专利名称：一种利用胡萝卜愈伤组织培养水稻干尖线虫的方法水稻干尖线虫besseyiChristie, 1942)病最早于 1915 年在日本，在20世纪40年代由日本传入中国，曾被列为中国对内检疫对象,后因采取严格检疫和种子处理措施，该病害在20世纪80年代基本受到控制。但是近10多年，该病害的发生范围和为害严重度又开始加大，目前在我国主要稻区均有分布，局部地区发生和为害严重。水稻干尖线虫分布广泛、几乎遍布所有的稻产区，在我国广东、广西、湖南、湖北、浙江、江苏、安徽、山东、河北、上海、辽宁、陕西、贵州、四川、云南、台湾等省及地区的主要稻区均有分布。 水稻干尖线虫的寄主范围广,可以寄生35属200多种植物。水稻(Oryza sativa)和草莓iFragaria aaaaasa)是水稻干尖线虫的重要寄主。在水稻上的危害,据报道,该线虫病在不同地区和不同年代危害造成的损失有差异，在美国为40 50%，在印度为20 60%，在伊朗为 54. 5% ;在日本，Nishizawa 和 Yamamoto (1951)报道为 14. 5 46. 7%, Tamura 和Kegasawka (1959)报道感病品种的损失达60% ;在前苏联,Tikhonova (1966)报道为41 71%, Popova (1984)报道为54%。我国江苏省每年水稻干尖线虫病发生面积约10万hm2,一般减产10% 30%，为害严重的减产高达50%以上，据估计，2001 2003年江苏省水稻干尖线虫病累计发生面积约33万hm2，至少造成稻谷减产累计超过5亿kg，经济损失约7. 5亿元。在台湾，洪元平(1959)首次调查报道水稻干尖线虫造成的减产为30 47%，Tsay等(1998)报道在台湾当植株侵染率超过50%时，产量损失高达45%，从90年代中期，该病害在台湾的发生也日益严重。线虫的人工培养有多种方法，包括利用真菌和细菌等微生物培养法、活体植株接种培养法、寄主愈伤组织培养法等，不同类型线虫的培养所采用的具体方法取决于其生物学特性。水稻干尖线虫是植物寄生线虫，但也可以取食真菌完成生活史，因此水稻干尖线虫的人工培养，目前主要是采取利用真菌的培养方法。现有技术中可以培养水稻干尖线虫的真菌有灰葡萄孢菌(Potrytis ciflerea)、链格孢菌(Alterrmriei sp.)、镰刀菌{Fusariumsp.)、柑橘黑腐病病原真菌ciiri)等。用真菌培养水稻干尖线虫方法简单、繁殖率高，但是长期在长菌上培养会影响水稻干尖线虫对植物的寄生和致病力。
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种利用植物愈伤组织培养水稻干尖线虫的方法，该方法即可实现简单、大量培养繁殖水稻干尖线虫的目的，又能保持水稻干尖线虫对植物的寄生和致病力。本发明通过以下技术方案实现上述目的 一种利用胡萝卜愈伤组织培养水稻干尖线虫的方法，步骤如下(1)制备胡萝卜愈伤组织新鲜胡萝卜洗净，用工业酒精浸泡后灼烧，至胡萝卜表皮变成暗红色，削去表皮，切成片放入灭菌培养皿中，封口，置于培养箱中培养至长出胡萝卜愈伤组织； (2)线虫的消毒和接种水稻干尖线虫用硫酸链霉素溶液消毒，然后离心，沉淀用无菌水混匀继续离心，最后沉淀用无菌水稀释分散滴在胡萝卜愈伤组织上； (3)线虫的培养繁殖和保存将接种了水稻干尖线虫的胡萝卜愈伤组织正置放入黑暗培养箱内，在25°C 30°C培养或20°C 25°C保存。