专利名称：一种建立大鼠葡萄膜炎模型的方法葡萄膜炎(EIU)是一种常见的眼部炎症，易反复发作且牵涉到眼内多种组织，其具体发病机制目前尚不清楚，因此有必要建立合适的动物模型以进行研究。已有研究表明， 内毒素注射可以诱导动物的实验性葡萄膜炎。内毒素诱导的葡萄膜炎动物模型已成为人们研究葡萄膜炎重要的动物模型，它对人们了解葡萄膜炎的发病机制及治疗葡萄膜炎做出了重要贡献。细菌内毒素(endotoxin)首先由Broivin等于1933年用三氯醋酸自鼠伤寒杆菌中提出。当时因一般蛋白质反应呈阴性，故称为“脂多糖”(Lipopolysaccharide，LPS)抗原，后人称为Borirn型抗原。细菌内毒素主要由革兰氏阴性菌产生，存在于细菌细胞内，为细胞壁结构成份，细菌细胞崩解时才释放出来。化学成分主要为磷脂-多糖-蛋白质复合物。我们曾对6种革兰氏阴性菌内毒素诱导大鼠葡萄膜炎模型，结果只有霍乱弧菌内毒素诱导成功率高，并且以18001株，古典生物型，小川血清型的霍乱弧菌内毒素诱导大鼠葡萄膜炎的方法报道的比较多。其中《眼科新进展》2002年12月第22卷第6期，本发明的发明人卢弘发表的“霍乱弧菌内毒素诱导大鼠葡萄膜炎的组织切片研究”中报道了霍乱弧菌内毒素诱导的葡萄膜炎模型，该发明中采用LPS与PBS和完全福氏佐剂(或称弗氏佐剂)、LPS与PBS和百日咳两种配方作为诱导剂，其中LPS与PBS和完全福氏佐剂用于足垫部的注射，每只0. 4ml ；LPS 与PBS和百日咳用于腹腔注射，每只0. 15ml。免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能促进、延长或增强对抗原特异性免疫应答的物质。弗氏佐剂(Freimd’ sadjuvant, FA)是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂(FIA)和完全弗氏佐剂(FCA)。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成， 组分比为1-5 1，可根据需要而定，通常为2 1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为 2-20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂。FCA是标准的诱生体液免疫和细胞免疫的佐剂，它诱导I型辅助T细胞(T helpercell ；Thl型)细胞因子，而FIA则是典型的只诱导Th2型细胞因子诱生抗体的佐剂。免疫佐剂作用机理免疫系统受到抗原物质刺激后，抗原可被抗原提呈细胞如巨噬细胞、树突状细胞摄取，加工处理，降解为多肽片断，通过主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex ;MHC)或MHC类分子途径提呈给T淋巴细胞。T淋巴细胞被激活、复制、增殖、分化，成为效应T淋巴细胞，主要包括CTL和⑶4+Th细胞。前者分泌细胞毒素及诱导细胞凋亡以杀死带抗原的靶细胞；后者受细胞因子、抗原特性等因素的影响，向 Thl细胞或Th2细胞分化。Thl细胞偏向分泌白介素-2 (IL-2)、干扰素-γ (IFN-γ)，与介导迟发型超敏反应的TDTH细胞和CTL细胞的增殖、分化、成熟有关，可促进细胞介导的免疫应答，也可辅助特异性IgGh亚类抗体的产生，即Thl应答。Th2细胞偏向分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10与B细胞增殖、成熟和促进IgGl亚类和IgE抗体生成有关，可增强抗体介导的免疫应答，即Th2应答[本实验中百日咳杆菌的作用是第二佐剂。在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)模型中必须加用第二佐剂才能诱导出炎症。用弗氏完全佐剂和百日咳杆菌作为LPS的佐剂诱导葡萄膜炎进行葡萄膜炎发病机制的研究有许多混杂因素。为了克服现有模型的缺点，使得该模型更符合伦理学要求，发明人提到了进行了大量的试验，最终确定本发明。
本发明的目的是提供一种霍乱弧菌内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎模型的建立方法。本发明提供的一种建立大鼠葡萄膜炎模型的方法，包括以下步骤1)大鼠选用6-8周龄，180-200g, SPF级封闭群雄性Wistar大鼠；2)腹腔注射150_400μ g霍乱弧菌内毒素，诱导的模型即为大鼠葡萄膜炎模型。本发明提供的霍乱弧菌内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎模型具有以下优势1、该模型临床及组织学特征稳定，重复性好，诱导成功率高可以达到100% ；2、本发明提供的模型为进一步研究EIU发病机制提供了重要工具；3、避免因以往弗氏佐剂造成对研究中的干扰现象；4、WiStar大鼠国内购买资源方便，便捷、符合标准；目前国内实验用大鼠大部分为SPF级(即无特定病原体动物)，此级别可以满足绝大部分实验用途；鉴于急性前葡萄膜炎的临床特点，幼年鼠或老龄鼠有可能对模型有影响，因此选择成年大鼠诱导模型。