专利名称：一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法红豆杉(Tkro1SSp.)又称紫杉，为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属、Taxus)的裸子植物。红豆杉属植物全世界共有11种，主要分布于北半球温带至亚热带地区。我国有4种和I个变种，分别是东北红豆杉(T. cuspidata)、云南红豆杉(T. yuennanensis)、中国红豆杉(T. chinensis)、南方红豆杉(T. chinensis var. mairei)、西藏红豆杉(T. walIichiana)(中国科学院中国植物志编辑委员会，1978)，主要分布于东北、西北、华北、西南、中南、华南的各个省区。后来还引种了曼地亚红豆杉(T.x media)，为东北红豆杉和欧洲红豆杉(T. baccata)的杂交种，其母本是东北红豆杉，父本是欧洲红豆杉。紫杉醇(taxol)是从红豆杉树皮中提取出来的一种天然活性成分，具有独特的抗癌效果，对人卵巢癌、乳腺癌、黑色素癌等多种癌症有突出的疗效，对白血病、肺癌、脑癌和其他的一些实体瘤等也有很好的疗效，毒副作用很小，是最好的天然抗癌药物之一。据估计，全世界紫杉醇的年需求量至少在I 000 kg以上。目前，紫杉醇只存在于裸子植物红豆杉科的红豆杉属的11种(亚种)植物中，而且主要从红豆杉树的茎皮中获得。但是红豆杉的生长速度缓慢，再生能力差，成材需要50-250年时间。其资源量非常有限，特别是紫杉醇含量低，仅占树皮干重的O. 01% O. 02%。红豆杉资源与开发矛盾特别突出。近年来，受利益的驱使，红豆杉的野生资源遭到了严重的破坏。如何扩大紫杉醇的药源已经成为当务之急。红豆杉的人工栽培已取得一定进展，但种植需占大量土地，周期较长。紫杉醇的化学全合成需近30步反应，尚无商业开发价值。植物细胞培养由于不受气候和土壤的限制，是作为生产植物有用次生代谢产物的有效方法。目前红豆杉培养细胞中紫杉醇的产量一般都不高，即使偶尔获得较高的产量也都存在着紫杉醇产量不稳定的问题，所以要利用基因工程的方法对紫杉醇生物合成与分支途径中有关基因进行调控，以提高红豆杉培养细胞中紫杉醇产量及其稳定性成为了当前的研究热点。国内外不少实验室正在进行这方面的研究，但还没有成功的报道。诱导培养红豆杉胚性愈伤，以根癌农杆菌为介导，获得红豆杉转基因愈伤组织的方法，将是开展紫杉醇代谢工程研究提高紫杉醇含量并最终 解决紫杉醇产品稀缺的有效方法。目前尚未发现获得红豆杉转基因愈伤组织的相关报道。
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种简单、快速、高效地获得红豆杉转基因愈伤组织的方法。本发明提供的获得红豆杉转基因愈伤组织的方法，包括红豆杉外植体的培养、胚性愈伤组织的诱导和增殖培养、以根癌农杆菌为介导的转化，具有抗性的愈伤组织的筛选和增殖培养及愈伤组织⑶S基因的检测等，为紫杉醇愈伤组织大规模工厂化生产奠定了坚实的基础。本发明利用红豆杉下胚轴作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有⑶S基因的pCAMBIA1304质粒导入红豆杉愈伤组织，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因(Hygromycin B phosphotransferase gene, HPT)的整合情况，用组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得红豆杉的转基因愈伤组织。具体步骤为 (I)红豆杉愈伤组织的诱导培养选择下胚轴为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行暗培养，在下胚轴两端逐渐产生白色的愈伤组织，并且不断膨大。上述愈伤组织诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加激素NAA、TDZ和2，4-D而组成。(2)红豆杉胚性愈伤组织的诱导培养将下胚轴诱导出的白色愈伤转接入胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织。该胚性愈伤诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加5种氨基酸和激素2，4-D、NAA和TDZ而组成。 (3)遗传转化利用根癌农杆菌介导法，将含GUS基因的植物表达载体PCAMBIA1304根癌农杆菌，以红豆杉胚性愈伤组织为受体进行遗传转化。(4)抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养经过遗传转化，然后，在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量。(5) PCR检测和⑶S组织化学染色方法检测转基因愈伤PCR检测pCAMBIA1304质粒上带有的潮霉素磷酸转移酶基因。