专利名称：大鼠急性或持续性高尿酸血症模型的复制方法 痛风是嘌呤代谢紊乱或(和)尿酸排泄减少所引起的一组异质性疾病。临床上以高尿酸血症为主要特征，高尿酸血症是痛风的生化基础，而痛风必然伴有高尿酸血症。从本质上说，高尿酸血症与痛风之间并无严格界限。近年来研究痛风的发病机制及其药物治疗成为医学界的热点之一，目前国内外尚缺乏有关痛风的成熟动物模型，而构建高尿酸血症动物疾病模型则是痛风研究的前提。现存模型中还有很多不完善的地方，从而给痛风的研究带来了极大的不便。下面对一些有代表性的大鼠高尿酸血症动物模型做简要介绍。1.Wistar大鼠，雄性，体重(200±10)g，腺嘌呤100mg·kg-1+乙胺丁醇250mg·kg-1灌胃给药，每日1次，连续7～21天，大鼠血清尿酸明显升高。(熊湘明，曲秋竹.大鼠高尿酸血症模型建立.天津中医学院学报，2001；20(4)28～29)2.SD大鼠或Wistar大鼠，雌雄各半，110～150g，以腺嘌呤300mg·kg-1灌胃，连续21天，大鼠血尿酸明显升高并出现慢性肾功能衰竭。(周小舟，张盛光，杨晓等.腺嘌呤所致大鼠慢性肾功能衰竭的机理研究.基础医学与临床，1997；17(1)54～57)3.SD大鼠，体重(200±20)g，将酵母干粉、腺嘌呤均匀拌入粉碎的大鼠颗粒饲料中，含量分别为10％和01％，重新压粒成型。给予大鼠高嘌呤饲料，酵母、腺嘌呤的进食量分别为10g·kg-1、100mg·kg-1。第七天大鼠血清尿酸略有升高，第十二天、第十九天大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮含量明显升高，停用高嘌呤饲料后仍继续上升，第二十四天时才开始回落，第五十二天时，与对照组相比仍有显著性差异。(奚九一，赵兆琳，鲁培基等.高尿酸血症肾病的实验动物模型研究.上海中医药杂志，2001；(10)10～12) 4.SD大鼠，150～180g，将酵母、腺嘌呤、沙丁鱼与少量市售粉饲料搅拌均匀后喂大鼠，造模第21天后大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮都升高。(何力群，聂永红，邹士林.新型尿酸性肾病动物模型的建立.上海实验动物科学，2001；21(1)22～25)5.SD大鼠或Wistar大鼠，雄性，体重250±10g，腺嘌呤2、4g·kg-1灌胃给药，第三天大鼠血尿酸水平开始升高，第七天明显升高，第十天降低，同时出现肾功能损害。(张超，曹克光，杨崇青等.高尿酸血症及尿酸性肾病动物模型的建立及应用.实验动物科学与管理，1999；16(4)18～21)6.人鼠饲以2％的oxonicacid，并给予低盐饮食，持续7周，可出现轻度高尿酸血症，同时血压升高、入球小动脉增厚。(Mazzali M，Kanellis J，Han，etal.Hyperuricemia induces a primary renal arteriolopathy in rats by a bloodpressure independent mechanism.Am J Physiol Renal Physiol，2002；282(6)F991～997)7.给Wistar大鼠饲喂氧嗪酸0.4g·d-1和尿酸0.6g·d-1，3～4周后，大鼠血尿酸持续性升高。(Bluestone R，Waisman J，Klinenberg JR.Chronic experimentalhyperuricemic nephropathy.Lab Invest，1975；33(3)273～279)尿酸不能被人体利用或在体内分解，在正常人体液pH7.4的环境中呈尿酸钠形式，溶解度417μmol/L(7mg/dl)(尹潍.高尿酸血症和痛风[J].医师进修杂志，1998，21(11)573)，故尿酸浓度必须高于该值才能被沉淀于组织中。现有文献报道大鼠高尿酸血症的复制方法多采用给予大剂量嘌呤物质、抑制尿酸排泄的药.物或尿酸酶抑制剂，即通过增加体内尿酸的来路，抑制尿酸排出体外，或抑制尿酸在体内的分解，使血尿酸含量增加，造成大鼠的高尿酸血症模型。此种模型接近于人类高尿酸血症及痛风的产生机理，为研究痛风和高尿酸血症及评估治疗用药提供可行的研究方法。但以上方法存在两点不足一、均需较长时间才能完成模型的复制；二、复制出的高尿酸血症模型尿酸水平多低于尿酸产生结晶的饱和浓度。以上的不足将为研究治疗高尿酸血症和痛风类药物带来较多的困难复制周期长；运用现有模型仅能观察药物对轻度高尿酸的治疗作用；高尿酸水平低于尿酸产生沉积的饱和浓度，这将不利于痛风模型的复制等等。
