专利名称：基因OsSRK1在控制水稻叶片长度和宽度中的应用的制作方法水稻叶面积对水稻干物质积累和产量具有重要意义。水稻干物质的90%以上是通过绿色叶片进行光合作用积累的，叶鞘和茎的光合作用很弱。而在水稻叶片进行光合作用时，叶面积和光合速率是两个决定干物质增长的主要因素，其中叶面积的贡献占整个干物质增长的70%。由此可见，维持一定的叶面积，对水稻的干物质积累和产量都具有重要意义。植物叶器官大小不仅受环境(如光照、水分和营养等)影响，而且受到严格的遗传调控。就遗传调控来说，植物成熟叶片大小受两个不同的过程控制细胞分裂和细胞扩张。通常情况下，细胞分裂和细胞扩展协同调控器官大小。目前，拟南芥叶器官发育的分子机制研究的比较清楚。一旦从顶端分生组织中分化，叶原基通过细胞扩展和细胞分裂而增大。随后叶原基通过细胞扩展和核内复制开始纵向延伸。核内复制提高了细胞倍性，导致细胞变大。上述叶器官发育中的任一环节的改变都能够影响叶面积。根据基因通过调控细胞扩展还是调控细胞分裂而影响叶片大小，可以把这些基因分成如下几类第一类基因对叶片大小的调控主要是通过影响叶片细胞数目而实现的，对细胞大小没有影响。如GRF5 (Growth-regulating factoid)基因编码一个转录因子。当该基因的表达受到抑制时，叶片细胞数目减少，叶片变小；相反，过量表达GRF5导致转基因植株叶片细胞数目增多，叶片变大(Horiguchi et al.，Plant J. 2005，43 :68-78)。PEAPOD1 (PPDl) 和PPD2编码植物特异的DNA结合蛋白，抑制这些基因的表达增加了细胞数目，叶片变大 (White, Proc Natl Acad Sci USA，2006，103 13238-13243)。AVPl 基因编码液泡膜定位的、依赖于焦磷酸的H+泵，该基因缺失突变导致叶片细胞数目减少，叶面积变小；然而，过量表达AVPl的拟南芥植株叶片的细胞数目增多，叶面积变大(Li et al. , Science, 2005, 310:121-125)。BRIl基因过量表达也通过增加细胞数目而导致叶片变大(Gonzalez et al.，Plant Physiol.，2010，153 :1261-1279)。第二类基因通过调控细胞周期活性而影响叶片细胞数目，但同时也拮抗性地调控细胞大小，从而弥补因细胞数目改变而对叶片大小的影响。这类基因往往在叶片发育的早期起作用，如ANGUSTIF0LIA3和AINTEGUMENTA基因(Mizukami and Fischer, ProcNatl Acad Sci USA，2000，97 :942-947)。JAW 基因过量表达导致转基因拟南芥叶片变大，叶片的细胞数目增多，但细胞变小(Gonzalez et al., PlantPhysiol.，2010，153 :1261-1279) 第三类基因通过调控细胞大小而影响叶片大小。 如过量表达EXP10和ARG0S-LIKE基因能够增大细胞，从而导致转基因植株叶器官变大(Cho and Cosgrove,ProcNatl Acad Sci USA,2000,97 :9783-9788 ；Hu et al. ,Plant J.，2005， 47 1-9)；第四类基因能够同时影响细胞分裂和细胞扩展，这类基因包括ARF2，EBPl, HRCl 禾口GA200X1(Okushima et al. ,Plant J.，2005，43 :29-46 ；Horvath et al.，EMBO J.，2006，25 :4909-4920 ；Century et al. , Plant Phsiol. ,2008,147 :20-29 ；Gonzalez et al., Plant Physiol.，2010，153 :1261-1279)。目前，世界主要粮食作物水稻、小麦和玉米都是单子叶植物，但是人们对这些单子叶作物叶片发育和叶器官大小调控的分子机制缺乏了解，所以调控这些作物叶器官大小的分子育种还有很大的盲目性。本发明在水稻品种日本晴中，增强编码水稻S-型受体激酶(OsSRKl)基因的表达水平，显著提高了苗期及成株水稻叶面积。因此，在水稻中过量表达OsSRKl基因对于提高水稻干物质积累和产量都具有重要意义，这为水稻的高产分子设计育种提供了新思路。