GUS组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的GUS染色液中，37°C染色过夜，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达。本发明所述的根癌农杆菌，市场有公开出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚 CAMBIA 公司(CAMBIA，GPO Box 3200,Canberra, ACT 2601，Australia。商品名称根癌农杆菌菌株如EHA105，商品编号Gambar I)购得。与现有技术相比，本发明的采用基因工程方法，利用农杆菌介导将PCAMBIA1304质粒导入红豆杉愈伤组织中，获得了转基因红豆杉愈伤组织。这对后期开展红豆杉紫杉醇合成途径的代谢工程，最终解决紫杉醇药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。该方法在红豆杉生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、红豆杉基因工程、细胞工程、代谢工程以及红豆杉遗传转化体系的建立等方面具有广泛的应用价值。 剥掉红豆杉种子的外皮，消毒完整的胚乳，程序如下75%的乙醇消毒2 min，0. 1%的升萊消毒10 min,无菌水冲洗3遍,之后剥取种胚接种于由B5培养基+6-BA1. O mg/1+2, 4-D0.1 mg/1+水解酪蛋白1.0 g/1+活性炭I g/1+鹿糖20 g/1+植物凝胶2. 6 g/Ι组成的培养基中(其中，组分后的数字表示该组分在B5培养基单位体积(I)中的加入量(g))，先在黑暗环境下使种子萌发，然后逐渐增强光照，应用较弱的慢射光培养，即可获得红豆杉无菌小苗，待苗长至2-3 cm后，切取下胚轴用于愈伤组织的诱导。2.红豆杉胚性愈伤组织的诱导 将下胚轴接种于愈伤组织诱导培养基上，该愈伤组织诱导培养基组成为B5培养基+TDZ(O. 5-2. O mg/1)+2，4-D(I. 0-2. O mg/1)+NAA(I. 0-2. O mg/1) +蔗糖 25 g/1+植物 凝胶5 g/1，其中，组分后的数字为该组分在B5培养基单位体积(I)中的加入量(g)，下同，不再作一一说明；在下胚轴两端逐渐产生白色的愈伤组织，并且不断膨大。将愈伤组织继代接种于胚性愈伤诱导培养基上，该胚性愈伤诱导培养基组成为B5+TDZ(0. 5-2. O mg/I)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/l)+NAA(1.0-2. O mg/1)+酪氨酸 O. 8 g/1+丙氨酸 0· 4 g/1+脯氨酸
0.4 g/1+赖氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝胶5 g/1，筛选到长势好而快，没有褐化呈现白色的胚性愈伤组织。实施例2
含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1304根癌农杆菌工程菌的获得将植物表达载体PCAMBIA1304转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar I)，并进行PCR验证。具体地，首先制备感受态根癌农杆菌(如EHA105):培养根癌农杆菌至菌液O. D6tltl=O. 5，将菌液冰浴30 min后，取菌于I. 5 ml Eppendorf管中，于4°C 5000 rpm离心5 min,去上清；用抽滤灭菌的O. IM CaCl2 (预冷)400 μ I悬浮菌体(用移液枪轻轻打匀)后于冰上放置30 min,5000 rpm离心5 min,去上清,用100 μ I预冷的O. IM CaCl2悬浮菌体后于4°C保存10 h备用。然后，采用以下方法获得含植物表达载体PCAMBIA1304的根癌农杆菌工程菌株取一管100 μ I的感受态，加2 μ I质粒PCAMBIA1304，轻轻混匀后，于冰上放置5 min和液氮中放置8 min后，放入37°C水浴中热激5 min ;加入800 μ I无抗生素的YEB液体培养基，轻轻混勻；振荡培养活化(28°C,200 rpm)4 h后，于室温离心(4000 rpm) 10 min,去上清,余下200 μ I菌液重悬菌体混匀；将混匀的200 μ I重悬活化菌液均匀涂布到加相应抗生素[卡那霉素(Kan) 100 μ g/ml+ 链霉素(Str) 25 μ g/ml+ 利福平(Rif) 40 μ g/ml]的 YEB 固体培养基平板上，于28°C培养箱中倒置培养2天后，挑选抗性单菌落在含相应抗生素的YEB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度后做潮霉素磷酸转移酶基因的PCR检测。结果表明，植物表达载体PCAMBIA1304已成功构建到根癌农杆菌菌株中。实施例3
I.根癌农杆菌介导的转化
I.I.根癌农杆菌的培养