植物寄生线虫不同属间的生物学特性差异较大，并非所有的植物线虫都可以采用统一的方法进行培养，现有技术中可以用胡萝卜愈伤组织培养香蕉穿孔线虫，但香蕉穿孔线虫与水稻干尖线虫在分类地位上属于不同的目，寄主不同；利用胡萝卜愈伤组织法可以培养垫刃目短体属(如香蕉穿孔线虫)的种类，此类线虫的口针比较粗壮，便于穿刺寄主表皮获得营养，而胡萝卜是其自然寄主，所以最早发明胡萝卜愈伤组织方法用于培养此类线虫；水稻干尖线虫属于滑刃目，口针不发达，目前成功培养出来此类的线虫种类多以真菌培养为主，尚未有在植物组织上进行培养的报道；利用真菌培养水稻干尖线虫可以获得大量的线虫，但在后续的分子生物学特性或者致病性等方面的研究过程中，容易受其食物的影响，此外经常以真菌为食对其致病能力有影响，所以选择以植物组织为食可以避免此类的问题；由于胡萝卜不是水稻干尖线虫的寄主，所以很难想到可以利用胡萝卜愈伤组织培养该线虫，所以本发明的实现为水稻干尖线虫的培养提供了一种经济有效、操作简便、收集线虫简便干净且保存和继代培养都比较方便相对长久的方法。上述利用胡萝卜愈伤组织培养水稻干尖线虫的方法，还包括线虫继代培养的步骤，是用无菌水清洗保存线虫的培养皿中的线虫，再重复步骤(2)和(3)的操作，即消毒、离心、接种培养。保存线虫的培养皿取出后，因为要继代培养线虫，所以其清洁度一定要保证，使用无菌水可以避免让线虫再接触其他微生物。在进行继代培养时，挑取的线虫最好为雌虫，以获得最大量的线虫。上述步骤(I)中酒精浸泡时间优选为2min。酒精选用工业酒精即可，培养皿封口可以使用封口膜或者保鲜膜，培养箱温度最好设置为25°C，培养箱设置为黑暗条件，2周左右即可长出愈伤组织。上述步骤(2)中水稻干尖线虫的消毒用O. 2% (质量百分含量)硫酸链霉素处理3h或以上，可以达到消毒目的，不影响其正常的繁殖发育。上述步骤(2)所述离心条件优选为4000rpm下2min,最好能重复两次。线虫稀释液最好滴在胡萝卜愈伤组织表面的靠近边缘处。上述步骤(3)培养温度最佳为30°C，虽然水稻干尖线虫不同种群的最适培养温度有差异，但多数种群的最适培养温度是30°C，在培养3周后即可繁殖大量的线虫，培养7周后繁殖的线虫量最大，可看到愈伤组织变成淡黄色或暗黄色。保存温度为2(T25°C的情况下可以保存3 4个月。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果 本发明的方法即可实现简单、大量培养繁殖水稻干尖线虫的目的，又能保持水稻干尖线虫对植物的寄生和致病力。I.用胡萝卜愈伤组织培养水稻干尖线虫，与真菌培养方法相比，操作方法更加简、便，培养材料更易获得。水稻干尖线虫是植物寄生线虫，其长期在真菌上培养会导致其对植物寄生和致病力的退化，在胡萝卜愈伤组织长期培养则能避免此情况发生。2.用胡萝卜愈伤组织培养水稻干尖线虫，在Γ5周达到最大繁殖量后，不需马上转到新的愈伤组织上进行继代培养，可以将培养皿移到比繁殖温度低5°C的黑暗培养箱中保存3-4月后，胡萝卜愈伤组织仍不腐烂并有部分活虫存在，这时再进行继代培养。