本发明的目的是克服现有技术的不足，从水稻品种日本晴中分离克隆到一个编码 S"型受体激酶的OsSRKl基因，该基因在水稻中过量表达后，发现转基因阳性植株苗期叶片宽度和长度，以及旗叶的宽度和长度均明显高于非转基因植株，表皮细胞宽度变大。因此， 在植物中过量表达OsSRKl基因对于提高作物叶面积具有重要意义，这为提高作物光能利用率提供新的思路。本发明申请人在一个叶面积增大的突变体中，利用基因表达图谱鉴定到一个序列号为AK068992的、编码S-类受体激酶的OsSRKl基因的信使RNA序列。水稻OsSRKl基因信使RNA序列为1707个碱基，编码444个氨基酸。本发明是通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsSRKl基因的全长编码区，包含1335个碱基，正向连接在植物表达载体 pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻品种日本晴中，提高OsSRKl基因的表达，得到 OsSRKl基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，转基因水稻阳性植株的叶片长度和宽度明显高于非转基因植株。本发明用于构建过量表达OsSRKl基因的植物表达载体、增强OsSRKl基因表达的 DNA序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明利用水稻品种日本晴的OsSRKl基因的cDNA片段作为应用基因，将该基因正向转入水稻中，提高OsSRKl基因的表达水平，转基因水稻植株表现出表皮细胞扩大， 水稻苗期叶片长度和宽度增大20-40%，水稻抽穗期旗叶宽度提高了 15-23%，长度提高了 7-18%。本发明的优点在于(1)本发明提供了一种通过影响表皮细胞扩展而增大叶片长度和宽度的水稻基因 OsSRKl的应用。申请人在水稻中过量表达OsSRKl基因表达后，发现转基因阳性水稻苗期叶片长度和宽度增大20-40%，水稻抽穗期旗叶宽度提高了 15-23%，长度提高了 7-18%。(2)本发明首次分离克隆了水稻OsSRKl基因，并首次在水稻中过量表达了 OsSRKl 基因。为培育叶面积提高的水稻品种提供了新的思路，也为其它作物利用异源基因技术提高叶面积提供了理论支持。(3)本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物叶面积提高研究提供支持。图1为本发明的OsSRKl基因表达载体的构建示意图。将克隆在pMDIS-T载体上的OsSRKl基因利用BamHI和SpeI酶切，替换pCAMBIA1390_ubi植物表达载体上BamHI 和SpeI之间的DNA片段，这样OsSRKl基因正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-SRKl 植物表达载体。图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中OsSRKl基因转录本水平结果图。其中 OsSRKl/WT表示转OsSRKl基因的植株，#1、#2和#8代表不同阳性转基因株系；OsUBQ编码水稻的泛素，作为水稻的内参基因；WT代表野生型水稻植株。图3为转OsSRKl基因水稻植株和野生植株苗期叶片相对长度和叶片相对宽度比较。其中#1、#2和#8代表不同阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。分别用非转基因WT植株相同叶位叶片的长度或者宽度作为100%。图4为转OsSRKl基因水稻植株和野生植株苗期叶片第二叶和第三叶比较图。其中#1、#2和#8代表不同阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。图5为转OsSRKl基因水稻植株和野生植株抽穗期旗叶相对宽度和旗叶相对长度比较。其中#1、#2和#8代表不同阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。分别用非转基因WT植株的旗叶宽度和长度作为100%。图6为转OsSRKl基因水稻植株和野生型植株的每个视野内表皮细胞列数比较。其中#1、#2和#8代表不同阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。KNO328.3 g
KH2PO44.0 g
