专利名称：一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法随着心脏疾病研究的不断发展，心脏离体实验已越来越被人们所重视，尤其是具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础。目前心肌细胞的提取与培养多采取乳鼠或幼鼠为主，但乳鼠心肌细胞与成熟心肌细胞在功能及结构上都存在不同程度的差异。成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法也有多种，灌注酶解法用于成年大鼠的心肌分离已有40余年的历史,但至今仍无统一的方法可循。自Powell等于1976年首先成功分 离出单个钙耐受成熟心室肌细胞以来，迄今为止国内也仅有少数单位初步建立了可用于原代培养的心肌细胞分离方法。究其原因，是因为心肌细胞分离的每一步都会对最终分离的细胞状态产生重要的影响。实验室温度、Langendorff装置设定温度、心脏摘取速度、水质、溶液的PH值、酶的种类、活力及浓度、细胞内外钙浓度变化、操作者的熟练程度等都会影响心肌细胞状态。目前可见的成年大鼠心肌细胞分离与培养方法的报道中，均是采用两种酶混合消化，或者反复的复钙及沉降，这样增加了操作难度和步骤，容易污染，细胞成活率不高。
本发明所要解决的技术问题是克服现有分离提取方法不稳定、成活率低、操作步骤复杂的缺陷，提供一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案 本发明一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法包括如下步骤 (1)装置预处理设置Langendorff灌注装置恒温于37°C，消毒，超纯水灌流，预充灌注母液； (2)灌流将成年大鼠离体心脏挂于LangendorfT灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6-10ml/min，用含钙液灌流l_2min，然后用无钙EGTA液灌流4_5min，再用II型胶原酶液单向灌流I. 5-2. 5min，之后循环灌流IO-ISmin ;灌流含钙液有助于使离体心脏恢复跳动从而排除心腔及心脏冠状动脉系统内的残留血液；灌流无钙EGTA液使心肌细胞处于低钙状态，心脏完全停跳，消减心肌细胞间Ca2+依赖的紧密连接，有助于细胞外基质的解离疏散；灌流II型胶原酶液用于消化心脏； (3)消化剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集II型胶原酶循环液，加入10%BSA溶液至BSA终浓度为8-12mg/ml，取5-10ml，将心室置于其中，37°C、130-160次/min恒温摇床震荡消化5-8min，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，从灌注II型胶原酶液开始，每4分钟加入O. lmol/L的CaCl2溶液45-55 μ 1，共4次；将心室肌组织用含有1%BSA的II型胶原酶液在恒温振荡器中振荡消化可使心室解离，从而得到游离的杆状细胞； (4)沉降用160目滤网过滤消化液，滤液自然沉降15-20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15-20min，如此重复洗涤2_3次，所得自然沉降物即为心肌细胞；
(5)前述步骤中所用的试剂为
灌注母液NaCl 130 mMol/L、KCl 5.4 mMol/L、HEPES 5 mMol/L,D-Glucose 10 mMol/UMgCl2 · 6H20 3. 5 mMol/UNaH2PO4 0. 4 mMol/L，用 O2 和 CO2 体积比为 95:5 的混合气饱和15min, NaOH 调节 pH 至 7. 20 7. 35 ；
10%BSA制备100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中，在4°C条件下搅拌混匀，放入含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中4°C透析lh，换新鲜含80 mMol/L Ca2+的灌注母液，在4°C下静置过夜，然后分装，储存在-20°C备用；· 含钙液在灌注母液中加入CaCl2,使Ca2+终浓度为500-750 mMol/L ；
无钙EGTA液在灌注母液加入EGTA，使EGTA终浓度为100 mMol/L ；
