专利名称：一种红豆杉试管苗诱导获得愈伤组织和悬浮细胞的方法紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是20世纪六七十年代从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus L.)植物树皮中分离出来的一种天然的四环二萜类生物碱，因其在肿瘤治疗中的独特效果而广受人们关注。据相关资料介绍，估计国内外在21世纪初期对紫杉醇针剂的需求量约2000万支，即需用紫杉醇600kg，目前市场售价为1200-1800元/支不等。随着对紫杉醇需求量的日益递增，目前仅仅从红豆杉的树体中提取的产量已经不能满足医药市场需要，加之大肆的开采使红豆杉自然资源日趋枯竭、红豆杉资源自然更新能力差、生长 缓慢、濒危灭绝，各国政府已明文规定禁止砍伐野生红豆杉资源。因此紫杉醇其他途径的开发就显得极为重要，其中利用红豆杉细胞进行离体培养就是一条重要的途径，一方面可以加强对红豆杉野生种质资源及其生态环境的保护，另一方面可以满足供需间的差距，并且细胞培养繁殖率高，培养条件易于优化和控制，产物较易分离，从长远来看是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途径。国内外关于红豆杉细胞、组织培养和紫杉醇鉴定、分离和纯化方面的研究工作已经开发了较为完善的实验室技术体系，并且具有相当规模的工厂化生产系统。在其大规模培养生产紫杉醇的核心是要筛选得到具有高产、优质、遗传稳定的细胞种质资源，这是利用红豆杉细胞进行大规模生产紫杉醇的前提。在以红豆杉茎段或者其他成年态的材料为外植体建立细胞系的过程中污染率较高，比较的浪费人力、财力和物力(鲁明波，红豆杉高产细胞株的筛选及培养条件优化，2000，华中科技大学博士论文)。红豆杉种胚可以直接或者间接诱导成愈伤组织细胞无性系，并具有产生紫杉醇代谢的能力。中国红豆杉刚刚萌动的种胚可以在培养基上离体培养得到愈伤组织细胞系，并通过筛选得到细胞生长快、紫杉醇含量高的细胞系(张长河等，红豆杉胚源细胞株的培养和紫杉醇的生产，华中理工大学学报，2000，28 (1):82-85)。Sung HS等利用日本红豆杉的成熟种胚在B5培养基上诱导出了愈伤组织，并进一步进行了紫杉醇的检测(Sung Ho Son, et al, selection andproliferation of rapid growth cell lines from embryo derived cell culturesof Yew Tree (Taxus cuspidate Sieb.Et Zucc)，Bioprocess Eng，1994，4，112-118);Wann RS等短叶红豆杉、欧洲红豆杉和日本红豆杉的胚乳为材料在BLCG培养基上成功诱导得到体细胞胚胎，并成功增值用于紫杉醇的提取(Wann et al. , induction of somaticembryogenisis in taxus, and the production of taxane-ring containing alkaloidstherefrom, United States Patent, US005310672A)；Mihal jevi 等[19]利用欧洲红豆杉的成熟种胚为材料，在B5培养基上直接成功诱导出愈伤组织、增殖，并用高效液相色谱检测到紫杉酉享的产生(Mihal jevic S et al，effect of explant source and growth regulatorson in vitro callus growth of Taxus baccta L.Washingtoniij Food Technol.Biotechnol. 2002, 40 (4) : 299 - 303)，但以种胚直接诱导成愈伤组织获得细胞悬浮系所经历的周期较长，获得的细胞系要经过较长的周期才能进入高产株系的筛选阶段。
本发明的目的在于提供一套利用南方红豆杉试管苗诱导愈伤组织的方法，同时提供利用该愈伤组织进行悬浮培养获 得悬浮细胞的方法，克服茎段和种胚直接诱导愈伤组织高污染率、低效率或方法存在的缺陷，以便快速、高效、大规模地获得分散性能好的悬浮细胞，为红豆杉的细胞悬浮培养提供原料或者进一步筛选高产紫杉醇细胞株提供优质筛选材料。本发明的目的是通过以下方式实现的。—种红豆杉试管苗诱导获得愈伤组织的方法，包括以下步骤(I)种子种胚的剥离将南方红豆杉种子(Taxales chinensis var. mairei)从外种皮中剥离出来；(2)外植体消毒取步骤(I)得到的种子，用70%的酒精和O. 1%的氯化汞表面消毒，再用无菌水清洗；(3)种子的预处理将步骤(2)得到的种子用无菌水浸泡1-5天；(4)种子合子胚的分离在无菌条件下剥取种子的合子胚；(5)试管苗的诱导将步骤(4)剥离的合子胚接种到试管苗诱导培养基上诱导试管苗；试管苗诱导培养基为BLCG培养基(该培养基配方见Wann et al.，induction ofsomatic embryogenisis in taxus, and the production of taxane-ring containingalkaloids therefrom, United States Patent, US005310672A)+活性炭 5g/L+鹿糖 20g/L+琼脂7g/L，培养基pH值5. 8，经过30天的暗培养后将离体培养的种胚转入14h光照，光照强度为44001x和IOh暗培养的光周期条件下培养20天后即可，培养温度均为24±1°C ；(6)愈伤组织的诱导将红豆杉试管苗切割成0. 