1.发明目的本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种更接近于人类嘌呤代谢障碍所形成的大鼠急性或持续性高尿酸血症模型，且血尿酸水平高于饱和浓度的方法。2.技术方案2.1动物大鼠。种属SD、Wistar。性别雌、雄。体重不限。2.2造模药物名称嘌呤类次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸；尿酸酶抑制剂Oxonic acid，potassiumsalt(OA)、allantoxanamide。给药途径灌胃、皮下注射、腹腔注射。
给药剂量嘌呤类100～2000mg·kg-1尿酸酶抑制剂5～1000mg·kg-1溶剂生理盐水、液体石蜡、CMC-Na、油、可溶性淀粉、甘油、增稠剂。
配制要求混悬剂的配制一定要浓度均匀，使用时要摇匀。
造模间隔时间5～24小时。
2.3大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其步骤如下(1)选取种属为SD、Wistar的雌、雄健康大鼠，体重150～450g，禁食、不禁食均可，于室温下，对大鼠用灌胃、皮下注射或腹腔注射的方式同时给予嘌呤类100～2000mg·kg-1和尿酸酶抑制剂5～1000mg·kg-1；(2)或者经过5～12小时，再用上述同样的方式，再次给予嘌呤类100～2000mg·kg-1和/或尿酸酶抑制剂5～1000mg·kg-1，造模后可自由进食、饮水。
上述的嘌呤类为次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸；上述的尿酸酶抑制剂为0A、allantoxanamide。
上述尿酸酶抑制剂的最佳用量为100mg·kg-1/天/1次或200mg·kg-1/天/2次，配合嘌呤类500mg·kg-1/天/1次或1000mg·kg-1/天/2次。
2.4大鼠持续性高尿酸血症模型的复制方法，其步骤如下(1)选取种属为SD、Wistar的雌、雄健康大鼠，体重150-450g，禁食、不禁食均可，于室温下，对大鼠用灌胃、皮下注射或腹腔注射同时给予嘌呤类100～2000mg·kg-1和尿酸酶抑制剂，5～1000mg·kg-1；(2)经过5～24小时，用上述同样的方式，再次同时给予嘌呤类100～2000mg·kg-1和尿酸酶抑制剂5～1000mg·kg-1，造模后可自由进食、饮水；(3)每日连续按(1)、(2)步骤的方法造模，连续给药一周至两周。
上述的嘌呤类为次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸；上述的尿酸酶抑制剂为OA、allantoxanamide。
上述尿酸酶抑制剂的最佳用量为100mg·kg-1/天/1次或200mg·kg-1/天2次配合嘌呤类的最佳用量500mg·kg-1/天/1次或1000mg·kg-1/天2次。
3.有益效果在本实验中，我们使用尿酸酶抑制剂配合嘌呤类，可获得稳定的急性或持续性大鼠高尿酸血症模型。动物的血尿酸水平可显著的提高，12h后高尿酸水平仍然高于尿酸产生结晶的饱和浓度417μmol·L-1，急性高尿酸血症模型复制周期短，且与高尿酸血症的发生机制相吻合。如果每日造模两次，尿酸水平明显高于饱和浓度，且尿酸水平可不断蓄积升高，形成持续性大鼠高尿酸血症模型，其中还可见到一定数量的痛风模型大鼠。这与高尿酸血症和痛风的发生机制吻合，增加动物体内嘌呤类以增加生成尿酸的原料，同时使用尿酸酶抑制剂抑制对尿酸的分解，以此减少尿酸的去路，两者协同，从而明显提高血尿酸水平，且高尿酸水平维持时间明显延长，而当动物体内尿酸持续处于超饱和水平，就会沉积到动物关节腔形成痛风模型。可见，嘌呤类和尿酸酶抑制剂配合使用，是复制出持续性高尿酸血症模型的理想组合。为进一步提高痛风模型发生的百分率提供了有价值的参考。

实施例1.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取雄性健康的Wistar大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式灌入黄嘌呤500mg·kg-1，用腹腔注射方式注射OA 200mg·kg-1。
实施例2.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下1.选取雄性健康的Wistar大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式灌入黄嘌呤500mg·kg-1，用腹腔注射方式注射OA 100mg·kg-1；2.5h后，再次腹腔注射OA 100mg·kg-1。
