 30d后长成初代愈伤组织。从产生愈伤组织的能力上看，茎段或叶片的差别不大，但 从愈伤组织的长势上，初代培养时，茎段产生的愈伤组织长势较强；而叶片产生的愈伤组织，长势比较弱，要及时继代，否则会变褐死亡。因此，取0. 5cm茎段作为启动培养的外植体为佳。2.不同培养条件对愈伤组织诱导的影响将野生葡萄茎段接种在下表I中的Gl培养基中，比较光照和黑暗对野生葡萄茎段愈伤组织诱导的影响。结果发现，在光照条件下愈伤组织诱导率为100%，产生4种类型的愈伤组织，GCl类型是淡黄色、浅黄緑色或无色的松散状愈伤组织，GC2是绿色或淡黄緑色硬块状的愈伤组织，GC3类型是GCl和GC2的混合类型，GC4型愈伤组织呈无色粉状或水溃状；在黑暗中培养诱导产生的愈伤组织，为无色或浅褐色水溃状或粉状，这种愈伤组织继代后会褐变死亡，也定为GC4型愈伤组织。以上试验分析表明，野生葡萄愈伤组织的诱导适合在光照的条件下进行，虽然产生了 4种类型愈伤组织，但在后期的筛选中，可以得到松散的、生长状态良好的愈伤组织；而黑暗条件不利于野生葡萄愈伤组织的诱导。由于GC1、GC2、GC3类型的愈伤组织可以继代増殖，为有效愈伤组织；而GC4类型愈伤组织不能继代保持，为无效愈伤组织。因此，为了获得松散型愈伤组织，需在光照条件下进行愈伤组织诱导。3.启动培养中附加成份的不同对愈伤组织诱导的影响取制备葡萄松散型愈伤组织过程中所获得的葡萄无菌株系的小苗，切取0. 5cm茎段井分别接种到已灭菌且编号分别为G1、G2、G3、G4、G5及G6的6个培养基中，这6个培养基中均包含基本培养基及附加成份，该基本培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L、且pH值为5. 8 6. 0,各培养基中的附加成份及其含量如表I所不；之后将各培养基置于培养室中诱导愈伤组织，30天后比较不同附加成份对愈伤组织诱导的影响，结果见表2。表I各培养基中的附加成份及其含量本发明提供快速获得葡萄松散型愈伤组织及其长期继代保持的方法，依次通过制备葡萄无菌株系、启动培养、制备葡萄松散型愈伤组织来获得葡萄松散型愈伤组织，并将获得的葡萄松散型愈伤组织接于第一种培养基中继代保持至少2代后，转接到第二种培养基中继代保持1代，反复交替即可长期继代保持葡萄松散型愈伤组织，且继代保持时的该第一种培养基、第二种培养基均置于培养室中进行。本发明的优点在于所获得的葡萄愈伤组织具有高诱导效率及高质量的特点，同时可长期继代保持获得的葡萄松散型愈伤组织，从而为葡萄细胞培养生产次生代谢产物和生物技术等研究奠定了良好的基础。