5cm的切段，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织诱导培养基为=BLCG培养基+Piculoram (毒莠定)l_5mg/L+6-BA 0. 5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L ;诱导条件为24± 1°C条件下暗培养。所述步骤(I)中的南方红豆杉种子为当年生或者4°C保存1-2年的南方红豆杉种子。所述步骤(2)清洗消毒过程具体如下先将去除外种皮的种子放入无菌的容器中，在超净工作台内依次经70%酒精消毒90s和0. 1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用。所述步骤(3)种子预处理具体过程如下将去掉外种皮的种子经过步骤(2)的表面消毒处理后，用无菌的蒸馏水在室温条件下无菌密封浸泡1-5天。步骤(6)得到的愈伤组织进行继代培养，具体条件如下继代培养的培养基为BLCG 培养基+picloram l-3mg/L+6_BA 0. 5-1. 0mg/L+鹿糖 20g/L+琼脂 7g/L, pH 值调至5.8 6. O，培养条件为24 ± I °C条件下暗培养。一种红豆杉试管苗诱导愈伤组织获得悬浮细胞的方法，挑取上述的方法中继代培养得到的淡黄色愈伤组织，转入液体培养基中进行悬浮培养，获得悬浮细胞。具体是挑取上述的方法中继代培养IOd得到的淡黄色膨松的愈伤组织进行悬浮培养，培养基为BLCG培养基或者B5培养基+picloram l-3mg/L+6_BA O. 5-1. 0mg/L+20g/L的蔗糖(为液体培养基，不要添加琼脂)，pH值调至5. 8 6. 0，培养条件为24土 1°C条件下暗培养，摇床转速为100_120rpm/mino该发明具有以下优点(1)外植体采集时期集中，污染率极低；(2)种子预处理简单，用静水处理可以大量节约水资源，并且适合大批量的种子处理；(3)通过二步培养可以获得适合悬浮培养的愈伤组织，简化后续试验；与种胚直接诱导愈伤组织相比，本发明可以克服直接利用种胚来获取大量愈伤组织培养周期 长的缺点，因为将种胚诱导成试管苗，其生长速度较种胚愈伤组织速度快，而且将整个试管苗诱导成愈伤组织的材料较种胚多的多；(4)克服了茎段诱导愈伤组织高污染率、低效率或方法存在的缺陷，以便快速、高效、大规模地获得分散性能好的悬浮细胞，为红豆杉的细胞悬浮培养提供原料或者进一步筛选高产紫杉醇细胞株提供优质筛选材料。图I是本发明中红豆杉试管苗诱导愈伤组织和悬浮细胞的过程，其中A.刚剥离的种胚接种到培养基上；B.离体培养7天的红豆杉种胚；C.离体培养15天的红豆杉种胚；D.种胚诱导培养40天后得到的试管苗；E.刚接种的红豆杉试管苗切段；F.切段愈伤组织诱导培养25天；G :切段愈伤组织诱导培养40天；H :悬浮培养过程中正在抽滤的细胞系。
(6)愈伤组织的诱导接种于愈伤组织诱导培养基，培养基配方BLCG培养基+Piculoram 3mg/L+6_BA O. 5mg/L+ 鹿糖 20g/L+ 琼脂 7g/L ;诱导条件为 24± 1/C条件下暗培养；通过40天的暗培养，可以获得优质的愈伤组织，愈伤组织诱导率可达到66. 15%，当其他条件不变，而愈伤组织诱导培养基中Piculoram含量在l_5mg/L范围内变化时，其诱导率均能达到66. 15%，且生长良好。(7)愈伤组织的继代培养挑取诱导的初始淡黄色合子胚愈伤组织在继代培养基中进行继代培养，继代培养的培养基为=BLCG培养基+picloram 2mg/L+6-BA O. 8mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH值调至6. 0，培养条件为24土1°C条件下暗培养；愈伤组织生长良好；当其他条件不变，而继代培养基中Picloram含量在l_ 3mg/L和6-BA含量在O. 5-1. Omg/L，pH值在5. 8 6. O范围内变化时，也可保证愈伤组织生长效果良好。(8)悬浮培养挑取继代培养IOd左右的淡黄色、生长快、颗粒明显的细胞团进行悬浮培养，培养基为BLCG培养基+picloram 2mg/L+6-BA O. 8mg/L+鹿糖20g/L (为液体培养基，不要添加琼脂)，pH值调至6. 0，培养条件为24土 1°C条件下暗培养，摇床转速为100-120rpm/min。在转入液体培养基中进行悬浮培养3天左右，获得分散良好的红豆杉试管苗愈伤组织悬浮细胞。当其他条件不变，而悬浮培养基中picloram含量在l_3mg/L和6-BA含量在
O.5-1. Omg/L, pH值在5. 8 6. O范围内变化时，均能获得分散良好的红豆杉试管苗愈伤组织悬浮细胞。或者当其他条件不变，而将上述悬浮培养基改为B5培养基时，也能达到上述同样的效果。


本发明公开了一种红豆杉试管苗诱导获得愈伤组织和悬浮细胞的方法。包括(1)种子外种皮剥离利用机械破壳，手工剥离外种皮；(2)外植体消毒依次经70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用；(3)种子预处理用无菌水密封常温浸种1-5天；(4)分离合子胚；(5)试管苗的诱导将种胚接种到试管苗诱导培养基上；(6)愈伤组织的诱导；(7)愈伤组织的继代培养；(8)愈伤组织的悬浮培养。本发明具有简便、快速获取红豆杉愈伤组织以及利用该愈伤组织给红豆杉的细胞悬浮培养提供原料或者进一步筛选高产紫杉醇细胞株提供优质筛选材料的特点，能节省大量的人力、物力、提高劳动效率。