实施例3.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法步骤如下1.选取雄性健康的Wistar大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式灌入黄嘌呤500mg·kg-1，用腹腔注射方式注射OA 200mg·kg-1；2.5h后，再次灌胃给予黄嘌呤500mg·kg-1。
实施例4.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法步骤如下1.选取雄性健康的Wistar大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式灌入黄嘌呤500mg·kg-1，用腹腔注射方式注射OA 100mg·kg-1；2.5h后，用上述同样的方式，再次同时给予相同用量的黄嘌呤和OA。
实施例5.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取雌性健康的SD大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式，灌给大鼠次黄嘌呤500mg·kg-1，用腹腔注射的方式，注射OA 50mg·kg-1。
实施例6.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取雌性健康的SD大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式，灌给大鼠次黄嘌呤500mg·kg-1，用腹腔注射的方式，注射OA 10mg·kg-1。
实施例7.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取雌性健康的SD大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式，灌给大鼠次黄嘌呤250mg·kg-1，用腹腔注射的方式，注射OA 50mg·kg-1。
实施例8.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取雌性健康的SD大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式，灌给大鼠次黄嘌呤250mg·kg-1，用腹腔注射的方式，注射OA 10mg·kg-1。
实施例9.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取雄性健康的SD大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式灌入次黄嘌呤500mg·kg-1，用腹腔注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
实施例10.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取雄性健康的SD大鼠，体重250g±10g，在室温下，用灌胃方式灌入次黄嘌呤500mg·kg-1，用皮下注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
实施例11.大鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法步骤如下1.选取雄性健康的SD大鼠，体重300g±20g，在室温下，用灌胃方式，灌给大鼠次黄嘌呤500mg·kg-1和OA 100mg·kg-1；2.经过12h，重复以上步骤。
实施例12.大鼠持续性高尿酸血症模型的复制方法，其方法步骤如下1.选取雄性健康的SD大鼠，体重300g±20g，在室温下，用灌胃方式，灌给大鼠次黄嘌呤500mg·kg-1和OA 100mg·kg-1；2.经过12h，重复以上步骤。
3.每日按照步骤1、2连续造模，连续给药一周。
实施例13.大鼠急性或持续性高尿酸血症模型的复制1.实验材料1.1动物SD、Wistar大鼠，雄性，180～320g。由南京中医药大学实验动物中心提供，实验动物饲养许可证号SYXK(苏)2002-0002。
1.2药物Oxonic acid，potassium salt(OA)，sigma-Aldrich公司，Sigma公司。用生理盐水或油配制，配制时先加少许溶剂，放入研钵研匀后，在将剩余溶剂加入，混匀。黄嘌呤(Xanthine，X)sigma-Aldrich公司，Sigma公司。次黄嘌呤(Hypoxanthine，HX)，天津市北洋化工厂。由可溶性淀粉配制，先配制3％可溶性淀粉，煮沸，冷却后先加少量至盛有嘌呤的研钵中，研匀，再将剩余可溶性淀粉加入，混匀。尿酸试剂盒，为Sysmex公司产品。