II型胶原酶液取灌注母液加入II型胶原酶和CaCl2,使II型胶原酶和Ca2+浓度分别为0. 02-0. 06% (质量)和 60-90 mMol/L ；
酶洗脱液灌注母液中加入10%BSA和CaCl2,使BSA和Ca2+终浓度分别为lmg/mL和80-100 mMol/L。优选的，上述方法中灌流步骤为将成年大鼠离体心脏挂于Langendorff灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6ml/min，用含钙液灌流l_2min，然后用无钙EGTA液灌流4-5min,再用II型胶原酶液单向灌流2min,之后循环灌流10_18min。消化步骤为剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集II型胶原酶循环液，加入10% BSA溶液至BSA终浓度为10mg/ml，取5-10ml，将心室置于其中，37°C、130-160次/min恒温摇床震荡消化5min，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，从灌注II型胶原酶液开始，每4分钟加入0. lmol/L的CaCl2溶液50 μ 1，共4次。沉降步骤为用160目滤网过滤消化液，滤液自然沉降15_20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15-20min，如此重复洗涤2_3次，所得自然沉降物即为心肌细胞；
前述方法中，在装置预处理步骤，所述消毒室用75%乙醇灌流10分钟消毒。优选的，在消化时，先将心室由心尖至心底剪开，再放入含有BSA的II型胶原酶循环液中。上述技术方案中，在消化酶的选择上，本发明只采用单一消化酶分离心肌细胞，消化酶的浓度和消化终止时间很重要，II型胶原酶使用浓度为0. 02-0. 06%时即可在8-15分钟内对大鼠心脏充分消化。消化酶的浓度过高及消化时间过长都可造成细胞膜不可修复的损害。有报道认为当心脏颜色变黄，表现较松弛时终止酶消化较合适。但申请人却发现II型胶原酶灌流持续8-18min时，心脏肿涨，晶莹剔透(但并非表面发白，如出现发白则心肌已消化过度)，心室变得松软即可停止灌流，且滴下的灌流液显微镜下可见单个心肌细胞，此时终止消化较合适。心肌细胞体积较大，经过酶液灌流消化后细胞膜损伤已较严重，故本发明不对心室肌进行剪碎处理，而是通过加有1%BSA的II型胶原酶液在恒温振荡器中反复振荡使心室肌自然解离，收集细胞悬液获取心肌细胞。最大程度减少对心肌细胞的物理伤害。另外，国内文献报道梯度复钙多用四步法，且多使用单独配制的复钙液，本发明采用逐步增加钙浓度，逐步梯度复钙。这样既简化了实验步骤，又有效的减少了心肌细胞内钙离子浓度迅速提高引起心肌细胞内钙失衡的概率，从而大大提高心肌细胞的存活率。同时经过酶洗脱液的反复润洗和自然沉降，有利于心肌细胞的纯化。与现有技术相比，本发明采用Langendoff灌流装置经主动脉逆行灌流分离成年大鼠心肌细胞是一种较好的方法，该方法获得的大鼠心肌细胞中75-93%都具有活性，每只 大鼠心脏的活细胞产量最高可达约(5-8) X IO8个，本发明采用单一消化酶分离心肌细胞并用逐步梯度复钙法沉降，既简化了实验步骤，又大大提高了心肌细胞的存活率，简单经济，是分离成年大鼠心肌细胞行之有效的方法。

灌注母液NaCl 130 mMol/L,KCl 5.4 mMol/L,HEPES 5 mMol/L,D-Glucose 10 mMol/UMgCl2 · 6H20 3. 5 mMol/L、NaH2PO4 0. 4 mMol/L，用 O2 和 CO2 体积比为 95:5 的混合气饱和15min, NaOH 调节 pH 至 7. 25 7. 35 ；
10%BSA制备100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中，在4°C条件下搅拌混匀，放入含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中4°C透析lh，换新鲜含80 mMol/L Ca2+的灌注母液，在4°C下静置过夜，然后分装，储存在-20°C备用；
含钙液在灌注母液中加入CaCl2,使Ca2+终浓度为500-750 mMol/L ；
无钙EGTA液在灌注母液加入EGTA，使EGTA终浓度为100 mMol/L ；
II型胶原酶液取灌注母液加入II型胶原酶和CaCl2,使II型胶原酶和Ca2+浓度分别为
0.02-0. 06% (质量)和 60-90 mMol/L ；