MgS04-7H201.85 g
CaCl2-2H201.66 g
(NH4)2SO44.63 g
用水定容IL2)N6 微量(1000X)
MnSCMH2O4.400 g
ZnS04-7H201.500 g
H3BO31.600 g
KI0.800 g
NaMo04-2H200.250 g用水定容IL3) N6 维生素(1000X)
甘氨酸200 mg
盐酸硫胺素BlIOOmg
盐酸吡哆素B650 mg
烟酸50 mg
肌醇IOg用水定容IOOmL3)MS 大量元素(IOX)
KNO319.0 g
NH4NO316.5 g
KH2PO41.7g
MgS04-7H203.7 g
CaCl2-2H204.4 g用水定容IL4)MS 微量(1000X)MnS04-4H2022.300g
ZnS04-7H208.600 g
H3BO36.200 g
KI0.830 g
NaMo04-2H200.250 g
CuSO4-5H200.025 g
CoC12-6H200.025 g用水定容IL5)MS 维生素(1000X)
甘氨酸200 mg
盐酸硫胺素BlIOmg
盐酸吡哆素B650 mg
烟酸50 mg
肌醇10 g用水定容IOOmL6)铁盐 QOO X)FeSO4. 7H205. 56gNa2EDTA. 2H20 7. 46g7)AA 大量 QOOΧ)
MgS04.7H205 g
CaCl2-2H203 g
NaH2PO43 g
KCl60 g8) AA 微量(1000X)MnSO4-H2O10.0 g
ZnS04-7H202.0 g
H3BO33 .0 g
KI0.75 g
NaMoO4-H2O0.250 g
CuSO4-5H200.025 g
CoC12-6H200.025 g用水定容IL9) 2,4-D 储存液 Qmg/ml)称取2，4-D lOOmg，溶于Iml DMSO，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0. 5N NaOH, 至完全溶解，于-20°C保存。10) Kinetin 储存液(0. 2mg/ml)称取Kinetin 10mg，溶于Iml IN K0H，加蒸馏水定溶至50ml，于4°C保存。11) NAA 储存液(0. 2mg/ml)称取NAA 10mg，溶于0.5ml IN K0H，加蒸馏水定溶至50ml，于4°C保存。12)乙酰丁香酮(100mg/ml)称取乙酰丁香酮lOOmg，溶于Iml DMS0，于_20°C保存。13)卡那霉素(50mg/ml)称取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0. 22 μ m 滤器过滤除菌，于_20°C保存。实施例3 检测转基因水稻植株和野生型水稻中OsSRKl基因的转录本水平以水稻野生型日本晴品种和3个独立的T3代转基因水稻植株为材料，提取四叶期水稻叶片的RNA，利用RT-PCR检测水稻叶片中OsSRKl基因的转录本水平。具体方法如下 采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从上述材料收集0. 03g水稻叶片提取总RNA，利用反转录酶 superscript II(Invitrogen)将其反转录成cDNA，具体步骤如实施例1的描述。用OsSRKl 基因的特异性上游引物 0sSRKlF2(5，-GTT CCA GCA TTT GGT CGC GTC_3，，SEQ ID NO :5)， 和下游引物 0sSRKlR2(5，-CGT CTT AGA GTT CGT GCT GC_3，，SEQ ID NO :6)。同时用水稻 OsUBQ 基因的特异上游引物 OsUBQ F (5，-ATC ACG CTG GAG GTG GAG T-3，，SEQ ID NO 7) 和特异下游引物 OsUBQ R(5，-AGG CCT TCT GGT TGT AGA CG-3，，SEQID NO 8)进行 PCR 扩增，作为内参基因。PCR反应条件是94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，55°C退火30秒， 72°C延伸lmin，Mf循环。然后用1.5%琼脂糖电泳检测PCR产物。