1.3仪器日立7020全自动生化分析仪。
2.方法与结果2.1X与OA合用对大鼠血尿酸水平的影响将大鼠随机分为5组，正常对照组(C)、X1+OA1组、X1+OA2组、X2+OA1组、X2+OA2组，每组6只，单笼饲养。X1+OA1组腹腔注射OA200mg·kg-1，1h后灌胃给予X500mg·kg-1；X1+OA2组腹腔注射OA100mg·kg-1，1h后灌胃给予X500mg·kg-1，5h后再次腹腔注射OA100mg·kg-1；X2+OA1组腹腔注射OA200mg·kg-1，1h后灌胃给予X500mg·kg-1，5h后再次灌胃给予X500mg·kg-1；X2+OA2组腹腔注射OA100mg·kg-1，1h后灌胃给予X500mg·kg-1，5h后再次腹腔注射OA100mg·kg-1，灌胃给予X500mg·kg-1。C组腹腔注射等体积生理盐水和灌胃给予等体积蒸馏水。分别于第一次灌X后2h、6h给每只大鼠取血，离心取血清，测血尿酸值。结果见表1。
表1X与OA合用对大鼠血尿酸的影响(X±S)(n＝6)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，在第一次给予X2h后，各组血尿酸水平均高于正常对照组(P＜0.05)；在第一次灌X6h后，X1+OA2组血尿酸水平与正常对照组有一定差异(P＜0.05)，X2+OA2组血尿酸水平明显升高，与正常对照组有显著性差异(P＜0.01)。上述结果表明一次给予X和OA虽可升高大鼠血清尿酸水平，但维持时间较短，给药六小时后血清尿酸水平已接近正常。一日内OA和X的总量采取一次或分两次给予，或减半给予，大鼠血清尿酸水平出现了不同的改变。根据表1可见OA无论100mg·kg-1还是200mg·kg-1对给予相同剂量的X所致的大鼠血清尿酸水平的升高均无明显差异，OA一日总量200mg·kg-1一次给予虽可升高大鼠血清尿酸水平，但仅维持不到六小时。而将OA一日总量200mg·kg-1分两次给予，一次给予X则可使大鼠血清尿酸水平持续升高，并维持在六小时以上，说明OA的剂量在100mg·kg-1时即可发挥对尿酸酶的抑制作用，如在此基础上同时增加X的剂量，则不仅可使大鼠血清尿酸水平持续升高，还可使大鼠血清尿酸水平升高达800umol·L-1以上。
2.2不同剂量HX与OA合用对大鼠血尿酸水平一日变化的影响 将大鼠随机分为A、B、C、D、E、F六组。B组灌胃给予HX 500mg·kg-1；C组腹腔注射OA50mg·kg-1+灌胃给予HX 500mg·kg-1；D组腹腔注射OA 10mg·kg-1+灌胃给予HX 500mg·kg-1；E组腹腔注射OA 50mg·kg-1+灌胃给予HX 250ma·kg-1；F组腹腔注射OA10mg·kg-1+灌胃给予HX 250mg·kg-1；A组腹腔注射等体积生理盐水+灌胃给予等体积蒸馏水；分别于1h、3h、5h、7h、9h、24h时，给各组取血，离心取血清，测血尿酸浓度。结果见表2。
表2 HX与OA合用对大鼠血尿酸的影响(X±S)(n＝5)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，OA 50mg·kg-1和HX 500mg·kg-1的剂量在给药后1h，血尿酸值即有显著的升高，在1h、3h、5h、7h处与空白对照组即有显著性差异(P＜0.01)，在9h处与空白对照组也有差异(P＜0.05)。OA 100mg·kg-1和HX 500mg·kg-1的剂量在给药后1h，血尿酸值与空白对照组有显著性差异(P＜0.05)，在3h处与空白对照组也有差异(P＜0.05)。OA 50mg·kg-1和HX 250mg·kg-1的剂量在1h、3h处与空白对照组即有显著性差异(P＜0.01)，在24h处与空白对照组也有差异(P＜0.05)。OA 10mg·kg-1和HX 250mg·kg-1的剂量在1h、3h处与空白对照组即有显著性差异(P＜0.01)。
2.3不同给药途径对大鼠血尿酸的影响 将大鼠随机分为对照组、腹腔注射组和皮下注射组。给腹腔组大鼠腹腔注射OA(生理盐水配制)50mg·kg-1+灌胃给予HX(蒸馏水配制)500mg·kg-1，给皮下组大鼠皮下注射OA 50mg·kg-1+灌胃给予HX 500mg·kg-1。于造模后1h、3h、5h、7h、9h、11h、24h给大鼠取血，离心，取血清，测血尿酸值。结果见表3。