挑取含所述植物表达载体的根癌农杆菌工程菌单菌落于培养基(其组成为YEB液体培养基 + 链霉素(Str) 25 μ g/ml+ 卡那霉素(Kan) 100 μ g/ml+ 利福平(Rif) 40 μ g/ml)中，在28°C摇床上180 rpm振荡过夜,第二天当菌液浓度达到OD6qq=O. 5时,5000 rpm离心10分钟后倒掉上层培养液，重悬沉淀在底部的农杆菌，加入100 111乙酰丁香酮，在281摇床(180 rpm)上活化2小时后用于转化红豆杉胚性愈伤。I. 2.根癌农杆菌与外植体的共培养
用根癌农杆菌菌液侵染红豆杉胚性愈伤团块，把带有少量农杆菌菌液的愈伤置于共培养基(其组分为B5+TDZ (O. 5-2. O mg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. 0 mg/1)+酪氨酸0.8 g/1+丙氨酸0.4 g/1+脯氨酸0.4 g/1+赖氨酸0.4 g/1+谷氨酸0. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝胶5 g/1)上于25°C暗培养2天，使农杆菌充分侵染红豆杉愈伤组织。I. 3.抗性愈伤组织的筛选和继代培养 共培养后，把愈伤组织转接到恢复培养基(其组分为B5+TDZ (O. 5-2. O mg/I)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/l)+NAA(1.0-2. O mg/1) +酪氨酸 O. 8 g/1+丙氨酸 0· 4 g/1+脯氨酸
0.4 g/1+赖氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝胶5 g/1+羧苄霉素250 mg/I)上进行脱菌培养，于25°C暗培养25天后转接到筛选培养基(其组分为B5+TDZ(0. 5-2. Omg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. 0 mg/1) +酪氨酸 0.8 g/1+丙氨酸 0.4 g/1+脯氨酸0.4 g/1+赖氨酸0.4 g/1+谷氨酸0.4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝胶5 g/1+羧苄霉素250mg/1 +潮霉素5 mg/1)上进行抗性愈伤组织的筛选培养，将起源于不同细胞的每个愈伤组织作为一个无性系，接种于继代培养基(其组分为B5+TDZ(0. 5-2. O mg/1)+2, 4-D (I. 0-2. Omg/1)+NAA(I. 0-2. 0 mg/1)+酪氨酸 0.8 g/1+丙氨酸 0. 4 g/1+脯氨酸 0. 4 g/1+赖氨酸
0.4 g/1+谷氨酸(λ 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝胶5 g/1 + 5 mg/1潮霉素)上继代筛选，每20-25天继代培养一次。2.转基因红豆杉愈伤组织的PCR检测
首先采用常规CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium bromide,十六烧基三甲基溴化胺)方法提取转基因红豆杉潮霉素抗性愈伤组织的DNA，然后，用PCR方法对转基因红豆杉抗性愈伤组织中的潮霉素磷酸转移酶基因进行检测。PCR反应条件为94°C变性5 min — 30个循环(94°C 50 sec ^ 58°C 50 sec ^ 72°C I min) — 72°C 6 min。结果表明，利用所设计的PCR特异引物扩增转基因红豆杉愈伤组织DNA，能扩增出与预期结果一致的特异目的片段(O. 8 kb)，而以非转化红豆杉基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。说明潮霉素磷酸转移酶基因已经整合到喜树基因组中。3.转基因红豆杉愈伤组织的组织化学检测
GUS报告基因的组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的染色液(100 mM磷酸缓冲液，5 mM高铁氰化钾，5 mM亚铁氰化钾，10 mM Na2EDTA, 50 mg/ml X-Gluc)中，37°C，染色时间为16小时，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达。本实施例利用所构建的含植物表达载体PCAMBIA1304的根癌农杆菌菌株转化红豆杉细胞，获得经PCR和组织化学检测的转基因愈伤组织。为后期开展红豆杉代谢工程和规模化生产紫杉醇并最终解决生物碱匮乏提供了一种有效的解决方法。


本发明属于生物技术领域，具体为一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法。本发明包括红豆杉胚性愈伤组织的诱导培养，带有GUS基因的植物高效表达载体转入根癌农杆菌，农杆菌遗传转化胚性愈伤，转化受体材料的继代增殖培养及抗性胚性愈伤组织的筛选，抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养，PCR检测和GUS基因的检测等。本方法在红豆杉胚性愈伤组织中表达GUS基因，成功地得到红豆杉胚性愈伤组织遗传转化方法。本发明方法获得的红豆杉转基因愈伤组织可在红豆杉基因工程、细胞工程、代谢工程以及红豆杉遗传转化体系的建立中具有广泛应用。