而用真菌培养，在:Γ5周达到最大繁殖量后，菌丝被线虫吃完，必须转到新培养的菌丝上继代培养。因此，胡萝卜愈伤组织培养法不仅可以快速获得大量线虫，而且还可以用于长期保存，减少继代培养次数。3.用胡萝卜愈伤组织来繁殖香蕉穿孔线虫可以取得很好的效果，但是用浓度为95%的酒精喷洒于胡萝卜表面进行消毒不够彻底，表皮表面的空隙或者芽眼中可能会残留病原菌，所以在经济实惠的工业酒精中浸泡2 min可以达到深层却不伤害胡萝卜次生韧皮部和形成层的消毒目的，有利于愈伤组织的正常生长；此外，可以直接将切成片的胡萝卜放进灭菌的培养皿中，封口后放入培养箱培养愈伤组织，不需要任何培养基。所以该方法简便 且经济实用。

图I.经过消毒后切好的胡萝卜。图2.2周后长出愈伤组织的胡萝卜。图3.接种水稻干尖线虫5周的胡萝卜愈伤组织。图4.接种水稻干尖线虫4个月后的胡萝卜愈伤组织。

供试水稻干尖线虫种群见下表I，各种群均保存于华南农业大学。表I供试的水稻干尖线虫种群及其来源 _
译号I种群编号I来源地I寄主
I_HN-2_河南省罗山_7jC稻(Oryzasa ti va )_
2~N80 江苏省淮安市淮阴区袁集镇袁集村灰稻⑷safjVa)—
3~ NlO _江苏省南京市六合区雄州镇红星村水稻(fl 4~ A-I 安徽省淮南宫集镇一
5_JZ_湖北省宑j州长江大学试验田_7jC稻(6>. sativa)_
6_Hq2_贵州省贵阳花溪区花溪镇小寨村_7jC稻(6>. sativa)_
7_YQ3_贵州省余庆县白泥镇陆家寨村_7jC稻(6>. sativa)_
8_Xi_福建省厦门同安区五显镇西洋村~_7jC稻(6>. sativa)_
9_X5_福建省厦门翔安区新圩镇马塘村_水稻(6>. sativa)_
10~Hb _海南省海口市狮子岭水稻(β
ΤΓ~ HC6 _广东省惠州市陈江镇洋岭村水稻(0. saOVa)
12~G27 广东省茂名茂南区山阁镇灰稻⑷MOVa)—
13~ J12 广东省江门市新会区大泽镇北洋村永稻⑷—
ΤΓ~ Gb _广东省广州华南农业大学岑村农场水稻(ft saOVa)
15 S24_广东省深圳市龙岗区同乐基地_{Fragariaananasa )_具体步骤如下
(I)胡萝卜愈伤组织培养基的制备
市场上购买新鲜的胡萝卜，冲洗干净后，切去前端和末端，再用蒸馏水水冲洗，在工业酒精中浸泡2 min，然后在酒精灯上灼烧，至胡萝卜的表皮由桔红色变为暗红色；用灭菌的削皮刀削去胡萝卜的表皮，然后将胡萝卜切成厚度为5_左右的薄片，薄片单层放入灭菌培养皿中，每个培养皿放一片(见图1)，用保鲜膜封口，然后放入25°C培养箱中黑暗培养2周作用，长出愈伤组织备用(图2)。水琼脂培养基配制10g琼脂粉放入IOOOmL蒸馏水中煮沸，得到10g/L水琼脂培养基，分装与培养瓶中封口，高压(121°C，20min)灭菌。(2)水稻上的水稻干尖线虫分离
将水稻的叶片、叶鞘和穗分别剪碎，用贝曼漏斗法分离线虫[谢辉.2005.植物线虫 分类学(第二版)·北京高等教育出版社，P38-40]。(3)水稻干尖线虫的消毒和接种