表3不同给药途径对大鼠血尿酸的影响(X±S)(n＝5)

结果表明，皮下注射组大鼠在造模后1h、3h、5h、7h与对照组均有差异(P＜0.01，P＜0.05)，从两组造模后血尿酸水平来看，皮下组大鼠血尿酸9h内均高于腹腔组，7h时血尿酸下降到尿酸产生沉积的饱和浓度处，7h后血尿酸值逐渐恢复至正常。通过组间比较，我们选择皮下注射OA和灌胃给予HX作为造模的给药途径。
在以上的实验过程中，我们发现用生理盐水所配制的OA和用蒸馏水配制的HX均不溶解，很快会分层，对药物溶液的均匀度有很大的影响，因此复制出的动物模型尿酸水平的离散度较大，故我们考虑以下实验将药物做成混悬剂，提高药物溶解的均匀度。
2.4不同剂量、不同体积OA对大鼠血尿酸水平的影响 将大鼠随机分为对照组、大浓度(C)小体积(V)组、中C大V组、中C小V组、小C大V组。OA(溶剂为食用油)皮下注射给药，HX(溶剂为可溶性淀粉)灌胃给药，给药剂量和体积见表4。12h后，重复以上步骤。于第一次造模后5h、12h、24h给大鼠取血，离心，取血清，测血尿酸值。结果见表4。
表4不同剂量、不同体积OA对大鼠血尿酸水平的影响(X±S)(n＝6)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，各模型组在第一次造模后5h均高于对照组(P＜0.01，P＜0.05)。在第一次造模后12h，仅大C小V组血尿酸值高于尿酸产生结晶的饱和浓度，其余各组血尿酸值已低于尿酸饱和浓度。第一次造模后24h(即第二次造模后12h)，除小C大V组，其余三个组的动物血尿酸均超出尿酸饱和浓度，但是仅中C大V组与对照组有一定差异(P＜0.05)，大C小V组24h尿酸值高于其余各模型组，但未表现统计学意义，这主要与数据离散度大有关，影响离散度的因素主要包括造模药物的均匀度及动物的个体差异等，提示在今后模型复制时要克服以上影响因素，可通过扩大实验样本数，严格控制药物混悬剂的均匀度等。另从对动物的尸体解剖发现，皮下注射小体积组大鼠背部皮肤损伤小，基本无残留溶剂。而皮下注射大体积组大鼠背部残留大量油无法被吸收，故不利于长期实验的进行。根据以上实验结果，最终确定采用OA的用量为200mg·kg-1/天/2次，80mg/ml，1.25ml/kg，配合HX 1000mg·kg-1/天/2次(OA采用油配制，HX采用可溶性淀粉配制)复制大鼠急性高尿酸血症模型。
2.5大鼠持续性高尿酸血症模型的复制 将大鼠随机分为对照组、稀油(溶剂为食用油)模型组、稠油(溶剂为食用油，10％甘油，泊洛沙姆1％)模型组。模型组皮下注射OA 1.25ml/kg(80mg/ml)，灌胃给予HX 10ml/kg(50mg/ml)，对照组给予等体积食用油和可溶性淀粉；12h后，重复以上步骤。连续三天。于每次造模后12h给大鼠取血，离心，取血清，测血尿酸值。结果见表5。三天后将大鼠处死，观察背部皮肤损伤程度。
表5大鼠持续性高尿酸血症模型的复制结果(X±S)(n＝6)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，稀油组造模后可立即达到尿酸钠沉积的饱和浓度，造模三天，血尿酸水平居高不下，且第一天血尿酸值与对照组比较，有一定差异(P＜0.05)。稠油组第一天第一次造模后12h，尚不能立即达到饱和浓度，12h后可达到饱和浓度，36h处血尿酸值与对照组有一定差异(P＜0.05)，但稠油组使动物达到的高尿酸水平在各点均低于稀油组，再从两组动物的状态，处死后，解剖背部皮肤观察造模对动物的损伤来看，稠油组对动物背部损伤较大，基质多数残留在背部不被吸收，产生炎症，动物背部粘连，化脓坏死。故我们认为选用食用油作为OA的溶剂，可溶性淀粉作为HX的溶剂，采用OA的用量为200mg·kg-1/天/2次，80mg/ml，1.25ml/kg，配合HX 1000mg·kg-1/天/2次，连续造模，可复制出稳定的大鼠持续性高尿酸血症模型。
综上所述，选择适宜的造模药物，溶剂，制定出恰当的给药剂量、给药时间、给药方式，复制出更接近于人类嘌呤代谢障碍所形成的大鼠持续性高尿酸血症模型，将会使我们深入观察受试药物对模型动物肾脏尿酸排出的影响、对嘌呤代谢的作用环节以及对尿酸盐沉积于关节腔过程的影响成为可能，从而为抗痛风药物的筛选和作用机理的研究提供必要和可靠的动物模型。


本发明公开了一种大鼠急性或持续性高尿酸血症模型的复制方法，该方法步骤是(1)选取种属为SD、Wistar的雌、雄健康大鼠，体重150－450g，禁食或不禁食，于室温下，用罐胃，皮下注射或腹腔注射方式，同时给予嘌呤类100－2000mg·kg