酶洗脱液灌注母液中加入10%BSA和CaCl2,使BSA和Ca2+终浓度分别为lmg/mL和80-100 mMol/L。改良M199培养基M199 分别加入 2mMol/L Glutamin、50U/ml 青霉素、50g/ml 链霉素、5mMol/L 肌酸、2mMol/L 肉毒喊、5mMol/L 氛基乙横、0. 8mMol/L EGTA。以上所有液体均用0. 22nm滤膜过滤除菌。5、成年大鼠心肌细胞的分离
(I)装置预处理设置Langendorff灌注装置恒温于37°C，用75%乙醇灌流10分钟消毒，并用大量无菌超纯水灌洗灌流系统后，预充无钙台式液。
(2)心脏摘取SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)和肝素Iml (1000u/ml)，麻醉显效后，仰卧位固定大鼠于蛙板，75%酒精消毒胸腹部皮肤，“u”形剪开皮肤及胸壁暴露纵隔，剪除胸腺，在无名动脉稍远处快速离断主动脉，移除心脏，置于4°C含钙KH液，轻轻挤压2-3次，排除心内积血。( 3 )灌流首先用含钙液灌流，可见心脏恢复跳动，从而排清心房、心室及血管内残留血液，l-2min后流出液变清亮；然后用无钙EGTA液灌流4_5min，心脏完全停止跳动；再用II型胶原酶液灌流，先单向灌流2min (即弃掉开始l_2min内的液体)，再改为循环灌流10-18min，至心脏肿涨、晶莹剔透(不是发白)、心室变得松软；
(4)消化剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，将心室由心尖至心底剪开，收集II型胶原酶循环液，加入10% BSA溶液至BSA终浓度为10mg/ml，取5-10ml，将心室放于其中，37°C、130-160次/min恒温摇床震荡消化5min，用吸管吹打循环液至肉眼观察消化完全得消化液，从灌注II型胶原酶液开始，每4分钟加入O. lmol/L的CaCl2溶液50 μ 1，共4次。
(5)沉降用160目金属滤网过滤消化液，滤液自然沉降15_20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15-20min，如此重复洗涤2_3次，所得自然沉降物即为心肌细胞；
6、成年大鼠心肌细胞的培养
将分离得到的心肌细胞用改良M199培养液30ml润洗，自然沉降15_20min，弃上清，经此步骤后所得沉淀为更纯的钙耐受心肌细胞。在用层粘连蛋白处理过的六孔板中加入心肌细胞和改良M199液使心肌细胞个数稀释为5X 104/cm2，在37. 5% CO2的培养箱中培养3h，使之贴壁，小心换液，去除未贴壁细胞，重新加入改良M199培养基培养过夜，即可用于实验或进行长时间的心肌细胞培养。(注以上自然沉降均在给氧及37°C水浴箱中进行)。7、心肌细胞的观察和评价
将细胞沉淀滴片，在倒置相差显微镜下行细胞计数，按镜下细胞密度=细胞数/毫升原液=(4大格细胞数之和/4) X IO4 X稀释倍数；用0. 4%台盼蓝进行细胞染色，计算台盼蓝染色呈阴性的杆状活细胞占总杆状细胞敷的百分比例，用％表示。以评价心肌细胞存活率。如计数500个细胞数中阴性杆状细胞占的比例。本方法可获得75-93%具有活性的成年大鼠心室肌细胞(表I)。新分离的存活单个成年大鼠心室肌细胞呈杆状或矩形，横纹清晰，菱角分明，长约70-170μπι，宽约20-40μπι。其中约10%左右的心肌细胞发生自发性收缩，其余细胞呈静息状态，静息状态的细胞为钙耐受细胞。少数细胞皱缩成圆形或椭圆形，为死细胞。活性细胞的细胞膜完整，所以台盼蓝不能进入细胞内而拒染。死亡或损伤严重的心肌细胞呈团块状，由于细胞膜缺乏完整性，被台盼蓝染成蓝色。经过60只成年SD大鼠的心肌分离结果显示，平均每个心脏的存活心肌细胞产量为(5-8) X IO8个，无血清改良Μ199培养基培养可生长5_7天以上。表I心肌细胞存活率


本发明公开了一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，采用Langendorff灌注装置经主动脉逆行灌流，依次用含钙液、无钙EGTA液、Ⅱ型胶原酶液灌流，收集Ⅱ型胶原酶循环液加入10%BSA溶液，将心室置于其中恒温摇床震荡消化，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，过滤，滤液自然沉降，收集细胞沉淀，悬浮在酶洗脱液中重复沉降即得心肌细胞，该方法获得的大鼠心肌细胞中75-93%都具有活性，每只大鼠心脏的活细胞产量最高可达约(5-8)×108个，本发明采用单一消化酶分离心肌细胞并用逐步梯度复钙法沉降，既简化了实验步骤，又大大提高了心肌细胞的存活率，简单经济，是分离成年大鼠心肌细胞行之有效的方法。