分别挑取每个供试的水稻干尖线虫种群20条雌虫放入装有O. 2 %硫酸链霉素的I. 5mL离心管中，放置3h以上，4 000 rpm离心2 min，去除上清，用无菌水清洗两次，在超净工作台上，去除上清液，吸取离心管中的线虫悬浮液，接种到制备好的胡萝卜愈伤组织表面，用保鲜膜封好，放入20°C、25°C和30°C培养箱中黑暗培养7d、14 d、21d、28d和35 d。每个处理5个重复。(4)水稻干尖线虫在胡萝卜愈伤组织上培养一定时间后线虫的收集
将接种水稻干尖线虫的胡萝卜愈伤组织置于供试条件下达到设定的培养时间后取出，先将培养皿盖子上的线虫用清水冲洗到烧杯中，然后把胡萝卜愈伤组织放入搅拌器中，力口适量水搅拌，将搅拌后得到的悬浮液通过100目(孔径150 Mffl),500目(孔径26 Mm)的组合筛，用自来水反复冲洗后，用洗瓶冲洗收集500目筛上的线虫至小烧杯中。(5)水稻干尖线虫在胡萝卜愈伤组织上培养后的虫数统计和分析
将从每个处理重复的胡萝卜愈伤组织上分离出的水稻干尖线虫配制成10 mL线虫悬浮液，充分混均后，吸取I mL线虫悬浮液于洁净的培养皿(直径5mL)中，在体视显微镜统计线虫数量，重复3次，其平均值X 10，即为该胡萝卜愈伤组织上培养繁殖的水稻干尖线虫数量。供试的15个水稻干尖线虫接种在胡萝卜愈伤组织上在供试温度和时间内的繁殖结果表明(表2、3、4，表中数据为5次重复的平均值,括号内的数值为标准误(S. E);表中同一行数据后字母相同者表示在O. 05水平上差异不显著(DMRT法))，这些种群在不同温度下达到最大繁殖率所经历的时间存在差异。20°C时，达到最大繁殖倍数的历期A-I种群是14d，Xi是21d，HN_2、YQ3、X5、G27和Gb是28d，其他8个种群均是35d，其中Hq2在28d和35d的繁殖率相同，有4个种群最大繁殖倍数超过100，其中达到最大繁殖量所需培养时间最短的A-I种群的最大繁殖率在所有供试种群中也最小仅为3. 4。在25°C时，达到最大繁殖倍数的历期HN-2种群是14d，Hb、G27、J12和S24种群是21d, N80、Xi、X5和HC6种群是28d，其他6个种群均是35d，有11个种群最大繁殖倍数超过100，其中达到最大繁殖量所需培养时间最短的HN-2种群的最大繁殖率在所有供试种群中也最小仅为2. 45。在30°C时，达到最大繁殖量的历期Xi、X5和Hb种群是21d，N80、N10、A-1、HC6、G27和Gb种群是28d，其他6个种群均是35d，所有种群的最大繁殖倍数均超过100。可见用胡萝卜愈伤组织上，繁殖水稻干尖线虫的合适温度和时间是25 30°C培养21-35 d。繁殖水稻干尖线虫的合适温度和时间是25 30°C培养 21-35d。 表2 20°C下水稻干尖线虫不同种群在胡萝卜愈伤组织上的繁殖率


本发明公开了一种利用胡萝卜愈伤组织培养水稻干尖线虫的方法，属于植物线虫培养保存技术领域。该方法的具体步骤为新鲜胡萝卜洗净，用酒精浸泡后灼烧，至胡萝卜表皮变成暗红色，削去表皮，切成片放入装有水琼脂培养基的灭菌培养皿中，封口，放入培养箱中培养至长出胡萝卜愈伤组织；水稻干尖线虫用硫酸链霉素溶液消毒，然后离心，沉淀用无菌水混匀继续离心，最后沉淀用无菌水稀释分散滴在胡萝卜愈伤组织上；将接种了水稻干尖线虫的胡萝卜愈伤组织放入黑暗培养箱内，在25℃~30℃培养或20℃~25℃保存。本发明的培养方法即可实现简单、大量培养繁殖水稻干尖线虫的目的，又能保持水稻干尖线虫对植物的寄生和致病力。