结果表明，野生型植株中OsSRKl基因转录本水平明显低于3个转基因株系#1、#2和#8，从而证明OsSRKl基因已整合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达(图2)。实施例4 转OsSRKl基因水稻苗期叶片长度和宽度均提高本实施例分析了转基因水稻植株和野生型水稻植株叶片的长度和宽度。具体步骤如下将转基因植株和野生型植株的种子用70%乙醇表面消毒1分钟；5% (活性氯含量)NaaO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于含有0. 4%的琼脂培养基的玻璃培养瓶。在光照培养箱14小时光照，23°C 10小时黑暗)生长3天后，挑选生长一致的幼苗转移至土中，在温室中培养(自然条件)至四叶期，分别测定第二叶和第三叶的长度和宽度，以非转基因野生型植株相同叶位叶片的长度和宽度作为100%，转OsSRKl基因植株的叶片长度和宽度均提高了 20^-40% (图3和图4)。这些结果表明，转OsSRKl基因植株苗期叶片长度和宽度均高于野生型。实施例5 转OsSRKl基因植株水稻抽穗期旗叶长度和宽度提高本实施例分析了转基因植株和野生型植株旗叶叶片的长度和宽度。具体步骤如下转基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分钟；5% (活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次，在暗条件下萌发3天。随后转移到土壤中生长至三叶期，移栽至大田中培养至抽穗期。测定转基因植株和非转基因野生型植株旗叶宽度和长度，分别以非转基因野生型植株旗叶叶片的宽度和长度作为100%，转OsSRKl基因植株的旗叶的宽度提高了 15-23%，长度提高了 7-18% (图5)。这个结果表明，转OsSRKl基因植株旗叶叶片宽度和长度均高于野生型。实施例6 转OsSRKl基因植株表皮细胞变大本实施例分析了温室中生长的T3代转基因水稻植株和野生型水稻植株完全展开的第三叶叶片和旗叶的表皮细胞大小。具体步骤如下将转基因植株和野生型植株的种子用70%乙醇表面消毒1分钟；5% (活性氯含量)Naao溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗 4-5次；播种于含有0.4%的琼脂培养基的玻璃培养瓶。在光照培养箱14小时光照， 230C 10小时黑暗)生长3天后，挑选生长一致的幼苗转移至土中，在温室中培养(自然条件)至四叶期，早上10点选取野生型和转基因水稻植株上的完整展开的第三片叶的中段位置，其中选取3个转基因株系，每个株系分别选择5个植株进行重复。同时对大田中生长至抽穗期(具体步骤同实施例幻的野生型和转基因水稻植株旗叶叶片的中段位置进行取材， 其中选取3个转基因株系，每个株系分别选择5个植株进行重复。将要观察的叶片置于乙醇乙酸溶液(体积比为9 1)中固定Mh以上，用蒸馏冲洗2-3次，再置于水合氯醛溶液(甘油水合氯醛蒸馏水=1:8:1)中浸泡，然后移到载玻片上，覆以盖玻片。采用Nikon TE 2000-E光学显微镜，在10 X 40倍下观察，并使用软件NIS-Elements F 3. O拍照，每张片子观察10个视野。统计每个视野内所观察到的表皮细胞的列数，结果表明，各转基因株系第三叶叶片每个视野中的细胞列数约为21 22列，而野生型每个视野中细胞列数则约为25列(图6)。相似地，各转基因株系旗叶叶片每个视野中的细胞列数较野生型旗叶叶片少2-3列。据此推测转OsSRKl基因水稻叶片表皮细胞大于野生型。这些结果表明 OsSRKl在转基因水稻中过量表达能够促进表皮细胞的扩大，这可能是导致叶片变宽的原因之一。


本发明公开了基因OsSRK1在控制水稻叶片长度和宽度中的应用。本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsSRK1基因的全长编码区，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻品种日本晴中，提高OsSRK1基因的表达，得到OsSRK1基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，转基因水稻阳性植株的叶片长度和宽度明显高于非转基因植株。为培育叶面积提高的水稻品种提供了新的思路，也为其它作物利用异源基因技术提高叶面积提供了理论支持。