另外成年鼠各系统已发育成熟，诱导葡萄膜炎模型较稳定，6-8周龄的Wistar大鼠为成年大鼠，此周龄的大鼠体重大约在180-200g ；5、本研究表明单独使用霍乱弧菌内毒素(18001株，古典生物型，小川血清型)腹腔注射成功地诱导出的模型与临床可见的急性前葡萄膜炎相类似，发病迅速，眼前节受累为主，为临床研究、预防和治疗提供了重要的参考模型；6、腹腔注射较以往常规的足底注射更符合伦理学、及SCI杂志对动物实验的要求。图1 内毒素诱导的葡萄膜炎的临床表现注射LPS后M小时，箭头显示瞳孔区渗出膜；图2 注射LPS后M小时组织学改变(HE 200X)。后房内大量炎性细胞渗出(箭头)。Lens 晶状体；i 虹膜；cor 角膜；cb 睫状体；图3 注射LPS后M小时组织学改变(HE 200X)。前房内大量炎性细胞浸润。 Lens 晶状体；cor 角膜；图4 注射LPS后M小时组织学改变(HE 400X)。前房内大量炎性细胞渗出(箭头)° ac 前房；cor 角膜；图5 内毒素诱导的葡萄膜炎前房血性渗出，瞳孔区白色渗出；图6 急性前葡萄膜炎前房积脓；图7 前房、后房的炎性细胞浸润；图8 不同方法诱导的前葡萄膜炎临床分级评分其中1为100μ g组配方1腹腔注射0. Iml ；2为150 μ g组配方1腹腔注射0. 15ml ；3为300 μ g组配方1腹腔注射 0. 3ml ；4为400 μ g组配方1腹腔注射0.;5为500 μ g组配方1腹腔注射0. 5ml ；6为 LPS+完全佛氏佐剂组配方2腹腔注射0. 2ml ;7为LPS+完全佛氏佐剂+百日咳杆菌组腹腔注射配方10. 12ml，配方3腹腔注射0. 15ml ；8为正常对照组腹腔灭菌生理盐水0. 2mL·
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1、实验药物180-20(^，6-8周龄5 级封闭群雄性衍计￡11~大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司中心提供。2、实验材料霍乱弧菌内毒素(LPQ和百日咳杆菌溶液购自兰州生物制品研究所；完全弗氏佐剂(FCA)购自Sigma, St. Louis, MO。3、实验分组将LPS溶于灭菌生理盐水中，分别配制成以下几种配方配方1 lmg/ml LPS 溶液 2ml ；配方2 :2mg/ml LPS溶液^il+完全佛氏佐剂2ml ；配方3 0. 5mg/ml LPS溶液Iml+百日咳杆菌溶液12 μ 1。按照分组分别对各组大鼠给予以下处理1) LPS组配方1腹腔注射0. 2ml ；2) LPS+完全佛氏佐剂组配方2腹腔注射0. 2ml ；3) LPS+完全佛氏佐剂+百日咳杆菌组腹腔注射配方10. 12ml，配方3腹腔注射 0. 15ml ； 4)正常对照组腹腔灭菌生理盐水0. 2ml。4、实验方法按照分组的要求注射相关药物。5、监测指标5. 1临床观察免疫大鼠后每隔2小时进行裂隙灯显微镜检查，详细记录发病眼数、发病时间、高峰时间、疾病严重程度和疾病持续时间，并根据Lajavardi L的标准对大鼠临床表现进行临床评价与记分，其中0 =无炎症；1 =轻度虹膜和结膜血管扩张；2 =中度虹膜和结膜充血及中度前房闪辉；3 =重度虹膜充血并前房闪辉；4 =除严重虹膜充血前房闪辉外出现瞳孔区纤维素渗出。5. 2组织学检查LPS免疫大鼠后M小时过量戊巴比妥钠(100mg/kg)处死大鼠，摘取眼球放置于福尔马林溶液中固定M小时，固定后组织浸入50%乙醇溶液中1小时，洗去固定液，依次浸入 75%、80%、90%、100%乙醇溶液中各脱水1小时，二甲苯处理30分钟，浸蜡1小时X 3，包埋，切成4 μ m厚切片，苏木素-伊红染色，光镜下观察。6、结果6. 1临床观察除正常对照组外，其余3组注射LPS后大鼠眼部均出现一系列临床可见的炎症反应，其症状与急性前葡萄膜炎的临床表现一致。LPS注射后4小时开始出现结膜水肿，睫状充血，虹膜血管迂曲扩张。6-8小时虹膜血管扩张更明显，12-16小时出现前房闪辉与细胞，瞳孔缩小，虹膜纹理模糊。随着时间推移，这些临床表现逐渐加重，22- 小时所有LPS免疫大鼠均达到炎症反应的高峰，表现为瞳孔显著缩小，瞳孔缘处出现纤维素样渗出，甚至瞳孔膜闭，晶体前囊有灰白色絮状沉着物 (见图1)。然后炎症开始逐渐减轻，第48小时前房纤维素样渗出部分吸收，但仍有前房闪辉。临床评分结果见表1 表1 :LPS免疫大鼠后不同时间点的临床评分


本发明涉及一种建立大鼠葡萄膜炎模型的方法，包括以下步骤1)大鼠选用6-8周龄，180-200g，SPF级封闭群雄性Wistar大鼠；2)腹腔注射150-400μg霍乱弧菌内毒素，诱导的模型即为大鼠葡萄膜炎模型。该方法建立的动物模型临床及组织学特征稳定，重复性好，诱导成功率高，且采用腹腔注射较以往常规的足底注射更符合伦理学及SCI杂志对动物实验的要求。